Белок слияния амилина человека с зеленым флуоресцентным белком «Superfolder»

Амилоидозы представляют собой заболевания, патогенез которых обусловлен образованием белков с аномальной пространственной организацией и их последующей агрегацией [1]. Примером локального амилоидоза является амилоидоз поджелудочной железы, обнаруживаемый у более 90% больных инсулиннезависимым диабетом (диабетом второго типа) [2]. Данный амилоидоз связан с накоплением амилоидных фибрилл, образующихся из полипептидного гормона амилина, также известного как «островковый амилоидный полипептид» (IAPP, islet amyloid polypeptide), вырабатываемого бета-клетками островков Лангерганса совместно с инсулином в соотношении 1:100. Имеются сведения о том, что амилин является самым амилоидогенным из известных полипептидов [3], но механизм панкреатического амилоидоза до сих пор не ясен.

Одна из стратегий получения рекомбинантных амилоидогенных полипептидов, в частности, амилина, заключается в их биосинезе в составе белков слияния в бактериальных клетках. В случае белков слияния, в которых роль вспомогательного белка выполняют тиоредоксин и BCL-XL, синтез целевого белка направлен в тельца включения [4; 9]. Однако методы получения белков в тельцах включения основаны на процессах денатурации и ренатурации, в ходе которых не всегда возможно выделение белковых молекул с правильной нативной структурой. Подходящим вспомогательным белком, обеспечивающим синтез целевого белка в цитоплазме бактерий и последующее его выделение без использования денатурирующих агентов, является зеленый флуоресцентный белок «Superfolder» (sfGFP), который представляет собой модифицированную форму GFP, отличающуюся устойчивостью при воздействии денатурирующих агентов и улучшенной кинетикой укладки [5]. Ранее в лаборатории молекулярной генетики человека были созданы генетические конструкции, кодирующие белки слияния sfGFP с модельными фибриллогенными белками транстиретином и бета2-микроглобулином, которые при определенных условиях формировали фибриллы in vitro [7; 8].

Цель настоящей работы состояла в получении рекомбинантного белка слияния амилина человека (IAPP) с sfGFP, содержащего сайт протеолиза тромбином Pro-Arg-Gly, расположенный между последовательностями sfGFP и IAPP (SF-Thr-IAPP), и исследовании свойств гибридного белка.

Методы. Экспрессионную генетическую конструкцию, кодирующую белок SF-Thr-IAPP, создавали с применением сконструированной ранее плазмиды на основе коммерческого вектора pTrc99A_P7, в который была введена последовательность sfGFP. кДНК гена зрелого амилина, необходимую для включения в плазмиду, получали посредством ПЦР с применением специфических праймеров и ДНК человека в качестве матрицы. Встраивание целевого продукта амплификации осуществляли с помощью эндонуклеаз рестрикции Hind III и Sal I.

Полученную плазмиду использовали для трансформации компетентных клеток E. coli. Синтез целевого белка осуществляли в среде LB с применением изопропил-в-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в качестве индуктора с последующей очисткой с помощью аффинной хроматографии на никель-агарозе. Концентрацию SF-Thr-IAPP определяли путем измерения поглощения при длине волны 490 нм, соответствующей максимуму поглощения sfGFP и содержащих sfGFP белков слияния. Анализ гибридного белка проводили посредством ПААГ-электрофореза в неденатурирующих условиях, при которых подвижность белков зависит как от величины молекулярной массы, так и от величины заряда.

Анализ цитотоксического действия выполняли на эукариотических клетках линии HepG2 с применением МТТ-теста.

Результаты. Схема плазмиды pTRC99a_P7-SF-IAPP, содержащей ген белка SF-Thr-IAPP, представлена на рис. 1.

Рисунок 1. Плазмида pTRC99a_P7-SF-IAPP.

Возможность очистки целевого белка посредством металл-хелатной аффинной хроматографии обеспечивали путем добавления к C-концу белка слияния последовательности, кодирующей 5 остатков гистидина.

Белок SF-Thr-IAPP получали в клетках экспрессионного штамма E. coli BL21(DE3). С помощью флуоресцентной микроскопии была выбрана колония, эффективно экспрессирующая целевой белок (рис. 2). Свечение бактериальных клеток, обусловленное наличием в них гибридного белка, свидетельствует о сохранении флуоресцентных свойств sfGFP в составе данного белка слияния.

Рисунок 2. Флуоресцентная микроскопия клеток E. coli после индукции синтеза белка SF-Thr-IAPP. Слева — клетки в проходящем свете; справа — свечение клеток, обусловленное флуоресценцией sfGFP в составе белка слияния

С целью увеличения экспрессии гибридного белка клетки BL21(DE3) подвергали тепловому шоку непосредственно перед индукцией синтеза белка, как описано ранее [7]. Выход белка SF-Thr-IAPP составлял 3−4 мг на 1 л культуры.

Анализ полученного белка слияния посредством электрофореза в неденатурирующих условиях выявил одну зону (рис. 3а, дорожка 1), скорость миграции которой была меньше по сравнению с зоной sfGFP (рис. 3а, дорожка 2), что можно объяснить большей молекулярной массой и более высокой изоэлектрической точкой SF-Thr-IAPP.

Рисунок 3. а — Электрофореграмма флуоресцентных белков: 1 — SF-Thr-IAPP; 2 — sfGFP. б — Агрегация белка слияния. 1 — sfGFP; 2 — SF-Thr-IAPP.

Было обнаружено, что при хранении белка SF-Thr-IAPP в растворе с pH 9,0 в концентрациях, в 2 и более раза превышающих концентрацию 1 мг/мл, в течение 1 и более недели при +4°C и 2−3 суток при комнатной температуре, либо в растворах с pH ниже 8,0 в течение 1−2 суток начинался процесс образования агрегатов, не способных проникать в концентрирующий и разделяющий гели (флуоресцирующие зоны над зоной мономера SF-Thr-IAPP; рис. 3б, дорожка 2). Появление этих агрегатов, вероятно, обусловлено присутствием амилоидогенной последовательности амилина в структуре гибридного белка, поскольку агрегации sfGFP при хранении в тех же условиях не наблюдалось. В образце, полученном путем инкубации SF-Thr-IAPP при комнатной температуре, методом электронной микроскопии было показано наличие амилоидных фибрилл.

Также на клетках HepG2 было исследовано цитотоксическое действие мономера и фибрилл SF-Thr-IAPP для концентраций 0,8, 2,5 и 7,0 мкМ в расчете на мономер. В концентрации 7,0 мкМ мономер демонстрировал цитотоксичность, в то время как фибриллы, взятые в той же концентрации, цитотоксичностью не обладали (сравнение с отрицательным контролем; p < 0,05). Мы предполагаем, что обнаруженный эффект мономера белка слияния связан с его постепенной олигомеризацией после добавления к культуре клеток вследствие уменьшения pH; при этом полученный результат, свидетельствующий о том, что цитотоксическое действие оказывают именно олигомеры, а не зрелые фибриллы, согласуется с опубликованными ранее данными для амилина [4; 6].

Заключение

С помощью новой генетической конструкции осуществлен синтез белка слияния, содержащего аминокислотные последовательности sfGFP и амилина человека. Cайт протеолиза тромбином между указанными последовательностями может использоваться для получения индивидуального амилина. В то же время сохранение белком SF-Thr-IAPP флуоресцентных свойств упрощает его исследование благодаря возможности визуализации в видимом и УФ свете. Гибридный белок обладает фибриллогенными свойствами и подходит в качестве модельного амилоидогенного белка для изучения процессов фибриллогенеза.

• 1. Шавловский М. М. Молекулярные и генетические основы этиопатогенеза амилоидозов // Медицинский академический журнал. — 2010. — Т. 10. — № 4. — С. 63−81.
• 2. Kahn S.E., Andrikopoulos S., Verchere C.B. Islet amyloid: A long-recognized but underappreciated pathological feature of type 2 diabetes // Diabetes. — 1999. — Vol. 48. — P. 241−253.
• 3. Kayed R., Berghagen J., Greenfield N., Sweimeh K., Brunner H., Voelter W., Kapurniotu A. Conformational transitions of islet amyloid polypeptide in amyloid formation in vitro // J. Mol. Biol. — 1999. — Vol. 287. — P. 781−796.
• 4. Lopes D.H.J., Colin C., Degaki T.L., de Sousa A.C.V., Vieira M.N.N., Sebollela A., Blanco Martinez A.M., Bloch Jr. C., Ferreira S.T., Sogayar M.C. Amyloidogenicity and cytotoxicity of recombinant mature human islet amyloid polypeptide (rhIAPP) // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279. — № 41. — P. 42 803−42 810.
• 5. Pйdelacq J.-D., Cabantous S., Tran T., Terwilliger T.C., Waldo G.S. Engineering and characterization of a Superfolder green fluorescent protein // Nat. Biotechnol. — 2006. — Vol. 24. — № 1. — P. 79−88.
• 6. Pillay K., Govender P. Amylin uncovered: A review of the polypeptide responsible for type II diabetes // BioMed Res. Int. — 2013. — Article ID 826 706 — 17 p.
• 7. Solovyov K.V., Kern A.M., Grudinina N.A., Aleynikova T.D., Polyakov D.S., Morozova I.V., Shavlovsky M.M. Genetic structures and conditions of their expression, which allow receiving native recombinant proteins with high output // Int. J. Biomed. — 2012. — Vol. 2. — № 1. — P. 45−49.
• 8. Solovyov K.V., Polyakov D.S., Grudinina N.A., Egorov V.V., Morozova I.V., Aleynikova T.D., Shavlovsky M.M. Expression in E. coli and purification of the fibrillogenic fusion proteins TTR-sfGFP and в2M-sfGFP // Prep. Biochem. Biotechnol. — 2011. — Vol. 41. — № 4. — P. 337−349.
• 9. Yonemoto I.T., Wood M.R., Balch W.E., Kelly J.W. A general strategy for the bacterial expression of amyloidogenic peptides using BCL-XL-½ fusions // Prot. Sci. — 2009. — Vol. 18. — P. 1978;1986.