Генная терапия: средства доставки трансгенов в клетку

Вирусные вектора Ретровирусные векторы Ретровирусные векторы в генной терапии Аденовирусные векторы Аденоассоциированные векторы Герпесвирусные вектора Генная терапия: Вирусные векторы и клетки-мишени: резюме Ретровирусные векторы используются в работах с трансгенными животными. Для генной терапии используют очень похожие векторы. Количество генетической информации, которое может быть перенесено с помощью этих векторов не очень велико — до 9000 пар оснований. Это либо небольшой эукариотический ген, либо кДНК.

Было показано, что в ряде систем, основанных на использовании стволовых клеток, например в клетках костного мозга, фибробластах, гепатоцитах, кератиноцитах и других, ретровирусы позволяют трансгенам экспрессироваться достаточно долго. Некоторые нюансы связанны с проблемами их использования для целей лечения человека.

Хоть человек и животное, но при этом он все-таки человек! Понятно, что введение требуемого гена со своими собственными регуляторными элементами осмысленно только, если удается осуществить экспрессию трансгена в нужной ткани. Использование ретровирусных векторов для пополняющей терапии ограничивается болезнями, где поврежденный ген в нормальном организме регулируется не очень сложно.

Существует несколько трудностей и опасностей для пациентов в использовании ретровирусных векторов для целей генной терапии.

Во-первых, количество псевдовирусных частиц, получаемых из пакующей клеточной линии мало, примерно #106 в миллилитре среды, в которой растут клетки. Этого более или менее достаточно для целей ex vivo генной терапии. Но этого очень мало, когда нужно применить стратегию in vivo. Этот недостаток пытаются ликвидировать, но пока еще рано говорить об стабильном успехе в этом направлении.

Во-вторых, проникновение ретровирусной частицы в клетку абсолютно зависит от наличия на поверхности этой клетки специфического для данного ретровируса рецептора. Поэтому не все клетки так просто инфицируются.

Например пакующая линия клеток, которая была получена первой, так называемая пси2 # пакующая линия, содержит интегрированный в геном клетки геном вируса лейкемии мышей Молони (Moloney murine leukemia virus). Это был экотропый вирус, т. е. он инфицирует только мышиные клетки. Почему это так?

А потому что его ENV белок узнает только мышиные рецепторы. Поэтому была изобретена пакующая линия клеток (#am, в которой последовательности, кодирующие родной экотропный белок оболочки вируса Молони, были замещены геном оболочки из другого, амфотропного, вируса Молони. Т. е. вируса, который способен поражать более широкий спектр хозяев. В результате получаемые псевдовирусные частицы приобрели способность проникать в человеческие клетки.

В дальнейшем такие амфотропные пакующие линии были усовешенствованы, чтобы увеличить выход вирусных частиц и уменьшить вероятность рекомбинации дефектного ретровируса с клеточными эндогенными ретровирусами.

В-третьих, также как в трансгенных животных, уровень экспрессии интегрированного в геном хозяйской клетки случайным (более точно, квазислучайным) образом ретровирусного трансгена зависит от эффекта положения. В клеточной популяции трансфецированной ретровирусным вектором разные клетки очень сильно отличаются друг от друга по уровню экспрессии трансгена, поскольку он оказывается в них в разных положениях. Было бы хорошо осуществлять таргетинг векторов к определенному положению в геноме. Работа в этом направлении проводится. Хотя, часто экспрессия достигается достаточно продолжительная нередки и случаи, когда после непродолжительного периода, экспрессия резко снижается или даже полностью подавляется. Иногда это связано, например, с метилированием ДНК. В некоторых случаях провирусные последовательности теряются из генома или перегруппировываются. Иммунная система хозяина может начать отлавливать клетки, которые экспрессируют трансген. Ведь мы не провели его через эмбрион, а ввели в соматические клетки, и иммунная система вполне может решить, что эпитопы, выставленные на поверхности клеток, экспрессирующих трансген — чужие. Существует и такая опасность: интеграция ретровируса в некоторые клетки может инактивировать ген-супрессор опухолеобразования. Это, конечно, очень редкое, но вполне возможное событие. Но, возможно, опасность его не нужно переоценивать, учитывая что для возникновения реальной опухолевой клетки требуется нескольеко мутационных событий.

Наконец, может быть главная неприятность заключается в том, что возможна рекомбинация между дефектным ретровирусом, который сам по себе не опасен, и каким либо из эндогенных ретровирусных элементов в паковочной линии клеток. Геном млекопитающих буквально начинен такими остатками былых инфекций наших предков окружающими их ретровирусами. В результате рекомбинации может возникнуть компетентный инфекционный ретровирус. Поэтому стараются получить такие пакующие клеточные линии, продуцирующие ретровирусный вектор, в которых рекомбинации были бы сведены к минимуму.

Хотя опасность всех этих событий низка, исследователи должны с ней считаться, ведь они конструируют эти системы для лечения людей. Заканчивая рассказ о ретровирусных векторах для генной терапии, напомню еще один их недостаток, о котором мы говорили в лекции по трансгенозу. Ретровирусы интегрируют в делящиеся клетки. Это также ограничивает спектр их применения.

Аденовирусные векторы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов. Однако используемые в настоящее время аденовирусные векторы вызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцев.

Недостатки ретровирусных векторов, побуждают искать другие векторные системы. Наибольшие надежды возлагают на аденовирусы и герпесвирусы. Геномы у этих вирусов представлены двухцепочечными ДНК и достаточно велики: 36 кб у аденои 150 кб у герпесвирусов. Обычно они не интегрируют в геном клетки хозяина (хотя для герпесвирусов и сообщалось об интеграции отдельных частей вирусной ДНК).

Многие обычные серотипы аденовирусов являются патогенами человека, инфицирующими верхние дыхательные пути. Интактные аденовирусы использовались для целей вакцинации и в результате накопилась большая информация касательно безопасности этой системы для человека. Аденовирусы могут получаться с очень высокими титрами, до 10¹² инфекционных частиц в миллилитре культуральной среды. Для целей генной терапии на сегодняшний день в качестве векторов использовали два аденовирусных серотипа, 2 и 5. Аденовирусы проникают в клетку, взаимодействуя с двумя рецепторами. Они хорошо приспособлены для целей терапии in vivo, поскольку дают высокие титры вирусных частиц. Аденовирусы способны реплицироваться и в делящихся и в неделящихся клетках. Они не интегрируют в геном клеток-хозяев и остаются эпихромосомными. Это уменьшает опасность инсерционного мутагенеза, о которой мы говорили в случае ретровирусов. Инфекция пермиссивных клеток аденовирусом приводит к их лизису. Схематически аденовирусный геном представлен на Рис. 3. Аденовирусный геном может быть превращен в дефектный по репликации путем делеции Е1 области. (Здесь следует оговориться, что требование Е1 гена для репликации не является абсолютным. При высокой множественности инфекции некоторая репликация все же наблюдается и у дефектных по Е1 области аденовирусов. Однако эта способность очень сильно подавлена). Вместо Е1 области может быть вставлен трансген примерно того же размера, что и в случае ретровирусных векторов, т. е. до 10 кб. Для того чтобы обеспечить рост таких репликационно дефектных рекомбинантных вирусов, созданы специальные рекомбинантные клетки, содержащие экспрессирующиеся гены Е1. Это очень похоже на ту хитрость, которую использовали в случае ретровирусов. Эти клетки комплементируют дефект аденовирусного вектора и позволяют ему размножаться и образовывать вирусные частицы, которые не могут реплицироваться в некомплементирующих клетках. На рис. 3 показаны места, в которые может быть встроен трансген. Это области Е1а, Е1b, и Е3. Аденовирусные векторы были использованы недавно для эффективной доставки генов в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей in vivo. Этот эпителий является природным местом инфекции для большинства аденовирусов, поэтому в данном случае аденовирусы имеют преимущество перед ретровирусами, поскольку последние, хотя и могут реплицироваться в эпителии, не могут быть получены в достаточно высокой концентрации для целей терапии in vivo. Однако, эпихромосомная локализация имеет и недостатки — продолжительность экспрессии трансгена невелика — недели, в лучшем случае месяцы. А хотелось бы побольше, хотелось бы на всю жизнь, ведь мы чаще всего имеем дело с наследственными, т. е. пожизненными болезнями. В результате аденовирусные векторы придется вводить пациентам не один раз и навсегда, а регулярно. Выдержит ли организм такое насилие?

Аденоассоциированный вирус (ААV) представляет собой маленький вирус, содержащий одноцепочечную ДНК. При инфекции клеток он интегрирует свою ДНК в геном хозяйской клетки со значительной специфичностью к определенному участку хромосомы 19 человека. Плохо только, что именно эта область хромосомы вовлечена в хромосомные перегруппировки, связанные с возникновением хронической В-клеточной лейкемии. Поэтому может быть лучше бы ему интегрироваться неспецифично? Но мы с вами пока не знаем связаны ли с этой специфической интеграцией какая либо опасность. Поэтому будем ждать информации. Вообще же AAV выглядит очень привлекательным вектором, и он способен также инфицировать неделящиеся клетки.

ГЕРПЕС ВИРУС (HSV): клетки-мишени: Неделящиеся клетки, Дифференцированные нейроны, Дифференцированные гепатоциты ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Доступны мутанты дефектные по репликации,
• · Доступны пакующие системы,
• · Высокие титры,
• · Широкий спектр клеток-хозяев,
• · Высокая эффективность инфекции,
• · Инфицирует клетки, неинфицируемые ретровирусами,
• · Биология хорошо изучена,
• · Высокая емкость — до 30кб.

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Упаковка происходит с низкой эффективностью,
• · Репликационно-дефектные мутанты цитотоксичны,
• · С вирусным геномом трудно создавать векторные конструкции,
• · Сложная регуляция.

Генная терапия: Вирусные векторы и клетки-мишени: резюме.

РЕТРОВИРУС: клетки-мишени: Фибробласты, Эндотелиальные клетки, Миобласты, Гладкомышечные клетки, Гепатоциты, Гематопоэтические клетки, Стволовые клетки ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Непатогенен,
• · Интегрирует в геном,
• · Относительно простое манипулирование,
• · Биология хорошо изучена

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Относительно низкие вирусные титры,
• · Ограниченная емкость для внедрения трансгена ((10 кб),
• · Не инфицирует неделящиеся клетки,
• · Экспрессия трансгена м.б. непродолжительной
• · Не очень хорош для in vivo терапии

АДЕНОВИРУС: клетки-мишени: Гепатоциты, Эпителий верхних дыхательных путей, Лимфоидные, гематопоэтические и миелоидные клетки ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Доступны непатогенные дефектные мутанты,
• · Человек — природный хозяин,
• · Высокие титры,
• · Высокая эффективность при in vivo инфекции,
• · Инфицирует как делящиеся так и неделящиеся клетки, неинфицируемые ретровирусами,
• · Биология хорошо изучена,
• · Существуют паковочные клеточные линии

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Не интегрирует в геном,
• · Конструкция вектора более сложна, чем у ретровирусов,
• · Может рекомбинировать с природными аденовирусами.
• · …

АДЕНО-АССОЦИИРОВАННЫЙ ВИРУС: клетки-мишени: Гематопоэтические клетки, Фибробласты, Эпителиальные клетки ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Непатогенен,
• · нецитотоксичен,
• · Человек — природный хозяин,
• · Предпочтительный сайт интеграции на хромосоме 19,
• · Способен устанавливать латентное состояние,
• · Относительно простое конструирование вектора.

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Относительно низкие титры,
• · Малая емкость (4кб),
• · Инфекционность относительно низка,
• · Требует аденовирус в качестве помощника для инфекции,
• · Биология не очень хорошо изучена.

…

ГЕРПЕС ВИРУС (HSV): клетки-мишени: Неделящиеся клетки, Дифференцированные нейроны, Дифференцированные гепатоциты ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Доступны мутанты дефектные по репликации,
• · Доступны пакующие системы,
• · Высокие титры,
• · Широкий спектр клеток-хозяев,
• · Высокая эффективность инфекции,
• · Инфицирует клетки, неинфицируемые ретровирусами,
• · Биология хорошо изучена,
• · Высокая емкость — до 30кб.

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

• · Упаковка происходит с низкой эффективностью,
• · Репликационно-дефектные мутанты цитотоксичны,
• · С вирусным геномом трудно создавать векторные конструкции,
• · Сложная регуляция.

Невирусные подходы к доставке генов развивают многие лаборатории. Привлекает в них несколько вещей. Во-первых — это не вирусы, и, значит, опасности, о которых мы говорилось в разделе о вирусных векторах, пациентам не грозят. Это простые системы и в них можно помещать сколь угодно большие ДНК. Естественно, тут же возникают проблемы доставки. Куда-то надо ее, эту невирусную систему, вводить пациенту, и при этом, чтобы она попала в то место, в те клетки, где она нужна. Допустим, как она будет вести себя в крови? Что с ней будет вытворять иммунная система? ДНК должна быть упакована в таком виде, чтобы она связывалась с клетками мишенями и желательно не связывалась с другими клетками.

Успешная доставка длинной нестабильной полианионной молекулы ДНК в клетку-мишень через три липидных бислоя, т. е. клеточную мембрану и двойную ядерную мембрану требует специальных ухищрений.

Во-первых, надо создать условия, при которых ДНК не подвергалась бы деградации, механической и энзиматической.

Во-вторых, сделать так, чтобы эта ДНК выживала перед тем, как она доберется до клеточного ядра, Это значит, что когда ДНК попадает в клетку, она должна избежать эндосом и лизосом и найти путь к ядру.

И конечно, нужно обеспечить долговременную экспрессию генов, содержащихся в ДНК. В основном для этих целей используют две главные стратегии.

В первой из них образуют катионные липидсвязанные комплексы с ДНК в составе липосом. Эти комплексы положительно заряжены. Они связываются с клетками мишенями. Они содержат липиды со свойствами сплавляться с клеточными мембранами и облегчать проникновение ДНК в клетки. В частицах не содержится информации, направляющей их прямиком в ядро. Поэтому большая часть генного материала, проникшего в клетку оказывается связанной с цитоплазматическими органеллами и уничтожается. Только небольшая часть избегает этой участи.

Во второй стратегии используют имитацию вирусов. В этом случае ДНК вводят в комплекс с поликатионом (например, полилизином), лигандом для связывания с клеткой и эндоцитоза (таким лигандом может быть, например, трансферрин или антитело, специфичное к какому-либо поверхностному белку клетки) и специальным агентом, облегчающим высвобождение ДНК из этого комплекса и эндосом в цитоплазме. Такие агенты называют эндосомолитическим. Ими могут служить репликационно-дефектные аденовирусные частицы, влючаемые в комплекс. Для увеличения безопасности таких систем пытаются использовать аденовирусы животных, не способные реплицироваься в человеческих клетках. Лиганд, введенный в комплекс, определяет клеточную специфичность доставки ДНК.

При явных достоинствах, системы невирусной доставки имеют и серьезные недостатки. Они малоэффективны. Требуется очень высокая концентрация частиц, чтобы перенос гена осуществился. Пока неясно, как обстоит дело с проблемами безопасности при их использовании. Пока эти системы испытывались на людях только в стратегии in vivo. Многие склонны считать, что идеальным для целей генной терапии соматических клеток был бы вектор, имитирующий хромосому человека. Такие векторы могли бы быть созданы по образу и подобию природных хромосом, также как созданы дрожжевые искусственные хромосомы — YAC. Для этого они должны содержать три функциональных элемента: Участок, обеспечивающий репликацию (origin of replication) Последовавтельность, обеспечивающую митотическую стабильность — центромеру. Последовательность, обеспечивающую правильную репликацию и устойчивость к нуклеазам — теломеры. Полагают, что такие искусственные хромосомы для клеток млекопитающих появятся в ближайшее время [ Обозрение 1995 ].