Нейротрофические и ростовые факторы. 
Интерлейкины

Нейротрофические и ростовые факторы. Логично начать этот раздел с изложения данных, посвященных группе сосудистых эндотелиальных ростовых факторов (VEGF). Ряд данных свидетельствует о том, что основная функция этих биорегуляторов связана с селективным воздействием на сосудистый эндотелий и периваскулярные клетки. Исследования, выполненные с мутантными мышами и полученными рекомбинантным способом белками, подтвердили, что VEGF не только опосредует пролиферацию эндотелиальных клеток, но также регулирует сосудистую дифференцировку, регрессию и проницаемость. При острой церебральной ишемии в микрососудах мозга нарушается проницаемость и стабильная функция гемато-энцефалического барьера. Через несколько дней после ишемического инсульта выявляются пролиферативные явления в эндотелиальных клетках, стимулируется ангиогенез. Исследования подтверждают ключевую роль VEGF в этих процессах, которая реализуется комплексным и согласованным действием. При этом каждый из компонентов семейства VEGF обнаруживает при церебральной ишемии свою уникальную функцию как в начальный период сосудистой дестабилизации, так и на последующих этапах ангиогенеза. Эти обобщения, а также информация о роли VEGF в регуляции гемато-энцефалического барьера при ишемии мозга представлены в обзорах Croll et al. (2001); Zhang, Chopp (2002).

Терапевтическое использование рекомбинантных препаратов VEGF направлено на стимуляцию коллатеральной микроциркуляции и, соответственно, церебральной реваскуляризации. Инфузия rVEGF (165) в латеральный желудочек мозга крыс в течение 7 дней увеличивала плотность микрососудов при минимальном проявлении отечных признаков; явления вентрикуломегалии также отсутствовали (Harrigan et al, 2002). Исследование соотношения VEGF и NO-синтаз при церебральной ишемии, вызванной артериальной окклюзией у крыс, выявило, что экспрессия VEGF была выражена в течение 7 дней в цитоплазме и в мембране краевой повреждению зоне вместе с активированной eNOS. Экспрессия нейрональной синтазы (nNOS), имевшая пик через 24−48 часов, исчезала на 3-и сутки (Leker et al, 2001).

Нейротрофический фактор мозга (BDNF) широко представлен в структурах ЦНС. Его мРНК идентифицирована в гиппокампе, амигдале, таламусе, пирамидных клетках неокортекса и в мозжечке. BDNF контролирует баланс глутаматергической и ГАМК-ергической систем.

Изменения уровня BDNF в различных частях переднего мозга после окклюзии средней артерии показали значительные вариации. Содержание фактора в гиппокампе и фронтальной коре ишемизированной стороны мозга было выше в сравнении с контралатеральной областью (Zhao et al, 2001). Определение уровня BDNF мРНК при умеренной (олигомической) ишемии мозга в отсутствие очевидных признаков нейронального нарушения показало его значительную (более 80%) экспрессию в гранулярных клетках гиппокампа уже через 6 часов окклюзии. Сниженный на 70% церебральный кровоток сохранялся таковым в течение целой недели. В последующие 1−14 суток уровень BDNF мРНК оставался на контрольном уровне (Schmidt-Kastner et al, 2001).

Эти данные указывают на вероятное участие BDNF в ишемической патологии мозга, однако его конкретизация и специфичность остаются неизученными. Нейропротективное действие BDNF было выявлено с помощью конъюгированной формы BDNF с моноклональными антителами рецептора трансферрина. В этой форме BDNF, введенный внутривенно, проникал через ГЭБ и оказывал защитное действие на ишемизированный мозг крысы. Эффект выражался в существенном (до 70%) снижении объема кортикального инсульта при наблюдении от 24 часов до 7 суток. Эти позитивные явления не относились к субкортикальным клеткам ишемизированного мозга (Zhang & Pardridge, 2001).

Структурный «родственник» BDNF — нейротрофин-3 (NT-3), на три четверти совпадающий с ним по структуре, а также с Фактором роста нервов (NGF), имеет отношение к развитию мозга, участвует в регуляции функций допамини адренергических структур мезэнцефалона и участвует в репарации поврежденных нервных клеток. 10-минутная ишемия переднего мозга вызывала снижение уровня NT-3 мРНК в гиппокампе. Кислородная гипербарическая терапия приводила не только к снижению ишемических нарушений структур мозга, но и к увеличению уровня NT-3 мРНК (Yang, Chang, Lee et al, 2001).

Получены также данные противоположного значения. У мутантных мышей с генетически обусловленным дефицитом нейротрофина-3 (однако сохранявших способность к экспрессии BDNF, рецептора NT-3, тирозинкиназы C и низкоаффинного рецептора нейротрофина p75NTR), окклюзионная ишемия вызывала значительно меньшие поражения структур мозга (данные через 23 часа). Добавление NT-3 к первичной культуре клеток коры, подверженных кислородно/глюкозной депривации, усиливало признаки нейрональной смерти и образование свободных радикалов. Вероятно, потенцирующее ишемию действие NT-3 связано с его включением в каскад апоптических реакций (Bates et al, 2002).

Инсулиноподобные ростовые факторы (IGF's) имеют широкое представительство и разнообразный спектр контролируемых процессов в организме. Ряд данных свидетельствует о протективном действии IGF-I при церебральной ишемии. Интрацистернальное, интраназальное введение препарата или локальная аппликация приводили к существенному уменьшению ишемических повреждений мозга крыс, вызываемых окклюзией церебральной артерии (Liu et al, 2001; Schabitz et al, 2001). Эффект наблюдался в первые сутки после предварительного введения IGF-I. Иммуногистохимическое исследование подтвердило, что терапия Фактором снижала также содержание каспазы-3 в поврежденной зоне, но не влияла на уровень белка теплового шока 72-kDa (Wang et al, 2001). Поскольку IGF-I плохо проходит через гемато-энцефалический барьер, рекомендовано его применение в виде интраназальной апликации, более удобной для клинической терапии ишемического инсульта (Liu et al, 2001).

Трансформирующий ростовой фактор (TGF-alpha) имеет также широкое распространение в тканях организма. В структурах ЦНС идентифицирована TGF-alpha мРНК на всех стадиях развития мозга. Исследования на бабуинах показали, что кратковременная ишемия (окклюзия церебральной артерии) приводила к экспрессии TGF-alpha мРНК в тех регионах мозга, где отмечалось снижение кислородного метаболизма. Гистологические исследования подтвердили, что наибольшая экспрессия TGF-alpha отмечена в зоне, пограничной инфаркту, и соответствует индексу сохраненных зон мозга. В этой связи авторами формулируется вопрос о TGF-alpha как «эндогенном маркере неврологического стресса» (Ali et al, 2001).

Внутрижелудочковое введение TGF-alpha крысам, подверженным окклюзионной ишемии мозга, значительно снижало поражения структур, которые более выражены в коре, нежели в стриатуме. В равной степени эффективной была аппликация TGF-alpha как до, так и через 30 минут после воспроизведения ишемической процедуры, и протективный эффект сохранялся до 4-х суток наблюдения. Существенно, что, в отличие от ранее описываемого сосудистого эндотелиального фактора (VEGF), TGF-alpha не влиял на микроциркуляцию сосудов коры и тонусную реактивность артерий мозга (Justicia et al, 2001). В другом исследовании (Zhu, Culmsee et al, 2001) введение крысам кленбутерола, агониста бета (2)-адренорецепторов, на фоне цереброваскулярной ишемии приводило к экспрессии TGF-beta1 в СА1 пирамидных нейронах. Увеличение уровня TGF-beta1, начинавшееся к 3-му часу ишемии, сохранялось в течение 2 суток.

В большом семействе факторов роста фибробластов (FGF), насчитывающем более 20 разновидностей, наиболее изученными представляются основной (basic) FGF и FGF-alpha. Оба фактора выполняют важные функции в нейрональных структурах (гипо-таламус, сетчатка глаз и др.), в секретирующих органах (гипофиз, тимус, кора надпочечников), обладают хемотаксической активностью и стимулируют рост новых капилляров in vivo и in vitro. bFGF приписывается важная роль в репарации нервных клеток после травмы мозга. В экспериментах на культуре клеток РС12 было установлено, что механизм нейропротективной активности bFGF связан с экспрессией трансдукторного фактора Ras-фосфатидилинозитол 3-киназы, максимально выраженной в первые сутки (Kawamata et al, 2001). Окклюзионная ишемия мышей приводила к инфаркту мозга, неврологическому дефициту, а также к быстрой экспрессии активности каспазы-3 в ишемизированной области. Icv введение bFGF (>10 нг, в течение 30 минут после окклюзии), помимо улучшения показателей ишемического повреждения мозга, снижало потенцированую ишемией активацию каспазы-3. Совместное введение подпороговых концентраций bFGF и ингибиторов каспаз (z-VAD.FMK или z-DEVD.FMK) еще более уменьшало размеры инфаркта и величины неврологического дефицита. По мнению авторов, эффективное использование очень низких доз bFGF и ингибиторов каспаз открывает возможности новых терапевтических приемов лечения ишемического инсульта (Ma et al, 2001).

Изучение другого фактора этого семейства — FGF-alpha, исследованное в эпендиме и хороидном сплетении желудочков мозга, выявило значительные изменения уровня Фактора в условиях глобальной ишемии переднего мозга крыс. Одновременно менялась цитогистологическая картина этих зон. Icv инфузия FGF-alpha (осмотический насос) приводила к сохранению уровня Фактора в эпендиме и хороидном сплетении. Постулируется идея, что эти ткани мозга играют ведущую роль в синтезе ростовых факторов, включая FGF-alpha, и их секреции в цереброспинальную жидкость (Hayamizu et al, 2001).

Нейропротективный механизм Нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF) осуществляется за счет модуляции активности NMDA рецепторов (Nicole et al, 2001). В экспериментах на молодых и возрастных крысах показано, что GDNF препятствует гибели нигральных допаминовых нейронов, вызываемой 6-гидрокситриптамином (Fox et al, 2001). У крыс с окклюзионной ишемией мозга выявлялись повреждения, преимущественно локализованные в стриатуме, а также в теменной коре. Исследования обнаружили одновременное увеличение уровня GDNF мРНК в слое гранулярных клеток зубчатого ядра (Arvidsson et al, 2001). На мышах с генетическим дефицитом глиального фибриллярного кислого белка (GRAF) ишемия мозга приводила к более выраженной в сравнении с контрольными животными депрессии электрофизиологических реакций нейронов гиппокампа. Гистологический анализ выявил существенные изменения в структурах СА1 и СА3 пирамидных клеток у GRAF-нокаутных мышей (Tanaka et al, 2002).

Наконец, представлена информация относительно Фактора роста гепатоцитов (Hepatocyte growth factor, HGF), который в эксперименте с цереброваскулярной ишемией предупреждал развитие апоптоза в нервных клетках. Интравентрикулярное введение рекомбинантного препарата HGF предотвращало смерть нейронов за счет влияния на уровень проапоптического белка Bcl-2. HGF также стимулировал ангиогенез в структурах мозга (Tsuzuki et al, 2001).

Кратко суммируя приведенные данные, следует характеризовать участие цитокинов и нейротрофических факторов как весьма еще далекое от полного понимания их роли. Можно полагать, что применительно к ишемической патологии мозга, нейротрофические факторы или оказываются вовлеченными неспецифично (как отголосок общей картины ишемического «шторма» в структурах мозга) или — например, для VEGF — отражают его основную функцию как регулятора сосудисто-эндотелиального гомеостаза. Следует также констатировать, что, согласно приведенной информации, эти регуляторы могут играть роль протективных факторов, или, наоборот, соучастников картины патогенеза.

Интерлейкины. Ишемические и реперфузионные нарушения мозга сопровождаются развитием воспалительных реакций поврежденной ткани и изменениями микроглии и активности лейкоцитов. Цитокины, осуществляющие регуляцию провоспалительных процессов, активируют хемотаксис и «организуют» репарацию поврежденной ткани. Имеется значительная информация о том, что цитокины активно участвуют в начальной стадии постишемических изменений мозга.

В клинических исследованиях была установлена увеличенная продукция цитокинов (типа IL- 1, IL-6 и TNF), способствующих инфильтрации лейкоцитов в первые часы после возникновения ишемического инсульта. Выявлена положительная корреляция между изменением уровня интерлейкина-6 (IL-6) в плазме крови и функциональной динамикой состояния пациентов (см. обзор Clark, Lutser, 2001). Увеличение IL-8 в крови больных на 1-, 3-, 7-е сутки ишемического инсульта соотносилось с изменениями других биохимических показателей (неоптерина, ионов супероксида, гена транскрипции тканевого фактора и прокоагулянтной активности). У большинства пациентов повышенное содержания IL-8 сохранялось в течение этих семи дней, тогда как другие показатели обнаруживали разнородную динамику. Очевидно активность цитокина не сопряжена с экспрессией противосвертывающей системы крови и скорее влияет на активацию полиморфоядерных лейкоцитов на ранних этапах патогенеза ишемического инсульта (Grau et al, 2001). У пациентов, перенесших кардиоэмболический инсульт, установлена корреляция между увеличением уровня IL-6 и активностью матриксных металлопротеиназ в первые 48 часов заболевания (Montaner et al, 2001). Изменения уровня цитокинов и С-реактивного белка выявлены в цереброспинальной жидкости у больных в острый период ишемического инсульта. На этом основании предложены иммунологические критерии прогноза развития инсульта и возможности восстановления нарушенных неврологических функций (Скворцова и др, 1999).

Экспериментальные исследования позволяют проанализировать клеточные и молекулярные механизмы активности цитокинов при ишемических нарушениях непосредственно в ткани мозга. В экспериментах на крысах, подверженных окклюзионному воздействию с последующей реперфузией, обнаружена увеличенная экспрессия IL-8 и TNF-alpha в ишемизированных регионах. Ингибитор цитокинов широкого спектра (препарат NR58−3.14.3) снижал число инфильтрированных гранулоцитов и макрофагов в прилежащих областях, однако не влиял на их количество в непосредственно ишемизированной зоне (Beech et al, 2001).

На мышах с нокаутным дефектом IL-1 выявлены значительно меньшие размеры ишемического инфаркта мозга в сравнении с контрольными животными. Интрацеребральная инъекция антагониста рецептора IL-1 также уменьшала размеры повреждения как у контрольных, так и у IL-1 нокаутных мышей. Констатируя несомненное участие IL-1 в патогенезе окклюзионной ишемии мозга, авторы подчеркивают различия вклада этого цитокина и его изоформы IL-1alpha (Boutin et al, 2001). В работе Touzani et al. (2002) было установлено, что блокатор рецепторов IL- 1beta существенно снижал объем ишемического повреждения мозга мышей после окклюзии средней церебральной артерии, тогда как icv инъекция этого цитокина вдвое увеличивала повреждение. Однако у трансгенных животных с дефицитом рецептора IL-1beta ишемические нарушения в мозге не отличались от контрольных. Делая вывод о том, что IL-1beta, очевидно, способствует ухудшению патогенеза постишемических повреждений, авторы не связывают это влияние с функцией рецептора цитокина. В другом исследовании (Togashi et al, 2001) рассмотрена связь между активностью IL-1beta и NO при ишемическом повреждении мозга крыс. Интрацистернальное введение антагониста IL-1beta нивелировало ухудшение электрофизиологических показателей поврежденных синапсов зубчатой извилины и снижало синтез NO в ишемизированной ткани мозга. Центральная аппликация IL-1beta имитировала ишемические изменения синаптической активности клеток dentate gyrus и увеличенную продукцию NO в гиппокампе у контрольных, неишемизированных мышей.

Сравнительные исследования интерлейкина-18 (IL-18), структурно сходного с IL-1beta, выявили значительную разницу их участия в церебральной ишемической патологии. На моделях окклюзионной или фототромботической ишемии у крыс обнаружена «отставленная» экспрессия мРНК IL-18 (через 48 часов после начала ишемии), достигавшая пика в период 7−14 суток. Экспрессия IL-1beta, напротив, достигала максимума через 16 часов, постепенно снижаясь в последующие сроки. Существенно, что параллельно увеличению уровня IL-18 (но не IL-1beta!) шла экспрессия мРНК каспазы-1. Иммуноцитохимический анализ показал преимущественную локализацию IL-18 в ED1-некротических зонах с инфильтрованными в микроглии фагоцитами в период 3−6 дней ишемии. Локализация IL-1beta была выражена в разветвленной микроглии пограничной инфаркту зоне и в ипсилатеральном кортексе в первые 16 часов ишемического поражения. Данное исследование существенно в акцентировании функций различных цитокинов в мозге, а также впервые конкретизируемой связи IL-18 с апоптическим процессом деструктивных нарушений мозга (Jander et al, 2002).

Важные результаты были получены на клеточных моделях. На культуре срезов гиппокампа исследовано влияние различных концентраций интерлейкина. IL-1beta в низких концентрациях потенцировал вызванную гипоксией нейродегенерацию, тогда как высокие дозы не имели такого эффекта. Наоборот, эти высокие дозы обладали нейропротективным действием на комбинированной модели NMDA-нейротоксичности и кислородно/глюкозной депривации. Оба эффекта, и нейротоксический, и протективный блокировались антагонистами рецепторов IL-1beta (Pringle et al, 2001). Данные свидетельствуют о сложной парадигме проили антиишемических эффектов цитокинов, зависящих, в частности, от типа вещества и от уровня его экспрессии (т.е. действующей концентрации).

Логически с этой работой связаны эксперименты, проведенные с IL-1 на культуре нейронов стриатума. Аппликация интерлейкина приводила к быстрой активации фосфорилирования р38 МАРкиназы. Ингибитор рецепторов IL-1 блокировал этот эффект. Одновременно IL-1 дозозависимо активировал транслокацию транскрипционного фактора NF-kB. Иммунохимический анализ установил, что стимуляция как фосфорилирования р38, так и транслокации NF-kB имеют место только в астроцитах. Поскольку ингибитор р38 МАP-киназы (SB203580) не влиял ни на эффекты IL-1, ни на транслокацию NF-kB, именно цитокину принадлежит ведущая роль в регуляции сигнальных процессов с участием перечисленных факторов (Dunn et al, 2002).