Высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ — один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз.

Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии.

Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент).

Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делитсяна адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, лигандообменную и другие. Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно.

Нормально-фазовая ВЭЖХ — неподвижная фаза более полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента преобладает неполярный растворитель.

• · Гексан-изопропанол = 95:5 (для малополярных веществ)
• · Хлороформ-метанол = 95:5 (для среднеполярных веществ)
• · Хлороформ-метанол = 80:20 (для сильнополярных веществ)

Обратно-фазовая ВЭЖХ — неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента почти всегда присутствует вода. В этом случае всегда можно обеспечить полное растворение БАС в подвижной фазе, почти всегда возможно использовать УФ-детектирование, почти все подвижные фазы взаимно смешиваются, можно использовать градиентное элюирование, можно быстро переуравновесить колонку, колонку можно регенерировать.

• · Ацетонитрил-вода
• · Метанол-вода
• · Изопропанол-вода [12]

Разработана простая и экспрессная методика определения теобромина, теофиллина и кофеина в чае, кофе и какао методом ВЭЖХ. Определение алкалоидов производится на обращенно-фазовой колонке (Zorbax SB C-18, 250*4,6 мм, 5 мкм) с изократическим режимом элюирования ПФ (вода и ацетонитрил 90:10 по объему)

Алкалоиды, производные пурина (теобромин, теофиллин, кофеин), широко применяются в медицине как психомоторные стимуляторы (кофеин) и спазмолитические средства (теобромин, теофиллин), содержатся в растительном сырье (листья чая, семена кофе, бобы какао), применяемом для приготовления напитков.

Целью настоящего исследования была разработка методики количественного определения пуриновых алкалоидов методом обращено-фазовой ВЭЖХ, позволяющем определять данные вещества в сырье растительного происхождения в условиях изократического элюирования без применения ион-парных реагентов.

Экспериментальная часть. Работа выполнялась на жидкостном хроматографе Agilent HP 1100, в комплекте с системой подачи и дегазации на четыре растворителя G1311A, диодноматричным детектором G1315B, термостатом колонок G1316A, устройством для автоматического ввода образцов (автосэмплер) G1313A. Сбор данных, обработка хроматограмм проводилась с помощью программы Agilent ChemStation for LC 3D.

Разделение проводилось на хроматографической колонке Zorbax StableBond C-18 250*4,6 мм, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: вода и ацетонитрил 90:10, скорость подачи подвижной фазы 1мл/мин, объём пробы 10 мкл. Рабочая длина волны 272 нм выбрана на основании анализа спектров поглощения в области максимумов пиков определяемых веществ с помощью фотодиодноматричного детектора Diode-array detector Agilent HP 1100 G1315B и программы Agilent ChemStation for LC 3D.

Разделение проводилось при температуре колонки 30^о С, давление в системе около 100 bar. В качестве стандартов использовали образцы теобромина, теофиллина, кофеина фармакопейной чистоты (ГФ Х). Вещества считали идентифицированными при совпадении времен удерживания и спектров поглощения со стандартами.

Таблица 3. Хроматографические параметры разделяемых веществ.

Рисунок 6. Хроматограмма модельной смеси теобромина (1), теофиллина (2) и кофеина (3).

Методика. Около 1 г чая или кофе (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 250,0 мл, прибавляют 150,0 мл очищенной воды и выдерживают на водяной бане при температуре 855^о С в течении 30 минут, периодически втряхивая. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 200,0 мл, охдаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до метки водой очищенной.

Полученный раствор фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, отбрасываю первые 10 мл фильтрата. Полученный раствор хроматографируют на жидкостном хроматографе, получая не менее 5 хроматограмм для каждого раствора.

Рисунок 7. Хроматограмма образца чая Greenfield Black Tea (Россия) (теобромин (1) и кофеин (3)).

Рисунок 8. Хроматограмма образца какао быстрорастворимого Тикли (Россия) (теобромин (1) и кофеин (3)).

Расчет количественного содержание алкалоидов.

Расчет количественного содержания теобромина, теофиллина и кофеина осуществляют по градуировочным графикам зависимости концентрации вещества в пробе от площади пика.

Содержание каждого алкалоида равно:

(12).

где С — концентрации, определенные из градуировочных графиков для каждого из веществ: для теобромина С=0,0341S (R=1), для теофиллина С=0,0359S (R=1), для кофеина С=0,0321S (R=0,9999)площадь пика рассчитывается как среднее арифметическое для пяти определений; m — масса вещества в навеске в граммах.

Таблица 4. Количественное содержание пуриновых алкалоидов в некоторых образцах.

[13].