Определение гемоглобина в крови

Гемоглобин — основной дыхательный белок крови и главный компонент эритроцитов. Гемоглобин играет ключевую роль в системе дыхания организма человека: он осуществляет перенос кислорода из легких в ткани организма и углекислого газа из тканей в легкие.

Гемоглобин — это красный пигмент крови человека и животных. Подсчитано, что в одном эритроците содержится в среднем около 340 млн молекул гемоглобина. По своей химической структуре он представляет собой сложный белок, относящийся к гемопротеинам. В состав молекулы гемоглобина входят четыре субъеденицы, каждая из которых состоит из белковой части — глобина и небелковой части — гема. Молекула гема состоит из сложного гетероциклического соединения порфирина IХ, в центре которого находится двухвалентный атом железа, связанный с молекулой порфирина через атомы азота двумя валентными и двумя координационными связями. Степень окисления железа не изменяется ни при отдаче, ни при присоединении атома кислорода.

Рис. 1. Строение молекулы гемоглобина

Гемоглобины представляют собой тетрамерные белки, молекулы которых образованы различными типами полипептидных цепей, обозначаемых как б, в, г, д. В состав молекулы гемоглобина входят по 2 полипептидные цепи двух разных типов, каждая из которых связана с гемом.

У человека обнаружены гемоглобины различных типов, которые отличаются по химическому строению. В крови взрослого человека содержится гемоглобин А (HbA), состоящий из б₂в₂ цепей. В дополнение к основному типу гемоглобина HbA, в крови взрослого человека обнаружен гемоглобин A₂ (HbA₂). Также существует фетальный гемоглобин F (HbF), который называют гемоглобином новорожденных. В крови новорожденного ребёнка на долю фетального гемоглобина приходится около 80%. К концу первого года жизни ребёнка фетальный гемоглобин почти целиком замещается на гемоглобин А. Фетальный гемоглобин состоит из полипептидных цепей б₂г₂ и отличается от гемоглобина, А вторичной, третичной и четвертичной структурами.

Наличие атома железа в составе гема придаёт молекуле гемоглобина характерную красную окраску. Присоединение к гему различных химических групп сопровождается изменением окраски, на чём и основаны колориметрические методы определение концентрации гемоглобина в крови.

Для стандартных лабораторных исследований концентрации общего гемоглобина в крови наиболее приемлемы колориметрические методы определения, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Также используются химические и спектрофотометрические методы определения, они имеют высокую точность, но в тоже время и более высокую сложность выполнения и стоимость анализа по сравнению с колориметрическими методами.

Наиболее старым методом определения содержания гемоглобина считается метод Сали — реакция гемоглобина с соляной кислотой с образованием солянокислого гематина. Метод основан на визуальном определении содержания гемоглобина путем сравнения окраски исследуемой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. Погрешность метода является достаточно большой, около 30%, на результаты определения влияют многие факторы: время реакции между гемоглобином и соляной кислотой, белковый состав крови, концентрация билирубина в крови.

В крови человека гемоглобин находится в основном в виде оксигемоглобина и восстановленного гемоглобина и в небольшом количестве — метгемоглобина, карбоксигемоглобина и вердоглобина. Каждая из упомянутых форм имеет свой световой спектр поглощения. При использовании колориметрических методов определения гемоглобина возникает проблема в выборе такого химического реагента, который бы превращал все виды гемоглобина только в один продукт реакции с единым спектром поглощения.

Колориметрическими методами, которые при фотометрическом определении имеют наименьшую ошибку и позволяют количественно перевести разные виды гемоглобина в одну форму, являются гемиглобинцианидный, гемихромный и гемиглобиназидный методы. В настоящее время в большинстве стран в качестве стандартного, как наиболее точный и надежный, признан гемиглобинцианидный метод определения концентрации гемоглобина.

Гемиглобинцианидный метод разработан в 1936 г Драбкиным и был одобрен Международным Комитетом по стандартизации в гематологии (ICSH) в 1963 г. Принцип данного метода основан на переводе всех видов гемоглобина в одну форму — гемиглобинцианид.

В ходе анализа образец крови помещают в трансформирующий раствор, который содержит феррицианид калия (железосинеродистый калий), цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия выполняет роль буфера, стабилизирующего значение рН раствора, при котором реакция проходит в течении нескольких минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и поддерживает белки плазмы крови в растворённом состоянии, что предотвращает помутнение раствора. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин (гемиглобин), который при взаимодействии с анионами цианида образует гемиглобинцианид. Комплекс гемиглобинцианида окрашен в красный цвет, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Существуют некоторые модификации состава трансформирующего реагента, в которых цианид калия заменяется на ацетонциангидрин, дигидрофосфат калия — на гидрокарбонат натрия, детергент отсутствует совсем.

Для гарантии точности метода применяют калибровочные растворы с точно установленной концентрацией гемоглобина. Калибровочные растворы гемоглобина — это высокоочищенные заменители крови человека, не содержащие примесей, искажающих результаты анализа. Существуют наборы контрольных растворов гемоглобина с различной концентрацией. Калибровочные растворы гемиглобинцианида получают, как правило, путем введения контрольного раствора в трансформирующий раствор. По данным измерения оптической плотности полученных растворов строят калибровочный график и проводят калибровку измерительного прибора.

Гемихромный метод является более современным методом определения гемоглобина, он отличается от гемиглобинцианидного метода отсутствием цианистых соединений в составе рабочего реагента и заменой их на более безопасные соединения. Гемихромный метод определения гемоглобина в крови разработан Ахрем А. А. с соавторами в 1986 г. Набор реагентов для определения гемоглобина в крови, основанный на данном методе, одобрен Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ и рекомендован к применению в клинико-диагностических лабораториях уже в 1998 г. гемоглобин кровь белок эритроцит Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в гемихром. В ходе анализа образец крови добавляют в трансформирующий раствор, который содержит жирные кислоты с феррицианидом калия или детергент додецилсульфат натрия (SDS), при этом происходит превращение гемоглобина в окисленную низкоспиновую форму — гемихром, имеющую красноватый цвет. Интенсивность окраски гемихрома прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе крови.

В перечисленных методах содержание гемоглобина в крови определяют путём измерения оптической плотности полученного раствора с помощью фотоколориметра при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр), а расчет концентрации производят по калибровочному графику.

В качестве аналитического оборудования используются фотометры со светофильтрами, спектрофотометры, фотоэлектрические гемоглобинометры, автоматические лабораторные анализаторы. Гемоглобинометры представляют собой полуавтоматические цифровые лабораторные анализаторы, в которых после измерения оптического поглощения анализируемого раствора на дисплее сразу выдается концентрация гемоглобина в граммах на литр крови.

При определении общего гемоглобина в крови материалом для исследования является свободнотекущая капиллярная или венозная кровь; в качестве антикоагулянтов добавляются ЭДТА, гепарин, оксалат аммония или оксалат калия. Нормальные значения концентрации общего гемоглобина составляют у мужчин 130−160 г/л; у женщин; 120−140 г/л.

Помимо определения концентрации общего гемоглобина в крови, существует необходимость определения малых количеств свободного гемоглобина в образцах плазмы капиллярной крови, сыворотки венозной крови, промывных жидкостях при проведении хирургических операций. Целью определения концентрации свободного гемоглобина является:

• · количественная оценка внутрисосудистого гемолиза, который может приводить к развитию серьёзных заболеваний;
• · оценка уровня гемолиза в донорской крови и ее компонентах;
• · определение изменения уровня плазменного гемоглобина после воздействия различных факторов на организм человека;
• · измерение уровня гемоглобина в ирригационных растворах при хирургических процедурах и операциях для определения уровня кровопотери.

Для определения свободного гемоглобина широкое применение нашел бензидиновый метод, который основан на окислении бензидина свободным гемоглобином в присутствии перекиси водорода.

В ходе анализа проба сыворотки крови вносится в раствор, который содержит бензидин, перекись водорода и ацетатный буфер для поддержания требуемого уровня рН. Измеряют показатель оптической плотности раствора на спектрофотометре при длине волны 600 нм. Раствор инкубируют в течение определённого времени при постоянной температуре. Далее проводят измерения повторно и по изменению величины оптической плотности вычисляют содержание свободного гемоглобина. Содержание свободного гемоглобина в сыворотке крови здоровых людей варьирует в пределах от 0,017 до 0,045 г/л.

На сегодняшний день при определении концентрации свободного гемоглобина используются более современные методы анализа, такие как метод сканирующей и термолинзовой спектрофотометрии. В клинической лабораторной практике применяются специализированные лабораторные анализаторы, которые позволяют измерять низкий уровень гемоглобина. Данные способы исследования высокотехнологичны, менее трудоёмки, обладают высокой точностью.