Получение интерферонов генно-инженерным способом

интерферон лейкоцит ген вирус В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию [4].

В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.

Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli [16].

Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31 633 и 31 644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11−206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1 764 515), штамм Е. coli pINFAP2 (SU 1 312 961), штамм Е. coli pINFF-Pa (AU 1 312 962), штамм E. Coli SG 20 050 с плазмидой p280/21FN, штамм E. Coli SG 20 050 с плазмидой pINF14 (SU 1 703 691), штамм E. coli SG 20 050 с плазмидой pINF16 (RU 2 054 041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.

Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.

Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1 640 996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.

Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E. coli SG 20 050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3 М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2 054 041) [12].

Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E. coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E. coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфаинтерферона с введенными нуклеотидными заменами.

Экспрессия интерферона штаммом E. coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии [11].

Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона.

Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда «течет». Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате — снижение выхода интерферона.

Пример получения рекомбинантного интерферона:

600 г биомассы клеток Pseudomonas putida 84, содержавших рекомбинантную плазмиду p VG-3, после культивирования содержали 130 мг альфа-2 интерферона. Клетки загружали в емкость баллистического дезинтегратора с механической мешалкой вместимостью 5,0 л и приливали к ней 3,0 л лизисного буфера, содержащего 1,2% хлористого натрия, 1,2% трис-(гидроксиметил)-аминометана, 10% сахарозы, 0,15% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,02% фенилметилсульфонилфторида и 0,01% дитиотреитола при рН 7,7. Биомассу перемешивали до получения однородной суспензии в течение 30 мин, затем дезинтегрировали в циркуляционном режиме в баллистическом дезинтеграторе в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Время дезинтеграции составляло 1,5 ч. Процесс дезинтеграции заканчивали, когда при микроскопировании препарата в нескольких полях зрения микроскопа практически не наблюдается целых клеток микроорганизмов. Объем суспензии лизированной биомассы составил 3,5 л.

Полученный на данной стадии лизат затем поступал на стадию осаждения нуклеиновых кислот. Для этого в емкость, содержащую лизат при перемешивании со скоростью 1−1,2 л/ч подавали 180 мл 5% раствора полиэтиленимина. Суспензию перемешивали в течение 1 ч и центрифугировали для отделения осадка нуклеиновых кислот 1 ч при (9500±500) об/мин, при температуре (5±2)С. После центрифугирования отделяли супернатант, объем которого составлял 3,0 л [15].

При медленном перемешивании мешалкой в супернатант всыпали 182 г сухого сульфата аммония малыми порциями (каждую следующую порцию добавляли после полного растворения предыдущей). После окончания внесения сульфата аммония перемешивание продолжали до полного растворения соли и суспензию осадка белков выдерживали при температуре (5±2)С 16 ч, а затем центрифугировали в течение 1 ч при (13 500±500) об/мин при температуре (5±2)С.

Полученный осадок растворяли в дистиллированной воде, доводя общий объем до 4 л. Для осаждения сопутствующих белков проводили кислотное фракционирование полученного раствора, содержащего альфа-2 интерферон. Для этого в раствор добавляли 5,0 мл 50%-ной уксусной кислоты до рН 4,75. Полученную смесь переносили в холодильник и оставляли при температуре (5±2)С в течение 3 ч, затем центрифугировали суспензию белков при (13 500±500) об/мин 30 мин при (5±2)С.

К 4 л супернатанта добавляли 50,0 мл 1 М раствора Триса до рН (6,9±0,1). Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, составляла 9,0 мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (6,80,5)106 МЕ/мл. Удельная активность 8,5105 МЕ/мг. Общее содержание альфа-2 интерферона на данной стадии 2,91 010 ME.

Сорбент Солоза КГ в количестве 0,6 л в виде водной взвеси помещали в хроматографическую колонку. Затем с помощью перистальтического насоса через сорбент последовательно пропускали 2,0 л 0,2 М раствора гидроокиси натрия, 6,0 л дистиллированной воды и 4,5 л 0,05 М трис-ацетатного буферного раствора при рН (7,1±0,1), который на выходе из колонки контролировали рН-метром.

Раствор белков, содержащий альфа-2 интерферон, разбавляли дистиллированной водой до проводимости (6,0+2,0) мСм/см при комнатной температуре. Объем раствора при этом составил 19,2 л.

Раствор наносили на колонку со скоростью 1,5 л/час, затем промывали сорбент 2,0 л трис-ацетатного буфера 0,05 М при рН 7,0. Элюцию проводили 1,2 л 0,05 М раствором Триса с рН (10,2±0,1) Содержание интерферона во фракциях, собранных с помощью коллектора фракций, определяли иммуноферментным методом.

Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, составляет (2,2±0,2) мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (2,1±0,5)107 МЕ/мл, удельная активность препарата (9,7±0,5)106 МЕ/мг. Общее содержание альфа-2 интерферона на данной стадии составляет (1,5±0,5)1010 ME.

Сорбент Сфероцелл qae в количестве 0,15 л в виде водной суспензии загружали в колонку и промывали со скоростью 0,15 л/ч последовательно 0,5 л 2 М раствора хлористого натрия, 1,5 л дистиллированной воды и 1,0 л трис-ацетатного буферного раствора 0,05 М с рН 8,0, контролируя рН буферного раствора на выходе из колонки рН-метром [15].

Раствор белков объемом 0,7 л, содержащий альфа-2 интерферон наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл-QAE объемом 0,15 л со скоростью 0,2 л/час. Промывку колонки осуществляли трис-ацетатным 0,05 М буферным раствором (рН 8,0) объемом 0,1 л, затем примесные белки отмывали 1,0 л того же буферного раствора с добавлением 0,05 М NaCI. Элюцию интерферона проводили 0,8 л 0,1 М натрий-ацетатным буферным раствором при рН 5,0. Содержание альфа-2 интерферона во фракциях, собранных с помощью коллектора определяли иммуноферментным методом. Концентрация белка составляла (0,35±0,05) мг/мл, биологическая активность альфа-2 интерферона (1,7±0,2)107 МЕ/мл. Удельная активность препарата 5,5107 МЕ/мг белка. Элюат содержал 1,20×1010 ME. Выход по биологической активности на данной стадии 82,5%.

Полученный раствор доводили до рН (5,0±0,1) 50% уксусной кислотой и разбавляли 0,05 М натрий-ацетатным буферным раствором. Удельная электропроводность составила (0,29±0,02) мСм/см при температуре (5±2)С. Подготовленный таким образом раствор белка наносили на колонку с сорбентом Сфероцелл ЛП-М со скоростью 0,1 л/ч, промывали 0,3 л вышеуказанного буферного раствора, а затем элюировали интерферон с помощью линейного градиента концентрации хлористого натрия, создаваемой с помощью градиентного смесителя Ультроград Элюат фракционировали с помощью коллектора фракций и измеряли концентрацию общего белка и альфа-2 интерферона. Концентрация белка в объединенных фракциях (0,45±0,02) мг/мл. Объем раствора 0,1 л. Общее содержание альфа-2 интерферона (8,6±0,2)109 ME. Удельная активность — е (7,5±0,2)107 МЕ/мг. Выход на данной стадии 73%.

Полученный 3 раствор объемом 0,1 л концентрировали до (5,0±0,2) мл с помощью ячейки для ультрафильтрации, используя мембрану Amicon YM-3. Подготовленный таким образом образец наносили на колонку с сорбентом Сефадекс G-100, уравновешенную фосфатно-солевым буфером со скоростью 0,025 л/ч. Объем фракций составляет 10,0 мл. Полученные после хроматографии фракции проверяли на содержание альфа-2 интерферона иммуноферментным методом и объединяя фракции, содержащие основной пик альфа-2 интерферона. Объем полученного раствора составил 30,2 мл. Концентрация общего белка, определенная методом Лоури, (0,90±0,02) мг/мл. Общее содержание альфа-2 интерферона в растворе 5,5109 ME. Удельная активность полученного препарата альфа-2 интерферона 2,3108 МЕ/мг. Выход по альфа-2 интерферону на данной стадии составляет 90,2%. Полученный продукт стерилизовали и расфасовывали. Общий выход препарата 35,8%, в том числе на стадии очистки 51% [15].

Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка [10].

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

• 1) Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.
• 2) Полученным продуктом трансформируют Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.
• 3) Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН — мРНК.
• 4) Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка.
• 5) Определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН — мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН — кДНК человека [9].