Анализ динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Для изучения динамики внутриклеточных HSP70 в нейтрофилах под действием ТШ уровень HSP70 определяли методом проточной цитометрии в интактных клетках и сразу после тепловой обработки, затем анализировали изменение этого уровня через каждый час до 7 ч., а также в более поздние сроки (15−17 ч после окончания ТШ).

Как правило, сразу после проведения ТШ в нейтрофилах определяли значительное возрастание уровня внутриклеточных HSP70 по сравнению с исходным уровнем. В течение 15−30 мин после завершения термического воздействия наблюдали фазу снижения этого уровня (типичные кривые динамики представлены на Рис. 4А.

Необходимо было учитывать, что стресс-индуцированное увеличение внутриклеточного количества белков HSP70 происходит с учетом периода восстановления клеток, длительность которого может варьировать от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от типа и условий обработки клеток [Eid et al., 1987; Wang et al., 2003; Polla et al., 1995; Schneider et al., 2002]. В используемой нами модели клеточного стресса с помощью метода проточной цитометрии не удалось выявить значительного увеличения внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах в промежуток времени 1−7 ч после нагревания, а также через 15 ч после ТШ (Рис. 4Б).

Методами проточной цитометрии (Рис. 4В) и Вестерн-блоттинга (Рис. 4Г) ярко выраженного накопления индуцируемого Hsp70 с использованием специфических антител, в промежутке времени 1−7 ч после нагревания в нейтрофилах обнаружено тоже не было.

Аналогичные эксперименты были проведены при температурном режиме 40 °C, 40 мин. Как и ожидалось, в отсутствие индукции накопления мРНК для Hsp70 и Hsc70, при ТШ 40 °C, 40 мин, не удалось выявить увеличения внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах в течение 4.5 ч после термообработки и через 15ч.

А Б.

• 50
• 40
• 10
• 9
• 8
• 7

Рис. 4. Динамика внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах в ответ на ТШ (43°C, 10 мин), оцененная методами проточной цитометрии и Вестерн-блоттинга. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток проводили с помощью антител BRM-22 (А, Б) и антител С92F3A-5, распознающих только Hsp70 (В). А. Измерение уровня HSP70 проводили до ТШ (точка 0 мин), сразу после окончания ТШ (точка 10 мин), а также через 15,30 и 60 мин после окончания ТШ. Представлены результаты независимых экспериментов с нейтрофилами, полученными от четырех разных доноров в возрасте от 25 до 91 года, выбранных случайным образом. Б. Измерение уровня HSP70 проводили до ТШ, сразу после окончания ТШ и каждый час в течение 7 ч, а также через 15 ч с момента окончания ТШ. Представлены данные от двух независимых экспериментов. В. Измерение уровня Hsp70 до ТШ и каждый час после окончания ТШ в течение 7 ч, где 1 и 2 — доноры. Г. Анализ методом Вестерн-блоттинга внутриклеточного содержания Hsp70; в качестве референсного белка использовали в-актин. Здесь и далее разброс данных рассчитывали в виде ошибки среднего.