Пространственная структура и экологическая значимость микрофлоры полости рта

Крамарь В.С., Пономарева И. Г., Усатова Г. Н., Чижикова Т. С., Кравцова Е. О., Лаптева О. Г., Дубачёва С. М., Королёва Н. В., Чуйкина О. В., Куркина О. Н., Чернышова О. В., Климова Т. Н., Абрамов В.Г.

г. Волгоград. Волгоградский государственный медицинский университет.

Кафедра терапевтической стоматологии.

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии.

Полость рта представляет собой своеобразную экологическую систему, которая тесно связана с внутренней средой организма и его внешним окружением.

Неотъемлемой частью микроэкосистемы полости рта является нормальная микрофлора, обеспечивающая колонизационную резистентность, которая рассматривается как первичная мишень для любого фактора, прямо или опосредованно влияющего на адгезию и неспецифическую резистентность этой экосистемы (А.А. Воробьев с соавт., 1999).

Симбионты, входящие в состав этого биотопа макроорганизма, не только формируют нормальный состав микрофлоры, но принимают самое непосредственное участие в регуляции многих физиологических процессов.

Организм человека колонизирован различными микробными сообществами, однако в каждом из его топодемов количество микроорганизмов и их видовой состав характеризуется определенным постоянством.

Для раскрытия закономерностей существования микроорганизмов применим экологический подход, позволяющий осуществить достоверное описание структуры бактериальных сообществ, которые составляют биоценоз.

Целью работы явилось определение экологической значимости симбионтов и условно-патогенной флоры в оценке экосистемы полости рта.

Для выполнения поставленной цели обследованию подвергнуто 97 практически здоровых людей в возрасте от 18 до 60 лет, проживающих в различных районах г. Волгограда.

Колонизация полости рта оценивалась по составу микрофлоры. Забор материала для бактериологического исследования проводился по методике Е. О. Кравцовой (1995). Микрофлора изучалась по методу Haenel (1979) в модификации С. К. Канарейкиной с соавт. (1985).

При исследовании микрофлоры учитывали:

• 1) общую микробную обсемененность,
• 2) грамположительные кокки семейства Micrococcaceae — стафилококки, микрококки, стрептококки,
• 3) лактобактерии,
• 4) коринебактерии,
• 5) дрожжеподобные грибы рода Кандида,
• 6) энтеробактерии,
• 7) бациллы,
• 8) анаэробы.

Биологическое типирование микроорганизмов осуществлялось согласно биохимическим и антигенным свойствам микроорганизмов.

Для раскрытия закономерностей существования микроорганизмов в биоценозе применяли экологический подход к оценке микрофлоры, позволяющий осуществить описание сообществ, составляющих биотический компонент экосистемы ''макроорганизм — микрофлора'', что дало основание проследить направленность изменений микроэкологии полости рта при дестабилизации микробиоценоза.

В описании микрофлоры, населяющей полость рта человека, сочли целесообразным рассмотреть её структуру с последующим изучением связей со средой и функциональной характеристикой.

Сообщества, составляющие биоценоз, имели вертикальную дифференциацию и представляли собой многоярусное сложение из нескольких жизненных форм, которые были представлены несколькими видами.

Значимость каждого микроорганизма в сообществе характеризовалась рядом данных, с помощью которых сравнивались виды (Р.И. Уиттекер, 1980).

На основании показателя встречаемости определяли типологию доминант микробиоценоза по формуле С. И. Сытника (1989), индекс доминирования определяли по формуле Ю. Одум (1986).

Для характеристики микрофлоры как экологической системы, раскрытие её ценотической структуры применяли метод учёта количественных соотношений встречаемости определенных типологических групп микроорганизмов, используя индекс флористической значимости (М.П. Наткевичайте — Иванускене, 1985).

Из общего числа видов сообщества обычно лишь немногие были доминирующими, то есть имели большие показатели значимости. Значительно большая их часть отнесена нами к редким видам, поэтому существенной характеристикой сообщества являлось, по мнению Ю. Одум (1986), видовое разнообразие. На уровне первичных продуцентов видовое разнообразие служит средством функциональной стабильности сообщества, поскольку такие экосистемы, по мнению С. И. Сытника, обладают высоким видовым разнообразием.

Микрофлора полости рта у лиц с интактными зубными рядами исследовалась в четырех биотопах: со слизистой оболочки щеки, с поверхности языка, зубного налета и в слюне.

Анализируя таблицу 1, можно сказать, что видовой состав и плотность микробных сообществ в различных биотопах полости рта у здоровых лиц неодинаков. Наименьшее количество видов (4) и наименьший уровень бактериальной обсемененности выявлены на слизистой оболочке щек (9,03±0,45· 104 КОЕ/см2).

Таблица 4. Колонизация микроорганизмами полости рта здорового человека (М±m).

Далее прослеживается нарастание видового разнообразия и общей бактериальной плотности в слюне, на поверхности языка, и максимально выражены эти показатели в зубном налете, где количество встречающихся видов увеличивается в 2,5 раза, а общая бактериальная плотность превышает таковую слизистой оболочки щек в 22 раза, достигая 2,20±0,72· 106 KОE/см2 (табл. 5). У здоровых людей до 69% всего микробиоценоза полости рта составляет грампозитивная кокковая флора, 6% - грамнегативная, грибы рода Candida высевались у 28 человек, что составляет 27,8% наблюдений.

При обследовании людей с интактными зубными рядами у большинства обнаружены стрептококки, при этом наиболее часто это был Str. salivarius 100%, Str. sanguis — 84,0%, Str. mitis — 19,8%, Str. mutans — 11,6%. Однако на различных биотопах полости рта частота встречаемости этих видов стрептококков варьировала.

Если для Str. salivarius характерна 100% встречаемость во всех исследуемых биотопах, то Sir. sanguis в 100% обнаруживались лишь на слизистой щек, в зубном налете она составила 89,70±5,92%, а на поверхности языка всего 53,80±4,58%. Наибольший процент высева Str. mitis характерен для слюны (28,20±3,32), наименьший для слизистой щек -10,00±2,00%. Str. mutans чаще всего (в 15,40±2,45% случаев) обнаруживается в зубном налете, в то время как на слизистой оболочке щек в 8,00±1,73% случаев (табл. 6).

Таблица 5. Микрофлора полости рта лиц с интактными зубными рядами М±m, КОЕ/ед.субстрата.

Высеваемость лактобактерий у здоровых составила 81,40%, бактероидов — 12,2%, стафилококки обнаружены у 25,00% наблюдений. Процент обнаружения данных микроорганизмов изменялся в зависимости от исследуемого биотопа.

Так как микрофлору в настоящее время принято делить на постоянные или основные виды — встречаемость более 50%, сопутствующие — встречаемость более 25% и случайные или транзиторные — встречаемость менее 25%, то представлялось интересным рассмотреть закономерность распределения нормофлоры на эти формы (табл. 7).

Таблица 6. Колонизация различными видами стрептококков полости рта здоровых людей М±m, КОЕ/ед. субстрата

Исходя из того, что в зубном налете наблюдалось наибольшее число видов микроорганизмов, причем количество постоянных и дополнительных видов закономерно превалировало (2 и 3 соответственно) над таковыми слизистой оболочки щек (2 постоянных, дополнительные отсутствовали), поверхности языка (2 и I соответственно) и слюны (2 дополнительных), наблюдающийся переход транзиторной микрофлоры слюны и поверхности языка в дополнительную в зубном налете, наибольшая бактериальная плотность позволили выделить его в объект пристального микробиологического наблюдения и подвергнуть детальному изучению.

Таблица 7. Встречаемость основных, дополнительных и транзиторных видов микроорганизмов в различных биотопах полости рта, %.

Исследования микрофлоры зубного налета здоровых людей показали, что среди облигатной флоры наиболее часто высевались стрептококки (100%), при этом у большинства обследованных данный микроб обнаруживался в титрах 10−4 — 10−5. Лактобактерии выделялись в 89,70±5,92% наблюдений, в титрах — 10−2 — 10−3.

Существенные различия были выявлены не только в частоте обнаружения представителей факультативной микрофлоры, но и в массивности обсеменения ими зубного налета.

Так, стафилококки и грибы рода Candida регистрировались с различной частотой (46,20±4,24% соответственно), но количественное содержание было одинаково низким (определялись в титре 10−1 — 10−2). Наиболее редко высевались фузобактерии (5,10±1,41%). Другие факультативные виды — вейлонеллы, бактероиды, нейссерии обнаружены менее чем у 50% обследованных.

Подобная закономерность наблюдается не только в частоте обнаружения отдельных представителей микрофлоры, но и в массивности обсеменения зубного налета. Так, вейлонеллы регистрировались с более низкой частотой, чем стафилококки, но количественное их содержание было значительным — соответственно 0,10±5,74 и 2,82±2,35 в 1 грамме. Нейссерии, при большей по сравнению с фузобактериями частоте встречаемости, высевались в более низком титре (2,82±3,76· 101 и 1,11±0,84· 102).

Наиболее многочисленными обитателями полости рта были стрептококки, среди которых преобладал Str. salivarius. Высокая частота встречаемости этого вида и значительный удельный вес среди микроорганизмов данного рода позволили считать его доминирующим в сообществе. Второе и третье место по удельному весу среди всех выделенных культур занимали Str. sanguis и лактобактерии.

Таким образом, определилась доминирующая группа микробиоценоза, состоящая из Str. salivarius, Str. sanguis и лактобактерий. Str. mitis, Str. mutans, микрококки, энтеробактерии высевались намного реже. Удельный вес перечисленных микроорганизмов среди выделенных культур оказался невысоким. Это позволило отнести данные виды к транзиторымм.

Долгое время для оценки микробиоценоза служила количественная представленность различных экологических групп бактерий по среднестатистическим данным. Принадлежность к резидентной флоре определялась по частоте встречаемости, что давало право получить лишь приблизительное представление о микробиоценозе как системе. При этом совершенно не учитывалась его пространственная таксономическая структура, играющая важную роль в поддержании динамической стабильности.

Известно, что представители резидентной микрофлоры могут фиксироваться к строго определенный рецепторам, поэтому становится очевидной причина экологической значимости микроорганизмов (Б.А. Шендеров, I998). С помощью индекса, предложенного М.П. Наткевичайте-Иванаускене (1985), нами установлено, что большая склонность к групповому распределению обнаружена у лактобактерий (13,62%) и самыми значимыми оказались стрептококки (25,18%). Не случайно стрептококки первыми заселяют различные биотопы полости рта (В.С. Крамарь с соавт., 1989, 1992).

Глубокие изменения горизонтальной структуры микробиоценоза регистрируются при кариесе. При этом отчетливо наблюдается тенденция к увеличению значений индекса у стафилококков и кандид, а лактобактерии утратили свое лидирующее положение.

После санации полости рта эти процессы приобретают обратный характер.

Испытывая влияние самых разнообразных факторов, в том числе коррегирующих функцию, макроорганизм формирует ответную реакцию большей или меньшей силы. Выражение этой реакции, по мнению И. Г. Пономаревой (1993), может быть самым разнообразным, в том числе и изменение аутофлоры полости рта.

Вместе с тем, основываясь только на полученных данных, невозможно оценить все разнообразие изменений бактериальных сообществ. Поэтому для характеристики микробиоценоза количественные параметры необходимо дополнить показателями, отражающими качественные сдвиги в экосистеме. К последним относится индекс видового разнообразия, измеряемый как отношение количества видов в микробиоценозе к общей бактериальной обсемененности, выраженной в lg КОЕ/г (Р. Уиттекер, 1988).

Анализ показал, что индекс богатства видов достоверно увеличивается у здоровых, причем это происходит во всех биотопах.

Интерпретация полученных результатов требует рассмотрения проблемы насыщенности микробиоценоза. Полость рта относится к открытым экосистемам, которые подвержены регулярному разряжению, приводящему к утрате микроорганизмов. Из-за постоянных потерь такая система не может стать по-настоящему насыщенной. В этом случае внедрение новых видов в сообщество не сопровождается исчезновением ранее присутствовавших. Если же такое исчезновение происходит, сообщество было насыщено видами (М.Э. Микельсаар и др., 1986). Однако даже в тех сообществах, которые представлены неполным перечнем видов, присутствующие расширяют сферу своей деятельности и используют все имеющиеся ресурсы, хотя эффективность их эксплуатации может быть меньшей, чем у других, менее приспособленных микроорганизмов. Таким образом, большинство сообществ эффективно насыщены особями, но не видами.

Полученные результаты подтверждают это положение. У здоровых количество видов, встречающихся на поверхности языка, в зубном налете и в слюне, практически одинаково, а уровни бактериальной обсемененности этих участков достоверно отличаются друг от друга. Причем наиболее высокая плотность микроорганизмов обнаружена в зубном налете. Следовательно, зубной налет эффективно насыщен особями, но не видами. Поэтому интродукция условно-патогенных штаммов чаще происходит именно на этом участке. Таким образом, получено еще одно доказательство правомерности выбора зубного налета объектом диагностического, эпидемиологического и прогностического мониторинга.

Приведенная характеристика микробиоценоза полости рта позволяет представить его структуру в общих чертах и уловить главные тенденции изменений при рассматриваемых состояниях. Фактически это собирательный образ микробиоценоза полости рта, который может отличаться от индивидуального в каждом конкретном случае. Между тем в практике клиницистов возникает необходимость в оценке именно таких индивидуальных экосистем. Поэтому последний этап изучения микробиоценоза состоял в классификации и описании его индивидуальных типов на основе учета доминантного состава поверхностного слоя.

Среди представителей резидентной микрофлоры полости рта доминантный состав микробиоценоза формируют Str. salivarius, Str. sanguis и лактобактерии. Их сочетания определяют индивидуальный ценотип, а вместе с ним и отличительные черты конкретной экосистемы. По количеству доминантов в ценотипе микробиоценозы подразделяются на полидоминантные, монодоминантные и адоминантные. Так как Str. salivarius доминирует как по численности, так и по встречаемости, а также обладает высокой антагонистической активностью к большинству сочленов бактериальной формации полости рта, его наличие в ценотипе определяет характер биоценотических взаимоотношений. Поэтому ценотипы, в состав которых входит слюнной стрептококк, были отнесены к ценотипам первого порядка. Варианты, где место Str. salivarius занимал Str. sanguis, составили вторую группу — микробиоценозы с ценотипом второго порядка.

Анализ результатов показал, что сбалансированность экосистемы наблюдалась при ценотипе, состоящем из Str. salivarius, Str. sanguis и лактобактерий. Почти в половине случаев она достигалась только за счет доминантного состава, то есть пространство ресурсов распределялось между господствующими видами. Вместе с тем встречались микробиоценозы, где наряду с доминантными выявлены и другие виды, входящие в таксономическую структуру сообщества. Их проявление, по-видимому, отражает изменение пропорций между представителями ценотипа. Тем не менее наблюдаемое увеличение видового разнообразия происходит в пределах нормоценоза, так как не сопровождается внедрением несвойственных видов и не вызывает превышения порога плотности бактериальных популяций.

Показателями декомпенсации микрофлоры или дисбактериоза является либо уменьшение значения индекса видового разнообразия ниже уровня 1,71 lg KOЕ/г, либо появление несвойственных для микрофлоры зубного налета здоровых видов, таких, как Str. pyogenus, энтеробактерий, пептострептококков и других.

Изучение индивидуальных вариантов ценотипа и их экологическая характеристика позволили создать алгоритм оценки микробиоценоза полости рта. С его помощью можно определить пять состояний экосистемы от эубиоза первого порядка, обозначающего количественно и функционально сбалансированный нормоценоз до дисбиотической реакции — сообщества с компенсированным количественным или качественным дисбалансом. Два состояния нормоценоза первого и второго порядка отражают эффективность замещения отсутствующих компонентов ценотипа. Набор диагностических признаков алгоритма одновременно является критерием каждого из вышеперечисленных состояний. Существующие варианты нормоценоза представляют собой градации нарушений биоценотических взаимоотношений от полной гармонии (нормоценоз первого порядка) через дискомфорт (нормоценоз второго порядка) до дисгармонии (нормоценоз третьего порядка или дисбиотическая реакция). Фактически он представляют собой этапы, предшествующие возникновению дисбактериоза. Критериями последнего не случайно выбраны наличие несвойственных видов и значение индекса видового разнообразия ниже 1,71 lg KOЕ/г. Именно эти показатели свидетельствуют о нарушении пространственной и функциональной структуры экосистемы. В таком случае, по мнению Б. А. Шендеров (1999), гомеостатические механизмы теряют способность возвратить ее к исходному уровню, так как она выходит из управляемого состояния.

Итак, проведенные исследования микробиоценоза у лиц с интактной полостью рта позволили представить структуру экологии этого органа, определить доминантный состав и выявить микроорганизмы, имеющие склонность к групповому распределению.