Диагностика. 
Бабезиоз собак

Диагноз ставится комплексно на основании эпизоотологических данных, времени года и клинических признаков. Лабораторно диагноз подтверждается нахождением возбудителя в мазках периферической крови (из кончика уха, хвоста, ногтевого ложа), окрашенных по Романовскому-Гимза. [1].

Babesia canis может иметь различную форму: грушевидную, овальную, округлую, амебовидную, но в основном находят парногрушевидную форму паразита. Все формы могут различно ассоциироваться в одном эритроците.

Ограниченные возможности световой микроскопии сдерживают своевременное проведение лечебных и других мер борьбы с болезнью. Трудности в идентификации бабезий, и особенно при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскивать специфические и более эффективные средства диагностики, такие как серологические. [11].

Cерологические исследования: реакция длительного связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ, ПЦР. Однако, в клинической практике они применяются редко, хотя их использование незаменимо для выявления паразитоносительства. [1].

В настоящее время общеизвестно, что при бабезиозе собак иммунные реакции являются общефизиологической защитной функцией организма, основу которой составляют клеточные и гуморальные факторы. В ответ на внедрение паразита происходит иммунологическая перестройка макроорганизма, что указывает на необходимость использования иммунологических методов изучения патогенеза и механизмов развития иммунитета, для ранней диагностики заболевания и, особенно, носительства, протекающего длительное время без выраженных признаков болезни.

Методом ПЦР можно обнаружить паразитов при паразитемии 5 бабезий в 1 мкл крови. Однако, несмотря на высокую чувствительность, ПЦР будет давать отрицательные результаты, если в пределах образца не окажется ни одного паразита. Как показывает практика, ложноотрицательные результаты могут отмечаться при хроническом бабезиозе и носительстве бабезий у бродячих животных. При проведении исследования на бабезиоз (пироплазмоз) у клинически здоровых собак необходимо учитывать эту особенность. Группой авторов была проверена чувствительность ПЦР в комплексном исследовании у трех собак. При этом учитывались клинические параметры, гематологические исследования, серологический титр антител к бабезиям. Присутствие ДНК бабезий определялось методом ПЦР каждый день после экспериментального заражения. После полного клинического выздоровления, диагностированного по клиническим признакам, на фоне отсутствия увеличения селезёнки, нормальной геммограммы и отсутствия бабезий при световой микроскопии на 50 день после пика паразитемии в крови этих собак была обнаружена ДНК бабезий. Данное исследование показывает возможность обнаружения очень незначительного количества ДНК возбудителя методом ПЦР; данный эксперимент, возможно, моделирует ситуацию, сравнимую с хроническим бабезиозом.

Возможность ПЦР-диагностики в обнаружении ДНК бабезий (пироплазм) при хроническом течении заболевания можно улучшить, проверяя не один, а несколько образцов крови от подозреваемого животного. [16].

РДСК и РНГА являются надёжными диагностическими тестами при бабезиозе и бабезионосительстве собак. В период бабезионосительства титры антител колеблются в пределах от 1:20—1:40 в РДСК и 1:2001:400 в РНГА. [13].

Изучение диагностической ценности серологических реакций — РДСК и ИФА при бабезиозе у собак показывает большую чувствительность последней, при этом установлено: антитела первично в сыворотке крови выявляются к концу инкубационного периода; по мере роста паразитемии и проявления клинических признаков бабезиоза — титр антител повышается; рост титров антител и максимальный их уровень соответствует улучшению общего состояния больных собак и паразитоносительству соответственно. [9].

В качестве лабораторной диагностики используется общий анализ крови. Кровь для изготовления мазка у взрослых собак берут из кровеносных сосудов уха, у щенков — из сосудов хвоста. Для получения мазка хорошего качества, на чистое обезжиренное спирт-эфиром предметное стекло наносят первую, выделившуюся после прокола сосуда каплю крови. Шлифовальное стекло устанавливали под углом 35−45° и, когда капля равномерно распределялась вдоль его нижнего ребра, плавно ведя шлифовальное стекло, наносят кровь на предметное стекло. Мазок высушивают.

Мазки фиксируют метиловым спиртом. Окрашивают мазки по Романовскому, краской, состоящей из азура П — 3,0, эозина В — 0,8; глицерина и метилового спирта — по 250,0 мл. Мазки крови погружают в рабочий раствор (1 мл дистиллированной воды + 1−3 капли краски) на 20−40 минут, затем промывают дистиллированной водой, сушат и проводят микроскопирование. Микроскопическое исследование мазков крови проводят в иммерсионной системе микроскопа (об. х90). [10].

На основании световой микроскопии и общего анализа крови при пироплазмозе постоянно можно выявить анемию, моноцитоз, тромбоцитопению, повышенное СОЭ и, конечно, паразитемию. Бабезии (пироплазмы) могут определяться как внутри эритроцитов, так и свободно, а также внутри макрофагов. Считается, здесь они оказываются в результате фагоцитоза пораженных эритроцитов. Такие макрофаги, нагруженные эритроцитами, также являются диагностическим критерием бабезиоза. Судить о тяжести течения по результатам световой микроскопии можно по степени паразитемии, анемии и моноцитоза, но без клинических параллелей эти данные имеют невысокую ценность. По литературным данным, предел чувствительности световой микроскопии приблизительно 0,001% зараженных паразитами эритроцитов. [16].

Reastain®Quick-Diff набор (набор для быстрого дифференциального окрашивания) — это оптимальная композиция реагентов и фиксатора для дифференциального окрашивания клеточных элементов в мазках перифирической крови. Процедура окрашивания занимает 3 минуты и идеально подходит для экспресс-диагностики. Для дифференциального окрашивания необходим также фосфатный буфер 67,0 ммоль/л рН 6,8.

Инструкция по окрашиванию:

Приготовление забуференной воды. Соотношение при растворении 1:20, например, 10 мл фосфатного буфера растворить в 190 мл деионизированной или дистиллированной воды.

Окрашивание.

• 1. Наливаем растворы в отдельные ёмкости.
• 2. Погружаем высушенные на воздухе мазки в раствор Reastain® Quick-Diff Фиксатора (на 1 секунду 5−10 раз).
• 3. Погружаем стёкла в раствор Reastain®Quick-Diff Красного на 1 секунду с 3−15 раз.
• 4. Погружаем стёкла в раствор Reastain®Quick-Diff Синего на 1 секунду с 3−15 раз.
• 5. Промываем стёкла с препаратом в забуференной воде и даём просохнуть.
• 6. При необходимости сохранения образца на длительный периоднакрываем стекло с препаратом покровным стеклом.

Результаты окрашивания можно варьировать, изменяя процедуру погружения.

При окрашивании мазков следует учесть, что используемый для протирания кожи этиловый спирт может стать причиной гемолиза и появления артефактов. Нельзя допускать высыхания на какой-либо стадии процедуры, промывание препаратов следует осуществлять только в забуференной воде. Результаты окрашивания зависят от рН. Щелочное рН усиливает синий, а содержание кислоты — красный оттенок.

В правильно окрашенном мазке, бабезии должны иметь голубоватую цитоплазму, более тёмную по периферии и тёмно-красный хроматин в виде двух небольших ядер. Мазки имели розоватый цвет с незначительным фиолетовым оттенком. [10].

В Санкт-Петербурге проводят (в одной из лабораторий) реакцию Кумбса. Ее принцип заключается в том, что антитела, находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть как в статичном, так и в свободном состоянии в плазме крови. В зависимости от состояния антител проводится прямая или непрямая реакция Кумбса. Если есть основания для предположения, что антитела зафиксированы на поверхности эритроцитов, проводится прямой тест Кумбса. В этом случае тест проходит в один этап — добавляется антиглобулиновая сыворотка. Если на поверхности эритроцитов присутствуют неполные антитела, происходит агглютинация эритроцитов. [24].