Тонкослойная хроматография. 
Хроматография в анализе лекарственного растительного сырья, содержащего алкалоиды

Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой метод разделения, в котором используется неподвижная фаза, состоящая из подходящего материала, нанесенного в виде тонкого слоя и зафиксированного на подложке (пластинке) из стекла, металла или пластмассы.

Перед хроматографированием растворы анализируемых веществ наносят на пластинку. Разделение основано на процессах адсорбции, распределения, ионного обмена или на их комбинации и осуществляется посредством перемещения в тонком слое (неподвижной фазе) исследуемых веществ, растворенных в растворителе или соответствующей смеси растворителей (подвижной фазе) [2].

Процесс подобен бумажной хроматографии, но его преимуществом является большая скорость анализа, более высокое качество разделения, и возможность выбора одной из неподвижных фаз, обладающей наиболее подходящими свойствами. В настоящий момент тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из основных методов анализа смесей органических веществ в научных лабораториях и полностью вытеснил бумажную хроматографию. [8].

Сорбенты. Как и для других органических соединений, для алкалоидов чаще всего используют силикагель. Ввиду слабого кислотного характера силикагеля алкалоиды адсорбируются на нем довольно прочно, поэтому следует пользоваться либо подщелоченным силикагелем, либо — что оказывается удобнее — вводить в систему растворителей компонент основного характера. Подщелачивание силикагеля чаще всего осуществляют 0,5 н КОН; иногда, однако, достаточно подвергнуть его действию паров аммиака. Некоторые слабоосновные алкалоиды можно разделять и на обычном силикагеле в более полярных проявляющих системах растворителей. Удобным также является окись алюминия.

Для разделения некоторых групп алкалоидов получает все большее распространение распределительная хроматография, обычно на слоях целлюлозы, пропитанной формамидом.

Этот способ имеет значительное преимущество главным образом при разделении структурно близких веществ, которые оказывается невозможно делить с помощью адсорбционной хроматографии. Изредка применяется в качестве сорбента крахмал.

Системы растворителей. Для хроматографирования алкалоидов на тонких слоях силикагеля большей частью пользуются системами с добавлением компонента основного характера, чаще всего органического основания, например диэтиламина или пиридина, а также системами, в которые входит аммиак. Обычной составной частью систем, применяемых на силикагеле, служит хлороформ, как правильно в смеси с низшими спиртами, например метанолом, этанолом или изопропанолом. Для слоев окиси алюминия помимо хлороформа часто пользуются бензолом, также в смеси с низшим алифатическим спиртом. [3].

Системы расворителей:

ХЛОРОФОРМ-АЦЕТОН-ДИЭТИЛАМИН (5:4:1);

ХЛОРОФОРМ-МЕТИЛОВЙ СПИРТ-УКСУСНАЯ КИСЛОТА (18:1:1);

БЕНЗОЛ-МЕТИЛОВЫЙ СПИРТ (19:1);

ХЛОРОФОРМ — ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ и др. [4].

Принимая во внимание высокую чувствительность и разделяющую способность метода ТСХ, указанный метода был использовандля идентификации теобромина и кофеина при их совместном присутствии.

Это обусловлено тем, что существующие методики обнаружения пуриновых алкалоидов на дают объективной информации и довольно трудоемки, а использование ТСХ основано на применении систем растворителей, содержащих высокотоксические вещества (бензол, хлороформ, метанол и др.). Указанные выше недостатки явились одной из главной причин изучения возможности применения нетоксических систем растворителей для решения поставленной задачи.

Исходи из физико-химических свойств изучаемых веществ, выбор сорбента и систем растворителей основывался на возможности использования специфического взаимодействия между сорбентом и определяемыми веществами, а также между последними и растворителями, с целью их разделения. В качестве сорбента использовали силикагель, а разделение производили на пластинках Силуфол УФ 254, размером 6,5*15 см.

Методика. На стартовую линию хроматографической пластинки в виде точки наносят 0,01−0,02 мл 0,1% раствора изучаемых веществ — теобромина и кофеина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают в сушильном шкафу при 100^о С в течении 3−5 минут, затем помещают в камеру, предварительно насыщенную парами растворителей и хроматографируют восходящим методом. Длина пробега 10 см. После хроматографирования пластинку вынимают и высушивают при 100^о С до полного удаления растворителей. Последующее детектирование осуществляют путем помещения пластинки в камеру, насыщенную парами йода. При этом в зонах обнаружения веществ на хроматограмме появляются желтые пятна круглой или овальной формы. Результаты исследования приведены в таблице 1 и 2.

Таблица 1. Результаты хроматографического исследования теобромина.

Таблица 2. Результаты хроматографического исследования кофеина. [9].

Обнаружение. Наиболее употребляемым реактивом для обнаружения алкалоидов является реактив Драгендорфа, обычно в модификации Мюнье (раствор йодвисмутата калия в уксусной кислоте). Недостатком способа является одинаковая окраска пятен исследуемых алкалоидов (оранжевые или оранжево-красные пятна). Получил большое распространение йодоплатинат калия, который образует пятная характерных цветов с рядом алкалоидов; пользуются также сернокислым церием. Ряд алкалоидов обнаруживает флуоресценцию в ультрафиолетовом свете. Это явление известно главным образом для алкалоидов спорыньи, для некоторых алкалоидов раувольфии. Для обнаружения алкалоидов можно использовать пары йода (образуются бурые пятна). К универсальным неспецифическим реактивам также относятся N-2,6-трихлор-п-бензохинонимин, флуорескамин. Прочие реактивы будут специфическими на отдельные группы алкалоидов. [3,4].

Некоторые группы алкалоидов:

Алкалоиды спорыньи.

Алкалоиды спорыньи подразделяются на несколько основных групп — группы эрготамина, эрготоксина, эргометрина и менее важную группу клавина. В медицине спорынья сама по себе из-за нестабильного содержания действующих веществ не применяется. Зато стандартизированные препараты и лекарственные средства из действующих веществ спорыньи прописывают для лечения различных нервных расстройств, состояний возбуждения и страха, а также мигрени. Но еще важнее их действие на матку: препаратами спорыньи останавливают кровотечения, а путем воздействия на вегетативную нервную систему побуждают матку к сокращению. [3,10].

Рисунок 4. Спорынья на ржи.

Хроматографии этих веществ посвящено значительное число работ; в частности, это касается диэтиламида лизергиновой кислоты (ЛСД). Благодаря слабоосновному характеру алкалоидов спорыньи можно работать на немодифицированном силикагеле, применяя системы растворителей средней полярности без компонентов основного характера. Пятна можно локализовать визуально в ультрафиолетовом свете.

Описаны и другие способы обнаружения, например опрыскивание раствором тетрацианоэтилена в ацетонитриле (этот способ рекомендуется для обнаружения галлюциногенов), или обнаружение аммиачным раствором сернокислой меди.

Пептидные основания можно обнаруживать также нингидрином.

Хроматографией алкалоидов спорыньи занимались такие ученые, как:

• · Шталь (подвергал разделению главные вещества эргометриновый, эготаминовой и эрготоксиновой групп на силикагеле G в системе хлороформ-метанол (95:5));
• · Грегер и Эрге;
• · Тейхерт (для успешного разделения близкородственных эрготоксиновых оснований, которые невозможно разделить адсорбционной хроматографией, применил принцип распределения на тонких слоях целлюлозы, обработанной формамидом);
• · Рейхельт и Кудрнач (хроматографировали 16 алкалоидов спорыньи на силикагеле, обработанном формамидом, в системах диизопропиловый спирт-тетрагидрофуран-толуол-диэтиламин (70:15:15:0,1));
• · Карачоньи и Сарвадь (определяли алкалоиды на окиси алюминия венгерского производства в системах хлороформ-этанол (97:3) или эфир-этанол в том же соотношении);
• · Многие работы были посвящены идентификации и определения содержания ЛСД в различных запрещенных материалах (Прохазка, Нивагути и Иноуэ, ШперлингКрист и др.) [3]

Алкалоиды опия. Алкалоиды опия еще называются опиатами. К этим веществам относят морфин, папаверин, кодеин. Все три вещества очень часто используют для лечения различных заболеваний. Одним из веществ этой группы является и героин — это полусинтетический алкалоид. По своему строению все эти вещества довольно разнообразны.

Но их объединяет похожее действие на организм, все они влияют на опиоидные рецепторы центральной нервной системы.

Лечение подобными веществами разрешается только по назначению и под контролем врача. 11].

Хроматографическое разделение этой фармацевтически чрезвычайно важной группы алкалоидов явилось предметом многочисленных исследований. В последнее время усилилось внимание, уделяемое их анализу с позиции токсикологии, а так же обнаружения препаратов с содержанием наркотиков.

Рисунок 5. Мак опийный.

Алкалоиды опия можно подвергать разделению во многих системах на различных сорбентах, причем широко применяются готовые слои. Их материалов следует упомянуть силуфол, материал на основе целлюлоз люцефол квик, обработанный формамидом или трис(оксиметил)метиламином, которыми пользовались при хроматографировании большого числа алкалоидов и местных анестетиков.

За рубежом существуют в продаже и чрезвычайно простые устройства, позволяющие хроматографировать лекарственные препараты прямо с поверхности, например коробочки из пластмассы, служащие в качестве миниатюрных проявительных камер, готовые микропластинки и т. д. Пользуются также электрофорезом на тонких слоях целлюлозы в кислых или щелочных электролитах при 500 или 3000 В.

Разделение простейших смесей веществ можно осуществить и на микропластинках, приготовленных их щелочного силикагеля в системе ацетон-бензол (1:1). Морфин подвергали анализу на слоях полиамида или на готовых пластинках силикагеля, разрезанных на квадраты размером 3*3 см. Для фармацевтических целей пригоден также тальк (2 г талька, 0,3 гипса, 4 мл метанола); на нем определяли кодеин, дионин и папаверин в присутствии новокаина в системах вода-ацетон-этанол-аммиак (30:1:10:5). Описаны и другие сорбенты.

Специфический способ обнаружения морфина в таблетках, экстрактах и т. д. основан на хроматографическом разделении на силикагеле в системах хлороформ-пропано-2- диэтиламин (18:20:10) или метанол- 20%-ный аммиак (100:1). После 1−2-часового нагревания в ультрафиолетовом свете можно наблюдать пятна со слабой голубой флуоресценцией. Морфин затем идентифицируют, опрыскивая 5%-ным раствором иодноватокислого натрия в 1%-ном аммиаке.

Спустя несколько минут появляется серовато-зеленое флуорецирующее пятно при длине волны 365 нм. После полного высыхания слоя окраска изменяется на серовато-голубую, при легком смачивании водой опять становится зеленой. [3].