Комбинированное применение нетрансдуцирующих бактериофагов с пробиотиком в пост-отъёмном периоде у поросят

Одним из наиболее безопасных и недорогих методов повышения качества мясного сырья является применение в кормлении сельскохозяйственных животных пробиотиков — живых микроорганизмов и кормовых добавок на их основе, оказывающих благоприятные эффекты на организм животного-хозяина, путём коррекции его нормофлоры. Общепризнанным на мировом уровне является определение пробиотиков, принятое такими международными структурами как FAO (Food and Agriculture Organization, Организация по продовольствию и сельскому хозяйству при ООН) и WHO (World Health Organization, Всемирная организация здравоохранения, ВОЗ) в октябре 2001 г.; с этого времени «пробиотики» определяются как «живые микроорганизмы, которые при применении в адекватном количестве приносят пользу здоровью хозяина».

Интерес учёных и специалистов прикладных отраслей хозяйства к использованию микроорганизмов-пробиотиков особенно возрос в последние два десятилетия в связи с бурным развитием биотехнологии, в т. ч., и сельскохозяйственной. Одной из важнейших функций пробиотиков, используемых в практике, является защитная, реализующаяся как через повышение колонизационной резистентности пищеварительного тракта, так и через реализацию пробиотическими микроорганизмами антагонистического (в отношении облигатнои условно патогенных микроорганизмов) потенциала. Пробиотические микроорганизмы (традиционно — бактерии рода Lactobacillus, Bifidobacterium и Bacillus) находят широкое применение в качестве биопротекторов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний. Пробиотики рассматриваются как наиболее перспективные заменители антибиотиков в сельском хозяйстве.

В отличие от антибиотиков, они обладают рядом положительных характеристик:

• 1. не поражают нормофлору кишечника;
• 2. инертны в отношении эукариотических клеток животного (не оказывают токсического и сенсибилизирующего эффекта);
• 3. способны к саморазмножению с последующей самоэлиминацией.

Кроме того, немало значимым фактором является относительно небольшая цена производства пробиотических препаратов. Однако, несмотря на очевидные преимущества, существенным недостатком пробиотиков является их довольно умеренная антагонистическая активность, не позволяющая в полной мере развить их потенциал в условиях развившегося инфекционно-воспалительного процесса (тем более, вызванного облигатными патогенами). По способности препятствовать облигатным патогенам пробиотики уступают бактериофагам. Бактериофаги — вирусы бактерий, также способные к саморазмножению и инертные в отношении клеток-эукариот, что роднит их с традиционными (бактериальными) пробиотиками. Однако, в отношении патогенных бактерий-мишеней они отличаются узкой специфичностью и более высокой эффективностью действия.

Обратной стороной специфичности является необходимость подбора конкретного фага (фагов) для элиминации каждого отдельного патогена. Кроме того, препараты на основе бактериофагов обладают ещё несколькими недостатками, такими как:

• 1. возможность развития фагорезистентности;
• 2. относительно небольшая стабильность препаратов;
• 3. участие фагов в горизонтальном переносе генов.

Однако в настоящее время существуют достаточно эффективные способы решения перечисленных недостатков бактериофагов. Так, возникающая в процессе фагопрофилактики и фаготерапии «фагорезистентность» компенсируется чрезвычайным «эволюционным полиморфизмом» бактериофагов: в отношении каждого штамма бактерии-возбудителя инфекционного заболевания активно значительно большее количество бактериофагов. Проблема узкой направленности действия эффективных фагов решается сочетанным применением фагов с различным спектром специфичности, зачастую применяемых в рамках комплексных препаратов — «фаговых коктейлей» или «фаговых микстур». Ещё один недостаток фаговых препаратов — относительно меньшая стабильность получаемых препаратов — сейчас успешно решается с развитием методов биотехнологии, позволяющих стабилизировать хранение препарата и смягчить требования к условиям его применения. Что касается возможного участия бактериофагов в горизонтальном переносе генов, то способность фагов к реализации такого феномена (трансдукции) является в настоящее время одним из самых существенных ограничений фаготерапии. Речь идёт о способности определённых разновидностей фагов, не завершая цикла развития лизисом клетки-мишени, передавать (трансдуцировать) последней гены, приобретённые в процессе предыдущего цикла у другой бактерии, в том числе — генетические детерминанты антибиотикорезистентности.

В медицине важность определения трансдуцирующего потенциала фагов признана одним из критериев отбора эффективных и безопасных бактериофагов. В то же время, несмотря на интенсивный поиск новых средств терапии и профилактики инфекционных заболеваний, определение трансдуцирующего потенциала профилактических и терапевтических фагов в работах исследователей в области ветеринарии до последнего времени обойдена вниманием.

Поскольку в качестве модели изучения трансдукции традиционно использовался такой объект, как кишечная палочка, Escherichia coli, оптимальной моделью изучения применения нетрансдуцирующих фагов в сельском хозяйстве может служить именно эшерихиоз (колибактериоз), в особенности — эшерихиозы (колибактериозы) свиней. Комбинированное применение фагов с пробиотиками позволит, с одной стороны, создать более надёжный микроэкологический барьер на пути патогена, а с другой — обеспечить его более специфичную и эффективную элиминацию.

Представляется интересным изучение эффективности комбинированного (сочетанного) применения двух классов этих препаратов; тем более что до сих пор не проводилось исследование комбинированного применения пробиотиков, сконструированных на основе штаммов лактобакетрий, выделенных от животных местной популяции, и фагов, не обладающих трансдукционными свойствами.

Целью проведённых исследований было изучение эффективности комбинированного применения нетрансдуцирующих бактериофагов E. coli с пробиотиком для профилактики пост-отъёмной диареи поросят.

Новизна исследований заключалась в том, что впервые были получены данные по влиянию различных способов комбинированного применения нетрансдуцирующих бактериофагов E. coli (коли-фагов) с пробиотиками на коли-титр и титр коли-фагов поросят с пост-отъёмным синдромом.

Получение препаративных количеств нетрансдуцирующих фагов, отобранных из обширной рабочей коллекции в ходе предыдущих работ, реализовывали с помощью методов биотехнологии. После инкубации (каждый из отобранных фагов инкубировался изолированно) на культуре E. coli B, фаги были сконцентрированы методом центифугирования, в результате чего были получены опытные партии экспериментальных фаговых препаратов в виде взвеси фаговых частиц.

Титр фагов определяли методом агаровых слоёв контрольным высевом на культуру чувствительного штамма E. coli, измеряя его в количестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл взвеси. Концентрация фагов в полученных таким образом экспериментальных препаратах колебалась в пределах от 1,0Ч109 до 1,4Ч1010 БОЕ/мл.

В предыдущих опытах было установлено, что оптимальной схемой является их трёхкратное (с интервалом в три дня) применение per os в дозировке 1,0Ч1010 БОЕ на голову животным 28-дневного возраста.

Исследовали влияние микстуры отобранных фагов (№№ 6, 8, 9, 15), а также их комбинации с пробиотиком (кисломолочная закваска на основе штамма Lactobacillus paracasei, ранее выделенного от поросят этого возраста местной популяции) на показатели кишечного микробиоценоза (коли-титр и титр коли-фагов) свиней.

Параллельно с изучением эффективности традиционного (перорального) способа применения коли-бактериофагов (per os), проверялось предположение о системном эффекте исследуемых бактериофагов при их парентеральном пути введения. Препарат вводили утром, вскоре после кормления (900 — 1000) с помощью безыгольного инъектора интракутанно (внутрикожно) в область основания правого уха.

Для этого были сформированы 6 групп животных (по 18−20 голов в каждой группе), в возрасте 29−30 дней с клиникой пост-отъёмного синдрома. Животные 1-й и 3-й групп получали микстуры фагов №№ 6, 8, 9, 15 (в дозе, содержащей по 2,5Ч108 БОЕ на голову трёхкратно, с интервалом три дня) перорально; животные 2-й и 4-й групп получали микстуры фагов интракутанно в область основания правого уха; животные 3-й, 4-й и 5-й групп получали пробиотический препарат (2,0Ч1011 КОЕ на голову); животные 6-й группы (контрольной) получали только основной рацион (таблица 1).

Общий период наблюдения за животными составил 13 дней. В течение всего периода эффективность фагового препарата оценивалась по данным титра E. coli (коли-титра) и фагов E. coli (коли-фагов) в фекалиях поросят. Количество E. coli определяли посевами на среду Эндо и измеряли в колоние-образующих единицах (КОЕ), обнаруживающихся в 1 г пробы.

Таблица 1 — Схема опыта по изучению влияния микстуры отобранных фагов и применения их в комбинации с пробиотиком (n=20).

По результатам исследования влияния различных способов применения микстуры отобранных фагов (№№ 6, 8, 9, 15), а также их комбинации с пробиотиком, на коли-титр у поросят было установлено, что пероральное применение фаговой микстуры корректирует коли-титр животных в большей степени, чем интракутанное введение. Разница между показателями у животных 1-й (получавших фаги per os) и 2-й (получавших фаги внутрикожно) групп к 37-дневному возрасту составила 0,82 lg КОЕ/г (таблица 2).

Таблица 2 — Влияние микстуры отобранных фагов и применения их в комбинации с пробиотиком на коли-титр у поросят (n=20).

Примечание: даны средние показатели для групп поросят, каждая из которых состояла из двух гнёзд по 8−10 голов по данным 72 измерений (посевов).

Дополнительный приём пробиотика оказывал синергический эффект на коррекцию коли-титра при применении фаговых микстур обоими способами, однако более выражено — при пероральном применении. Так, комбинированное пероральное применение фагов и пробиотика (3-я группа) демонстрировало наибольшее среди всех групп снижение коли-титра к 37-дневному (5,43 lg КОЕ/г) и 40-дневному (5,85 lg КОЕ/г) возрасту. Примечательно, что изолированное применение пробиотика (5-я группа), оказывая положительное влияние на динамику содержания E. coli по сравнению с контролем, уступало по результатам снижения коли-титра комбинированному применению фагов и пробиотика (3-я группа), однако незначительно превосходило изолированное пероральное применение фагов (1-я группа) в возрасте 34-дней. К 40-дневному возрасту различия между показателями коли-титра 1-й и 5-й групп составляли менее 0,3 lg КОЕ/г.

Проведённое параллельно исследование содержание коли-фагов в кишечнике поросят показало, что изолированное внутрикожное применение фаговой микстуры практически не оказывает влияния на динамику коли-фагов в 37-дневном и 40-дневном возрасте (различия с контролем недостоверны). Пероральное применение фаговой микстуры, наоборот, в наибольшей степени способствовало восстановлению до-отъёмного уровня коли-фагов (5,38 lg БОЕ/г) по сравнению с контролем (3,78 lg БОЕ/г) (таблица 3).

Изолированное применение пробиотика (5-я группа) практически не корректировало падение титра коли-фагов, однако способствовало его положительной коррекции при применении фаговой микстуры; причём, при интракутанном применении (4-я группа) — в большей степени, чем при пероральном (3-я группа).

Таблица 3 — Влияние микстуры отобранных фагов и применения их в комбинации с пробиотиком на титр коли-фагов у поросят (n=20).

Примечание: даны средние показатели для групп поросят, каждая из которых состояла из двух гнёзд по 8−10 голов по данным 72 измерений (посевов).

Таким образом, установлено, что наибольшее влияние на коррекцию динамики содержания E. coli оказывает комбинированное пероральное применение фаговой микстуры и пробиотического препарата. Что касается динамики титра коли-фагов, то наибольшее влияние на его коррекцию оказывает не только комбинированное применение фаговой микстуры (причём как перорально, так и интракутанно) и пробиотического препарата, но и изолированное пероральное применение фаговой микстуры.

Выводы. пробиотик кормовой фагорезистентность.

• 1. Изолированное внутрикожное применение фаговой микстуры (содержащей, в т. ч., и эти фаги) практически не оказывает влияния на динамику коли-фагов в 37-дневном и 40-дневном возрасте.
• 2. Дополнительный приём пробиотика оказывает синергический эффект на коррекцию коли-титра при применении фаговых микстур как при пероральном, так и при интракутанном способе введения, однако более выражено — при пероральном применении.
• 3. Изолированное применение пробиотика, оказывая положительное влияние на динамику содержания E. coli по сравнению с контролем, уступает по результатам снижения коли-титра комбинированному применению фагов и пробиотика, однако незначительно превосходит изолированное пероральное применение фагов (1-я группа) в возрасте 34-дней.
• 4. Изолированное применение пробиотика практически не корректирует падение титра коли-фагов, однако способствовует его положительной коррекции при применении фаговой микстуры, причём при интракутанном применении — в большей степени, чем при пероральном.
• 5. Наибольшее влияние на коррекцию динамики содержания E. coli оказывает комбинированное пероральное применение фаговой микстуры и пробиотического препарата.
• 6. Наибольшее влияние на коррекцию динамики титра коли-фагов оказывает не только комбинированное применение фаговой микстуры (причём как перорально, так и интракутанно) и пробиотического препарата, но и изолированное пероральное применение фаговой микстуры.