Методика теста «Открытое поле»

" Открытое поле" - классическая модель исследования поведения, основанная на конфликте двух мотиваций — инстинктивной тенденции к исследованию нового окружения и тенденции минимизировать возможную опасность со стороны такового. Тест «открытое поле» является информативной методикой, позволяющей адекватно оценивать нейротропные эффекты повреждающих факторов окружающей среды. В этом тесте оцениваются двигательная и ориентировочно-исследовательская активность.

Снижение общей подвижности животных в данном тесте является следствием повышения уровня их стрессированности, поскольку крысы реагируют замиранием на новые, потенциально опасные стимулы. В тесте «открытое поле» потенциально опасная ситуация имитируется помещением животного в камеру, которая значительно больше, чем клетка, в которой живет крыса. Тестирование можно проводить либо при ярком свете (в стрессогенной обстановке), либо при свете красной лампы. В последнем случае уровень стрессированности животных меньше [1,15,16,17].

Животные исследования проводят на линейных (линий Wistar, Sprague-Dawley и др.) или нелинейных крысах. В случае использования линейных животных необходимо указать линию. Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10 особей. Разброс по исходной массе тела в группе не должен превышать 10%. В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде (за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520−09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов» .

Оборудование Установка для проведения методики «открытое поле». Видеокамера. Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ 27 201–87 с установленным программным обеспечением EasyTrack, разработанным в НИИ Нормальной физиологии РАМН и программным обеспечением SPSS 12(SPSS Inc., США).

Метод введения наноматериалов животным. Наноматериалы можно вводить: парентерально (внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно), ингаляционно и перорально (в составе корма, питьевой воды или через зонд).

Используется острое (однократное введение), подострое (ежедневное введение в течение 3 месяцев) и хроническое введение (ежедневное введение в течение 6 месяцев) наноматериала.

Тест проводят сначала в режиме экспозиции, т. е. через 1 час после введения наноматериала, а затем каждый день в течение 14 дней (при остром введении), на 210, 240, 270, 300, 330 и 360 дни (при хроническом введении).

Дозы введения наноматериала при остром воздействии — от минимальной токсической дозы до 1 LD, при подостром воздействии — от минимальной токсической дозы до 1/5 LD, при хроническом воздействии — 1/3−1/10 части минимальной токсической дозы [13,15].

Проведение измерений. Установка представляет собой круглую арену диаметром 90 см с боковыми стенками высотой 50 см (рисунок 2). Арена освещается неярким светом красной лампы мощностью 40 Вт, которая расположена на высоте 2 м. В начале тестирования крысу помещают в центр арены. За поведением животного наблюдают в течение 10 минут.

Параметры поведения регистрируют визуально, а также ведется видеозапись поведения крыс для анализа с использованием программы EasyTrack, разработанной в НИИ Нормальной физиологии РАМН.

Рисунок 2 — Установка «Открытое поле» .

Анализ и интерпретация полученных данных. Помещение животного в новое окружение ведет к возникновению исследовательского поведения, которому в то же время препятствуют условия, вызывающие страх. Две антагонистические тенденции характеризуются разным временным ходом.

При анализе поведения животного в тесте «открытое поле» выделяют центральную зону арены с диаметром 35 см. Выпущенное животное начинает двигаться вдоль стен камеры. Первоначально исследовательское поведение ограничивается периферическим сектором, а внутренние области посещаются редко. Исследовательское поведение животных наиболее выражено в течение первой минуты, затем оно постепенно ослабевает. При тестировании в свете красной лампы в течение 10 минут животное адаптируется к экспериментальной обстановке и начинает исследовать окружение, что проявляется в виде вторичного подъема активности [17,18].

Для периферического сектора визуально регистрируют:

• — количество стоек;
• — количество и продолжительность актов груминга;
• — количество дефекаций.

Для анализа динамики исследовательской активности крысы в течение тестирования скорость движения животного и количество стоек усредняют для последовательных интервалов длительностью 1 мин.

При помощи программы EasyTrack анализируют изображение, определяя положение тела животного в арене, что позволяет регистрировать следующие параметры:

• — общий пробег (в см);
• — время движения (при скорости более 15 см/сек.);
• — время неподвижности (при скорости менее 2 см/сек.);
• — среднюю скорость движения;
• — количество и продолжительность двигательной активности и замирания.

Такой же набор параметров, а также латентный период и длительность пребывания регистрируется для центрального сектора [2,5,8].

Замирание крысы в «открытом поле» рассматривают как симптом страха. Лучшим отражением уменьшения страха у животных является исследование ими внутреннего сектора. Смена эмоционального состояния сопровождается изменением работы внутренних органов. Вегетативная функция, которую удобно учитывать вместе с измерением активности — это дефекация. Обнаружена отрицательная корреляция между дефекацией и исследованием центральной части открытого поля. Стойки рассматриваются как индекс исследовательской активности, чувствительный к уровню тревожности или действию анксиолитиков (транквилизаторов). Груминг трактуется как «смешенное» поведение.

Те животные, которые меньше передвигаются и у которых наблюдается большая дефекация в ситуации «открытого поля», считаются более эмоциональными, чем те, которые много передвигаются, но имеют низкий уровень дефекации.

Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования при выполнении следующих критериев:

1) если основные параметры (количество стоек, количество и продолжительность актов груминга, количество дефекаций, общий пробег, время движения, время неподвижности, средняя скорость движения, количество и продолжительность двигательной активности и замирания) у животных из опытной группы не отличаются достоверно от контроля [3,6,9].