Способы выявления и идентификации АВТ

Все включаемые в эту группу исследования выполняются на бедной тромбоцитами плазме (БТП). Они состоят из групп скрининговых и подтверждающих коагуляционных тестов, выполняемых либо мануально, либо на коагулометрах современных конструкций, но не на устаревших электрокоагулометрах и тромбоэластографах. Из скрининговых тестов наиболее доступным, но наименее специфичным является определение каолинового времени свертывания БТП. Наличие волчаночного антикоагулянта (ВА) может быть заподозрено при удлинении каолинового времени более, чем в 1,25 раза по сравнению с контролем. Вместе с тем следует помнить, что многие ВА не влияют на этот показатель и что его нарушение может быть обусловлено не только эффектами ВА, но и другими причинами.

Намного более информативны определения АЧТВ (АПТВ), но выполняемые не с обычными, а со специальными фосфолипидами, высоко чувствительными к действию ВА. Для этого, в качестве международных эталонов, признанных золотым стандартом, применяют диагностикумы, содержащие Platelin LS (фирмы «Organon-Teknika») или Staclot-LA (фирмы «Stago»). Многолетние испытания, проводившиеся в нашей лаборатории, подтвердили высокую информативность этих тестов. Под влиянием АВТ время свертывания в них удлиняется по сравнению с эталонной нормальной плазмой в 1,2 раза и более. Наличие ВА затем подтверждается другими скрининговыми и коррекционными пробами (см. ниже).

Особое место в выявлении ВА занимают тесты с фосфолипид-зависимыми коагулазами змеиных ядов. За рубежом с этой целью используется определение времени свертывания при добавлении к исследуемой БТП больного и к контрольной плазме разведенного яда гадюки Рассела [21,22,27]. В нашей лаборатории показано, что с этой же целью может быть использован коагуляционный тест с разведенным ядом среднеазиатской гюрзы (Vipera lebetina turanica), коагулаза которого по основным механизмам действия очень близка к коагулазе яда гадюки Рассела [12]. В больших сериях исследований, в том числе выполненных в нашем центре, показано, что коагуляционные тесты с фосфолипид-зависимыми разведенными змеиными ядами дают высокую корреляцию с показанием пробы с Platelin LS (коэффициент корреляции r =0.9; 0,02).

Для уточнения степени нарушения показаний фосфолипид-зависимых ядовых тестов используется определение отношения показателей времени свертывания, полученных в этих тестах, к времени свертывания, полученного в тестах с коагулазами ядов, не чувствительных к эффектам волчаночного антикоагулянта. С этой целью за рубежом чаще всего используется определение отношения времени свертывания в тесте с разведенным фосфолипид-чувствительным ядом змеи Pseudonaja textilis (текстарином) к свертыванию в тесте с фосфолипид-нечувствительным ядом Echis carinatus (песчаной эфы) [28]. Оба эти яда являются активаторами фактора II.

В нашем центре разработан аналогичный индекс, отражающий отношение времени свертывания в тестах с ядом гюрзы и эфы (Echis multisquamatus) той же активности. Показания последнего не зависят от участия в процессе свертывания фосфолипидных мембран [2, 5]. Определение этих индексов не только подтверждает то, что нарушение гемокоагуляции у исследуемого больного действительно зависит от блокады волчаночным антикоагулянтом плазменных фосфолипидных мембран, но и позволяет количественно оценить степень этой блокады. В норме указанные индексы варьируют в пределах от 0.9 до 1.1, а у больных с АФС — существенно повышены. Соответствующие ядовые диагностикумы выпускаются в Российской Федерации фирмой «Технология-Стандарт» (Барнаул), за рубежом — фирмами «American diagnostica», «Loxo», «Stago» и др.

Некоторые виды АВТ, отличающиеся высокой тромбогенностью [29], вызывают значительное замедление свертывания и в коагуляционном тесте с разведенным тканевым тромбопластином. Реагент разводится так, чтобы нормальное протромбиновое время было в пределах 45−55 с [2, 4, 13, 14, 17, 18]. Это определение также используется в комплексе диагностических тестов, выявляющих эффекты АВТ. Под влиянием АВТ протромбиновое время в плазме больного удлиняется по сравнению с эталонной нормальной плазмой в 1,2 раза и более. Однако нужно иметь в виду большое разнообразие выпускаемых разными фирмами тканевых тромбопластинов — получение их из разных исходных продуктов, неодинаковую чувствительность к действию АВТ и др. [2]. Поэтому в маркировках фирм-производителей должна быть указана возможность использования предлагаемого разведенного тромбопластина для определения антитромбопластиновой активности АВТ.

Качественно новым этапом в разработке методов диагностики АФС явилось создание в нашей лаборатории тестов, с помощью которых можно не косвенно, а путем прямого измерения оценивать степень блокады плазменных фосфолипидных мембран волчаночными антикоагулянтами [2, 6, 8, 15, 16]. В их основе лежит удаление плазменных фосфолипидных мембран (ПФМ) в процессе микрофильтрации БТП через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Наиболее простой способ, применяющийся для скрининга, заключается в определении каолинового времени свертывания (КВ) в БТП больного до и после ее микрофильтрации. Прокоагулянтную активность ПФМ оценивают по формуле, рассчитанной по калибровочным кривым:

X (%) = 10 3.8(lgtb-lgta)+1 ,.

где taКВ до микрофильтрации,.

tbКВ после микрофильтрации.

У больных с АВТ в крови в 83% случаев определяется снижение активности ПФМ в плазме в среднем до 55% (от 0 до 70%), что обусловлено блокадой их антифосфолипидными антителами. Вместе с тем, снижение активности ПФМ в плазме больных может быть связано не только с их инактивацией АВТ, но и вследствие количественного уменьшения в процессе формирования тромба и в первой фазе ДВС-синдрома [7].

Подтверждающие тесты направлены на исключение наличия в плазме больных других ингибиторов свертывания крови, не относящихся к АВТ и не связанных с блокирующим действием последних на прокоагулянтную активность плазменных фосфолипидных мембран. С этой целью определяют исправляется ли выявленное нарушение свертываемости крови добавлением к БТП больного нормальной БТП в отношении 1:1 или 0,4:1,0 и таким же добавлением к БТП больного взвеси из тщательно разрушенных тромбоцитов, содержащих избыток нормальных фосфолипидных мембран. Для этого может быть использован реагент «тромбоцитин» фирмы «Технология-Стандарт» (диагностикум «Люпус-тест»), либо приготовленная в собственной лаборатории эмульсия из тщательно отмытых и затем разрушенных повторным (не менее трех раз) замораживанием и размораживанием нормальных тромбоцитов. За рубежом (фирмы Stago, Organon-Teknika и др.) готовятся специальные «подтверждающие» диагностические наборы, в которые входит наряду с реагентами для выполнения АПТВ, чувствительного к АВТ, фосфолипидный компонент из разрушенных тромбоцитов, гексагональные фосфолипиды.

Следует особо подчеркнуть то давно установленное обстоятельство, что АВТ гетерогенны и отличаются друг от друга по механизму действия на свертывающую систему крови [17] и у разных больных с АФС нарушены то одни, то другие коагуляционные тесты. Вследствие этого выявление АВТ ни в коем случае не должно ограничиваться выполнением лишь одного или части перечисленных выше тестов. Полноценная диагностика должна базироваться на комплексном использовании всех перечисленных выше определений, в сочетании с иммунологическим исследованием титра негативно заряженных мембранных антифосфолипидных антител (АФА и антител к некоторым связанным с фосфолипидами гликопротеинам, см. ниже).