Определение белка с BCA реагентом

Этот метод основан на взаимодействии ионов Cu2+ с белками в щелочных условиях, что приводит к переходу катионов Cu2+ в Cu+, которые детектируются с высокой чувствительностью бицинхониновой кислотой. При этом зеленый цвет реагента меняется на пурпурный, причем интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации белка в растворе. Долгое время считалось, что механизм, лежащий в основе это метода, похож на механизм метода Lowry, но сейчас известно, что это две разные реакции с ионами меди, уникальные для метода BCA [5]. Первая реакция протекает при низких температурах и является результатом взаимодействия меди и BCA с аминокислотными остатками цистеина, цистина, триптофана и тирозина. При повышении температуры пептидная связь также ответственна за развитие окраски. Таким образом, проведение реакции при 37 °C, а не при комнатной температуре повышает чувствительность и уменьшает колебания измерений в зависимости от аминокислотного состава белков. Следует помнить, что после 37 °C оптическая плотность контрольной пробы увеличивается примерно на 2% за каждые 10 мин, поэтому после охлаждения пробы до комнатной температуры следует сразу же приступать к измерению. Чувствительность этого метода можно повысить, если инкубировать пробы при 60 °C.

Бицинхониновая кислота заменяет реагент Folin-Ciocalteu, используемый в методе Lowry. BCA образует комплекс с Cu+, который имеет максимум поглощения при 562 нм. Преимущество этого реагента в том, что он не взаимодействует со многими компонентами буферных смесей, особенно с детергентами. Вещества, которые могут мешать определению, — это либо восстановители Cu2+ (например, ДТТ), либо хелаторы (ЭДТА). Тем не менее, эти компоненты буферов не являются критическими, поэтому от них довольно легко можно избавиться.

Этот метод можно использовать для измерения белка в широком диапазоне (до 2000 мкг/мл), причем линейность калибровочного графика наблюдается практически во всем диапазоне концентраций.

Достоинство метода состоит и в том, что он нечувствителен как к ионным, так и неионным детергентам. В связи с этим, метод может успешно применяться для определения содержания мембранных и гидрофобных белков.