Изучение антагонистической активности гемолитических E.coli, выделенных от больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта

Введение

При исследовании кишечной микрофлоры больных, страдающих хроническими кишечными заболеваниями, такими как гастрит, холецистит, панкреатит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, был выявлен дисбактериоз, выражающийся в резком повышении содержания бактерий рода протей, наличии гемолитических стафилококков и их ассоциаций, гемолитических кишечных палочек, увеличение числа споровых анаэробных бактерий [5, 6]. Дисбактериоз кишечника может стать причиной, поддерживающей воспалительный процесс при сопутствующих заболеваниях. Отмечено обнаружение гемолитических эшерихий — до 43,6 [9] при полипозах толстой кишки и до 3,4% у больных ЯБЖ и ЯБДК из биоптатов [3]. Существует корреляция между факторами вирулентности и продукцией бактериоцинов [4].

В нашей работе мы изучили наличие антагонистической активности гемолитических эшерихий (Hly+), выделенных при заболеваниях ЖКТ в отношении близкородственных и неродственных микроорганизмов и проследили её связь с наличием ферментативной активности.

Материалы и методы. Изучение микробного биоценоза на основании изучения просветной микрофлоры, согласно методике бактериологического исследования испражнений, предусматривало выделение, количественную и качественную характеристику основных представителей облигатных и факультативноанаэробных бактерий толстой кишки. Оценку полученных результатов проводили в соответствии с методическими рекомендациями по бактериологической диагностике дисбактериоза [7]. Антагонистическую активность гемолитических E. coli определяли методом отстроченного антагонизма [1,8]. На плотную питательную среду (1,5% питательный агар) засевали суточную бульонную культуру штамма — продуцента факторов ингибирования (гемолитические E. coli) в виде прямой полосы в центре чашки Петри. После выращивания в течение 24 часов при 37єС и 24 часов при комнатной температуре 24єС, штрихами, перпендикулярно штамму — продуценту проводили высев 4-х часовых бульонных (при использовании лактобактерий — суточных агаровых) культур индикаторных штаммов. Через 24−48 часов культивирования при оптимальной для испытуемых культур температуре и условий (микроаэрофильных для лактобактерий) культивирования учитывали расстояние задержки роста индикаторных штаммов. Для контрольного посева вместо индикаторного штамма использовалась изучаемая культура гемолитической E.coli. Таким образом создавались оптимальные условия раздельно для роста штаммапродуцента, биосинтеза факторов антагонизма и роста индикаторной культуры, которые могут существенно различаться [2]. Результат оценивался по торможению роста индикаторных штаммов, чувствительных к антагонистическому действию: до 2мм — +, от 2 до 5 мм — ++, 5−10 мм — +++, более 10 мм — ++++.

В качестве индикаторных штаммов использовались культуры патогенных энтеробактерий: E. coli О-151, Salmonella enteritidis, Shigella flexneri 2a; культуры условно-патогенных бактерий: Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Stahpylococcus aureus, типичные E. coli и лактобактерии, выделенные от больных дисбактериозом; культуры пробиотиков: E. coli М₁₇ из биотерапевтического препарата (БПТ) «Колибактерин». Выделенные микроорганизмы подвергали идентификации по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам. К лактобациллам относили грамположительные, неподвижные, неспоровые, не обладающие каталазой микроаэрофильные бактерии.

В работу были взяты 105 штаммов гемолитической E. coli, выделенных от больных ЖКБ, панкреатитом, холециститом, колитом, ЯБЖ и ЯБДК. Из них 48 штаммов проявляли хорошую, 45 штаммов были со слабовыраженной и 12 штаммов не обладали ферментативной активностью по отношению к лактозе.

Результаты. Все индикаторные штаммы были подразделены на группы [таб. 1]:

• 1. Группа патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, куда вошли E. coli О-151, S. enteritidis, S. flexneri 2a, K. pneumoniae. С этой группой было проведено 408 ииследований, в 216 случаях индикаторные штаммы проявляли чувствительность к антагонистическому действию дисбактериозной E. coli Hly+ - 59,9 ± 2,5% (M±m), подавление роста в этой группе составило 8,4±0,8 мм.
• 2. Вторая группа представлена БТП E. coli М-17, из 105 проведенных исследований, антагонистическая активность проявилась в 9 случаях — 8,6±2,8%, подавление роста составило 0,9±0,5 мм.
• 3. С третьей группой — P. aeruginosa, проведено 105 исследований, в 51 случае 48,6±4,9% штаммов гемолитической E. coli проявили антагонистическую активность с зоной подавления 3,7±0,9 мм.
• 4. Четвертая группа была представленная кокковыми микроорганизмамиStahpylococcus aureus. Из 105 штаммов гемолитической E. coli, 81 штамм обладал бактериоцинной активностью- 77,1±4,1%, с зонной задержки роста 7,6±0,9%.
• 5. Из 1680 исследований — в 636 случаях типичные E. coli (пятая группа) были чувствительными к антагонистическому действию E. coli Hly+, что составило 37,8±1,2%, зона задержки роста составила 10,8±0,5 мм.
• 6. Группа, представленная бактериями рода Lactobacillus. Из 1482 исследований в 853 случаях E. coli Hly+проявляли антагонистическое действие, что составило 57,5±1,9% с зоной задержки роста 17,7±0,8 мм.

Для изучения влияния лактозного признака на антагонистическую активность штаммапродуцента все E. coli Hly+ были разбиты на 3 группы [таб. 3]. Было обнаружено, что наибольшей активностью обладают штаммы со слабовыраженной ферментативной активностью. Так, E. coli О-151 была чувствительна к таким штаммам в 80,0±6,0%; S. enteritidis в 66,7±7,0%; S. flexneri 2a в 26,7±6,6%; K. pneumoniae — в 100%, лактобактерии в 68,8±1,8%, типичные E. coli — в 48,9±3,3% случаев. Наибольшая антагонистическая активность гемолитических E. coli со слабовыраженной ферментативной активностью проявилась в отношении K. pneumoniae. Штаммы E. coli О-151 оказались более чувствительными к бактериоцинному действию слабоферментирующих E. coli Hly+, чем S. enteritidis в 1,2 раза (р>0,1). Лактобактерии оказались в 1,4 раза более чувствительными, чем типичные кишечные палочки (n>30, p<0,001).

Активность гемолитической E. coli с выраженной ферментативной активностью была несколько ниже. Так, в 93,8±3,4% случаев E. coli Hly+ проявляли активность в отношении K. pneumoniae, в 68,8±6,7% к E. coli О-151, в 56,2±7,2% к S. enteritidis, в 39,6±3,2% к типичным E. coli, в 28,3±2,0% к лактобактериям и только в 6,2±3,4% к S. flexneri. Прослеживается достоверная разница антагонистического действия по отношению к S. flexneri группы E. coli Hly+ с ферментативной активностью и группы E. coli Hly+ со слабовыраженной ферментативной активностью в пользу последних (р?0,01). В 75,0±12,5% случаев штаммы лактозонегативных E. coli Hly+ проявляют антагонистическую активность к K. pneumoniae и в 82,0±2,2% случаев к лактобактериям. К E. coli О-151 и S. enteritidis: такая активность была в 50,0±14,4%, к типичным E. coli в 25,0±5,6%, а к S. flexneri — ни одного случая.

При сравнении антагонистического действия 3 групп E. coli Hly+ на представителей семейства энтеробактерий в показателях задержки роста (в мм) [таб.2], обнаружено, что наибольшая зона задержки роста прослеживается у K. pneumoniae. К слабоферментирующим штаммам E. coli Hly+ подавление роста клебсиелл составляет 20,3±1,1 мм, к штаммам с выраженной ферментативной активностью — 18,6±1,4 мм, и наименьшая — к лактозонегативным E. coli Hly+ - 10,5±2,4 мм. Наименьшая задержка роста проявляется у S. flexneri в этой же последовательности: 1,5±0,5; 0,6±0,2; 0, мм соответственно. Показатель ингибиции роста типичных E. coli [таб.4] выше при действии слабоферментирующих E. coli Hly+ и с нормальной ферментативной активностью в 2,2 (р<0,001) и в 1,9 раза (р30, p<0,001).

Обсуждение.

Наибольшую чувствительность к антагонистическому действию гемолитических E. coli проявили лактобактерии, S. aureus, патогенные и условно патогенные энтеробактерии — более 50% штаммов — продуцентов оказали ингибирущее действие. Менее 50% исследованных штаммов E. coli Hly+ проявили активность к синегнойной палочке и к типичным E. coli — 48,6±4.9; 37,8±1,2% соответственно. Наименьшую чувствительность проявил штамм E. coli М-17 — 8,6±2,8, что в 8,9 раз меньше, чем в группе S. aureus, в 6,9 раз — в группе энтеробактерий, в 5,6 раз в группе P. aeruginosa и в 4,3 раза в группе типичных E. coli и в 6,6 раз в группе лактобактерий. Таким образом, наиболее устойчивы к антагонистическому действию гемолитических E. coli штамм E. coli М-17 и типичные E.coli.

При сравнении антагонистической активности 3-х групп E. coli Hly+ на индикаторные штаммы энтеробактерий, обнаружено, что все они проявляют наибольшую активность к K. pneumoniae. Штаммы E. coli O-151, S. enteritidis были чувствительны к действию бактериоцинов более, чем в 50% случаев, но отмечается наибольшее действие E. coli Hly+ с низкой ферментативной активностью. Самая низкая чувствительность к факторам антагонизма прослеживается у S. flexneri: лактозонегативные гемолитические E. coli не активны по отношению к ней, E. coli Hly+с выраженной ферментативной активностью проявляют антагонизм в 6,2±3,0% случаев, а со слабовыраженной ферментативной активностью — в 26,7±6,6% (р<0,01), т. е. в 4 раза больше. При сравнении антагонистической активности 3-х групп E. coli Hly+ на представителей патогенных и типичных кишечных палочек, обнаружено, что все 3 группы проявляют высокую активность к патогенным культурам кишечных палочек. Так культура E. coli O-151 в 1,7 раз случаев больше была чувствительна к действию бактериоцинов E. coli Hly+ с выраженной ферментативной активностью (р<0,001), в 1,6 раз случаев к действию E. coli Hly+ со слабовыраженной ферментативной активностью (р0,01), чем типичные кишечные палочки. При изучении антагонистического действия E. coli Hly+ на представителей нормальной микрофлоры кишечника, обнаружено, что лактобактерии более чувствительны — у 57,5±1,9% штаммов лактобактерий отмечается подавление роста, тогда как типичные эшерихии подавляли свой рост в 37,8±1.2% случаев, т. е. в 1.5 раза меньше. Так же выявлено неравнозначное действие антагонистической активности 3-х групп гемолитических эшерихий представителей биоценоза кишечника. Наиболее чувствительны лактобактерии были к действию лактозонегативных — 82,0±2,2% и со слабовыраженной ферментативной активность 68,8±1,8% E. coli Hly+, что в 2,9 и 2,4 раза больше, чем действие гемолитических эшерихий с выраженной ферментативной активностью — 28,3±2,0%.(n>30,p30, p30, p<0,001).

По зоне подавления роста энтеробактерий, E. coli М-17 так же оказались наиболее устойчивыми — 0,9±0,5 мм, а типичные кишечные палочки, наоборот, самыми чувствительными- 10,8±0,5 мм. Штаммы S. aureus и энтеропатогенные бактерии одинаково подавляли рост — 7,6±0,9 и 8,4±0,8 мм. По сравнению с типичной E. coli как представителя нормальной флоры кишечника человека, все индикаторные штаммы кроме E. coli М-17, проявляли более высокую чувствительность к антагонистическому действию E. coli Hly+. Так, S. aureus в 2 раза (р=0,001, n>30), энтеробактерии в 1,6 раз (р30), Р. aeruginosa — в 1,3 раза (р30). E. coli М-17 были усточивее к антагонистическому действию гемолитической E. coli в 4,4 раза (р30), чем типичные кишечные палочки. По зоне подавления роста лактобактерии также оказались менее устойчивыми, чем типичные E. coli к действию всех трех групп гемолитических эшерихий: от 15,4±0,9 до 21,4±0,7 мм. (M+m). Наибольшее подавление роста отмечено к действию лактозонегативных гемолитических E. coli — 21,4±0,7 мм., тогда как типичные эшерихии наиболее подавляли свой рост при действии E. coli Hly+ с выраженной и слабовыраженной ферментативной активностью. Так подавление роста лактобактерий было достоверно больше, чем у представителей типичных E. coli (n>30, p<0,001) при действии лактозонегативных E. coli Hly+ в 9,3 раза, слабоферментирующих E. coli Hly+ в 3,2 раза и с нормальной ферментативной активностью в 3,5 раз.

Выводы. Штаммы гемолитической E. coli обладают антагонистическим, в т. ч. бактериоцинпродуцирующим действием со способностью ингибировать рост как близкородственных патогенных и условно патогенных энтеробактерий, в т. ч. типичную кишечную палочку, так и неродственных микроорганизмов — стафилококков, псевдомонад, лактобактерий. Антагонистическое действие бактериоцинов изучаемых штаммов низкое по отношению к БТП «Колибактерин» — E. coli М-17 и по чувствительности и по подавлению зоны роста. В отношении патогенных и условно патогенных энтеробактерий, антагонистическая активность выше к K. pneumoniae, ниже к S. flexneri. Средняя бактерицидная активность обнаружена к представителю диареегенных кишечных палочек — E. coli O-151 и к S. enteritidis и невысокая к типичным представителям E.coli. Обнаружена антагонистическая активность к неродственным микроорганизмам, особенно к лактобактериям и золотистому стафилококку. Среди представителей нормофлоры толстого кишечника, лактобактерии в несколько раз оказались наиболее чувствительными к действию гемолитических эшерихий, чем типичные E. coli и по процентному содержанию и по зоне подавления роста.

Из трех групп E. coli Hly+ наибольшую антагонистическую активность на изученные индикаторные группы, кроме лактобактерий, проявляют штаммы со слабовыраженной ферментативной активностью, наименьшую — лактозонегативные. E. coli Hly+ оказывают выраженный антагонистический эффект на патогенные (кроме S. flexneri), непатогенные представители энтеробактерий, не являющихся нормофлорой кишечника и лактобактерии. Их активность их ниже при действии на типичные эшерихии. Антагонистическая активность E. coli Hly+ на лактобактерии более выражена у штаммов с отсутствием или слабовыраженным лактозным признаком.

Из проделанного фрагмента работы вытекает два аспекта для последующего изучения:

• 1. Формирование персистенции патогенных, условно патогенных энтеробактерийбактерий и неродственных микроорганизмов за счет устойчивости к бактериоцинам.
• 2. Направленный подбор при дисбактериозе биотерапевтических препаратов с более выраженными антагонистическими свойствами для воздействия на персистирущие патогенные и условно патогенные бактерии.

Таблица 1 Чувствительность индикаторных штаммов к антагонистическому действию гемолитических Е. соli

Таблица 2 Количественные характеристики антагонистического действия гемолитичских E. coli 3-х групп на бактерии семейства Enterobacteriaceae.

кишечный антагонистический гемолитический заболевание.

Таблица 3 Чувствительность патогенных энтеробактерий к 3-м группам дисбактериозных гемолитических E. coli (% М±m)

Таблица 4 Антагонистическая активность 3 групп гемолитических E. coli в отношении типичных E. coli и лактобактерий (в количественном выражении — в мм).

Примечания

• 1. Блинкова Л. П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления. Журн. микробиол., 2003, № 3, с. 109−113.
• 2. Блинкова Л. П. Получение томицида — нового бактерийного препарата и изучение его биологической активности. Дис. д-ра биол. наук. М., 1986.
• 3. Бондаренко В. М., Червинец В. М., Воробьев А. А. Роль персистирующих условнопатогенных бактерий в патогенезе язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. Журн. микробиол., 2003, № 4, с. 11−17.
• 4. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий. М. Медицина, 1999 г.с.365.
• 5. Красноголовец В. Н. Дисбактериоз кишечника. М. Медицина, 1989 г. с. 208.
• 6. Мазанкова Л. Н., Запруднов А. М. Микроэкология кишечника у детей в норме и патологии. Рос. мед. вести. — 1996. — № 1. с.34−43.
• 7. Методические рекомендации «Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника», М.: 1977. — 25с.
• 8. Постникова Е. А., Ефимов Б. А., Володин Н. Н., Кафарская Л. И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов. Журн. микробиол., 2004, № 2, с. 64−69.
• 9. Чеснокова М. Г. Дисбактериоз у больных полипозом толстой кишки. Журн. микробиол., 2001, № 5, с.65−68.