Применение ДНК-маркеров на основе ретротранспозона Cassandra для оценки генетического полиморфизма вида Prunus spinosa

Применение ДНК-маркеров на основе ретротранспозона Cassandra для оценки генетического полиморфизма вида Prunus spinosa

В настоящей статье приведены результаты апробации IRAP ДНК-маркеров Cass1 и Cass2 применительно к виду Prunus spinosa. Полученные данные позволяют говорить о высокой перспективности их использования для изучения генетического разнообразия генофонда данного вида. По результатам анализа выборки, из 12 генотипов было идентифицировано от 6 до 13 фрагментов в спектре по маркеру Cass1 и от 5 до 11 фрагментов по маркеру Cass2. В результате кластерного анализа в изученной выборке сформировалось три группы образцов. В одну из групп, наиболее удаленную от двух остальных, вошли образцы, отобранные в Украине, в то время как две оставшиеся группы включили образцы из Армении, Краснодарского края, республики Адыгея, Волгоградской области, и три культурные крупноплодные формы. Распределение образцов по кластерам соответствовал их географическому происхождению, что свидетельствует в пользу объективности оценки генетических дистанций между образцами с использованием маркеров Cass1 и Cass2. Сделан вывод о перспективности использования данных ДНК-маркеров для изучения генетического разнообразия вида Prunus spinosa.

Ключевые слова: РОД PRUNUS, Prunus spinosa, терен, ДНК — МАРКЕРНЫЙ АНАЛИЗ, генетическое разнообразие, IRAP-маркеры Род Prunus это широко распространенный таксон древесных растений, относящийся к семейству Rosaceae. Многие виды этого рода имеют важное экономическое значение, так как являются ценными плодовыми культурами: персик, слива, абрикос, вишня, черешня, миндаль, а также используются для декоративных целей. Род Prunus возник монофилетически в среднем эоцене и в последующем широко распространился в умеренной и субтропической зоне. Большое разнообразие форм в сочетании с близким генетическим родством видов, делают род Prunus удобным объектом для изучения процессов видообразования и доместикации. Генетические исследования тёрна тесно связаны с изучением происхождения родственного вида — сливы домашней (Prunus domestica).

Одним из дискуссионных вопросов в генетических исследованиях внутри рода Prunus является вопрос происхождения гексаплоидного вида слива домашняя (Prunus domestica L.; 2n=48). Данный вид известен в культуре с IV века до нашей эры и в диком виде в настоящее время не встречается. Формы, которые предположительно считались дикими видами, при дальнейшем цитологическом и морфологическом анализе признаков оказались одичавшими формами сливы домашней, терна или алычи. Большинство исследователей сошлись на том, что слива домашняя — это естественный гибрид, полученный в природе в результате скрещивания терна (Prunus spinosa) и алычи (Prunus cerasifera) [1]. Считается более вероятным возникновение этого вида в Армении, Северном Иране и Сирии, где обнаружены, примитивные сорта сливы домашней, многочисленные сорта алычи и полукультурные формы терна [1,2]. Подтверждается гипотеза о более сложном происхождении сливы домашней. Изучая флавонолы косточковых культур, установили, что состав этих веществ у вишни мелкоплодной (Prunus microcerasus), терна и алычи свидетельствует в пользу новой гипотезы о происхождении терна как аллополиплоида от гибридизации вишни мелкоплодной и алычи. Поскольку в состав генома терна входят геномы этих видов (Cs Ms), а в состав генома сливы домашней — геномы алычи (Cd), (Cs) и геном вишни мелкоплодной (Ms), геномная формула сливы домашней может быть представлена как: Cs Cs Cd Cd Ms Ms [1,2].

Кроме того, цитогенетическое исследование и оценка по комплексу морфологических признаков, выполненная группой ученых под руководством D. Zohary (2000) не позволило получить 100% подтверждений предположения о происхождении сливы в результате гибридизации терна и алычи. Авторами выдвинуто предположение, что слива возникла в результате полиплоидизации алычи. При этом возможность последующей гибридизации вновь возникших полиплоидных форм с видом Prunus spinosa они также не исключают [3].

Очевидно, что эти три вида: слива домашняя, алыча и терен генетически очень близки, и в исследовании, выполненном с использованием хлоропластных ДНК-маркеров, было обнаружено, что алыча генетически более близка к сливе, но терен, тем не менее, участвовал в формировании вида Prunus domestica [4].

Исследования в вопросе происхождения сливы домашней нельзя считать окончательно завершенными, поскольку не существует единого мнения. Очевидно, что изучение генетического полиморфизма видов, потенциально считающимися предками сливы домашней, будет способствовать накоплению научных знаний в данной области, что позволит, в дальнейшем сделать окончательные выводы о степени участия видов Prunus cerasifera и Prunus spinosa в формировании вида Prunus domestica.

Молекулярно-биологические исследования генетической структуры и филогенетических связей внутри рода Prunus дают возможность более тщательно рассмотреть механизмы эволюции внутри таксона и оценить степень генетической близости видов. Для рода Prunus выполнен целый ряд работ, направленных на изучении генетических взаимосвязей на уровне вида/рода, но, как правило, данные работы изучали наиболее экономически значимые виды [5−8]. При этом для вида Prunus spinosa, являющегося одним из предковых видов сливы домашней, перечень таких работ очень лимитирован. Одна из наиболее недавних работ была выполнена с использованием микросателлитных ДНК-маркеров и выявила, что вид Prunus cerasifera, вероятнее всего являлся материнской формой при формировании вида слива домашняя и внес наибольший вклад в данный процесс. Но, тем не менее, авторы предположили, что вид Prunus spinosa, также участвовал в формировании вида Prunus domestica. Причем вероятным было как протекание прямой гибридизации с видом Prunus cerasifera, так и вторичная гибридизация терна с формами, являющимися промежуточным звеном между алычой и сливой домашней [9].

Наряду с SSR-маркерами к перспективным для использования в данном направлении геномным структурам можно отнести ретротранспозоны. Наиболее простой маркерной системой основанной на анализе вставок ретротранспозонов является IRAP маркеры, комплементарные концевым последовательностям LTR-областей ретротранспозона. Для ряда представителей рода Prunus были установлены последовательности ретротранспозонов и на их основе разработаны IRAP-маркеры [10].

На основе LTRs последовательностях транспозона Кассандра, обнаруженного у сливы домашней [7], были разработаны два IRAP маркера (Cass1 и Сass2). В дальнейшем эффективность разработанных IRAP маркеров была продемонстрирована при генотипировании репрезентативной выборки словацких сортов сливы домашней [8].

Учитывая высокий уровень информативности IRAP ДНК-маркеров на основе ретротранспозона Кассандра, выявленный при генотипировании различных видов рода Prunus, в том числе и сливы домашней, нами была поставлена задача оценить перспективность использования данных ДНК-маркеров Cass1 и Сass2 для анализа генетического полиморфизма вида Prunus spinosa.

Объекты и методы исследования.

В изучаемую выборку входило 13 генотипов из коллекций косточковых культур МОС ВИР и КОСС ВИР. Генотипы терна отобранные в экспедициях: Гузерипль (Адыгея), Цареградский (Украина), Терн дикий (Молдова), Мукачевский 3 и Мукачевский 31 (Мукачево, Украина), Уманский 1 и Уманский 2 (Умань, Украина) Люсахпюр 2 (Армения), Боржоми (Грузия), Таманский 20 (Тамань). Возделываемые сорта крупноплодного терна: Терн вишневый, Терн абрикосовидный, Терн сверхобильный. В качестве растительного материала для экстракции ДНК использовались молодые листья. ДНК экстрагировали методом ЦТАБ [11].

Концентрация компонентов ПЦР-смеси: 1Х буфер, 0,3 мМ dNTP, 3 mM MgCl2, 0,75 mM праймеров (Cass1 или Сass2), 1 ед. ДНК-полимеразы, 20 нг ДНК на одну реакцию. Условия проведения ПЦР-реакции: Для Cass1 — 1 мин предварительной денатурации при 94 С; 32 цикла включающие следующие этапы: денатурация 1 минута 94 С, 1 минута отжиг праймеров при 54 С, 3 минуты элонгация при 72 С; в конце 32 циклов заключительная элонгация при 72 С 10 минут. Для Cass2 — 3 мин предварительной денатурации при 94 С; 32 цикла включающие следующие этапы: денатурация 40 сек при 94 С, 40 секунд отжиг праймеров при 61 С, 2 минуты элонгация при 72 С; в конце 32 циклов заключительная элонгация при 72 С 5 минут. Электрофорез проводили в 2% агарозном геле в течение 2 часов при напряжении 100 вольт. Статистическую обработку данных проводил с использованием программы PAST, доступной на сайте: http://nhm2.uio.no/norlex/past/download.html.

Результаты В результате выполненной работы была выявлена воспроизводимость используемых IRAP ДНК-маркеров для вида Prunus cerasifera. Для всех изученных генотипов идентифицировали IRAP-спектры по маркерам Cass 1 и Cass 2. На рисунке 1 приведен пример электрофоретического спектра изученных образцов терна по IRAP-маркеру Cass 2.

Рисунок 1 Электрофоретический анализ продуктов амплификации маркера Cass 2 М — маркер молекулярной массы ДНК; 1−7 образцы вида Prunus spinosa: 1 — Мукачевский 3, 2 — Мукачевский 31, 3 — Уманский 1, 4 — Уманский 2, 5 — Люсахпюр 2, 6 — Боржоми, 7 — Таманский 20.

Полученные IRAP — спектры насчитывали следующее количество фрагментов: по маркеру Cass1 от 6 (образцы Боржоми и Таманский 20) до 13 фрагментов (образец) и для маркера Cass2 — от 6 до 12 фрагментов. Суммарно было идентифицировано 26 полиморфных фрагментов для маркера Cass1 и 22 полиморфных для маркера Cass2. Несмотря на то, что по маркеру Cass2 было выявлено меньшее суммарное количество полиморфных фрагментов, количество уникальных фрагментов (выявляемых только у одного образца) по данному маркеру значительно превышало данный показатель маркера Cass1. Данный показатель был равен 9 и 3 для маркеров Cass2 и Cass1, соответственно.

Сопоставление данных полученных по результатам исследования IRAP полиморфизма в выборке из 13 образцов терна с результатами, полученными нами ранее при генотипирвоании сортов сливы домашней, персика и алычи позволяет сделать вывод о высоком уровне полиморфизма, выявляемого данными маркерам у вида Prunus spinosa. Кроме того, обнаружили, что для терна более полиморфным является маркер Cass1, в то время как при анализе выборки из 15 образцов сливы домашней, персика и алычи нами был выявлен более высокий уровень полиморфизма для маркера Cass2 — для маркера Cass1 выявили 17 полиморфных фрагментов и 22 полиморфных фрагмента по маркеру Cass2 [12]. В работе группы словацких ученых при IRAP анализе 9 сортов сливы домашней также был выявлен более высокий уровень полиморфизма для маркера Cass2 в сравнении с маркером Cass1 [13].

Выявленный факт обусловлен различиями в организации геномов изученных видов, а также может быть являться следствием различий в количестве вставок данного ретротранспозона в геноме.

С целью выявления генетических взаимосвязей в изученной выборке образцов, нами был выполнен кластерный анализ и анализ методом главных компонент на основе суммарных результатов IRAP генотипирования по маркерам Cass1 и Сass2. Результаты представлены на рисунках 2 и 3.

Рисунок 2 UPGMA дендрограмма характеризующая степень генетического сходства изученных образцов, выполненная на основе данных генотипирования по IRAP маркерам Cass1 и Сass2.

prunus spinosa генетический полиморфизм.

Рисунок 3 Распределение изученных образцов в пространстве главных координат полученное на основе данных генотипирования по IRAP маркерам Cass1 и Сass2.

Как видно из рисунков 2 и 3, формируется 3 кластера/группы генотипов. Анализируя распределение образцов по кластерам необходимо выделить группу 3, в которую вошли образцы Мукачевский 3, Мукачевский 31, Уманский 1 и Уманский 2. Данные образцы терна из коллекции Крымской опытной станции были отобраны на Украине. В кластер 1 вошли образцы, представляющие Кавказ и Северокавказский регион: Грузия (Боржоми), Армения (Люсахпюр 2) и Краснодарский Край (Таманский 20). Группа 2 наиболее разнородная по географическому происхождению, однако, необходимо отметить, что в него вошли три крупноплодных культивируемых образца терна (Терн вишневый, Терн абрикосовидный, Терн сверхобильный), которые были отобраны в культуру в Северокавказском регионе и один образец из республики Адыгея (Гузерипль).

Заключение

Учитывая результаты анализа полиморфизма, выявляемого IRAP маркерами Cass 1 и Cass 2, а также результаты кластерного анализа, можно сделать заключение о высоком уровне информативности данных ДНК-маркеров и перспективности их использования для изучения генетического полиморфизма вида Prunus spinosa. Они могут быть использованы для оценки полиморфизма, как на внутривидовом уровне, так и для анализа генетических взаимосвязей данного вида с другими видами, представляющими род Prunus.

• 1. Морозова Г. С. Отдаленная гибридизация и полиплоидия в селекции косточковых культур/ Г. С. Морозова, Г. В. Еремин // Аграрная наука. — 1981. — № 3. — С. 145.
• 2. Еремин Г. В. Происхождение и геномный состав терна и домашней сливы/ Г. В. Еремин, Г. Г. Половянов // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. — 1984. — № 3. — С. 24.
• 3. Zohary D. Domestication of Plants in the Old World / D. Zohary, M. Hopf // Oxford Uni versity Press, Oxford, United Kingdom, 2000.
• 4. Reales A. Phylogenetics of Eurasian plums. Prunus L. Section Prunus (Rosaceae), according to coding and non-coding chloroplast DNA sequences / A. Reales, D.J. Sargent, K.R. Tobutt, D. Rivera // Tree Genet. Genomes. — 2010. — № 6. — Р. 37−45.
• 5. Decroocq V. Microsatellite markers in the hexaploid Prunus domestica species and parentage lineage of three European plum cultivars using nuclear and chloroplast simple-sequence repeats / V. Decroocq L.S. Hagen, M.-G. Fave J.-P. Eyquard et al. // Molecular Breeding. — 2004. — № 13 — P.135−142
• 6. Dirlewanger E. Development of microsatellite markers in peach Prunus persica L. Batsch and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry Prunus avium L. / E. Dirlewanger, P. Cosson, M. Tavaud, M.J. Aranzana, et al. // Theor. Appl. Genet. — 2002. — № 105. — P. 127−138.
• 7. Downey S.L. Polymorphic DNA Markers in Black Cherry Prunus serotina are identified using sequences from Sweet Cherry, Peach and Sour Cherry / S.L. Downey, A.F. Iezzoni // J. of Am. Soc. of Hort. Science. — 2000. — № 125. — P.76−80.
• 8. Gharbi O. Characterization of accessions of `Reine Claude Verte' plumusing Prunus SRR and phenotypic traits / O. Gharbi, A. Wьnsch, J. Rodrigo // Scientia Horticulturae. — 2014. — № 169. — P.57−65.
• 9. Horvath A. Phenotypic variability and genetic structure in plum (Prunus domestica L.), cherry plum (P. cerasifera Ehrh.) and sloe (P. spinosa L.) / A. Horvath, E. Balsemin, J.-C. Barbot, H Christmann, et al // 2011. — № 129. — P. 283−293.
• 10. Yuyinga S. Analysis of genetic diversity in Japanese apricot (Prunus mume Sieb. et Zucc.) based on REMAP and IRAP molecular markers / S. Yuyinga, D. Xiajunb, W. Fei et al // Scientia Horticulturae. — 2011. — V.132. — P.50−58.
• 11. Murray M.G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA / M.G.Murray, W.F. Thompson // Nucleic Acids Research. — 1980. — № 10. — Р. 4321−4325.
• 12. Степанов И. В. Апробация IRAP маркеров на основе ретротранспозона кассандра для проведения анализа генетического полиморфизма в роде PRUNUS / И. В. Степанов, И. И. Супрун, С. В. Токмаков, И. М. Балапанов // Научный журнал КубГАУ [Электронный ресурс]. — Краснодар: КубГАУ. — 2014. — № 10 (104) Режим доступа http://ej.kubagro.ru/2014/10/pdf/55.pdf.
• 13. Senkova S. Utilization of IRAP technique for plums genotypes differentiation. / S. Senkova, J. Ziarovska, M. Bezo et al // Bioscience Research. — 2013. — V.10 (1). — P. 1−7.
• 1. Morozova G.S. Otdalennaya gibridizatsiya i poliploidiya v selektsii kostochkovykh kul’tur/ G.S. Morozova, G.V. Yeremin // Agrarnaya nauka. — 1981. — № 3. — S. 145.
• 2. Yeremin G.V. Proiskhozhdeniye i genomnyy sostav terna i domashney slivy/ G.V. Yeremin, G.G. Polovyanov // Doklady Rossiyskoy akademii sel’skokhozyaystvennykh nauk. — 1984. — № 3. — S. 24.
• 3. Zohary D. Domestication of Plants in the Old World / D. Zohary, M. Hopf // Oxford Uni versity Press, Oxford, United Kingdom, 2000.
• 4. Reales A. Phylogenetics of Eurasian plums. Prunus L. Section Prunus (Rosaceae), according to coding and non-coding chloroplast DNA sequences / A. Reales, D.J. Sargent, K.R. Tobutt, D. Rivera // Tree Genet. Genomes. — 2010. — № 6. — R. 37−45.
• 5. Decroocq V. Microsatellite markers in the hexaploid Prunus domestica species and parentage lineage of three European plum cultivars using nuclear and chloroplast simple-sequence repeats / V. Decroocq L.S. Hagen, M.-G. Fave J.-P. Eyquard et al. // Molecular Breeding. — 2004. — № 13 — P.135−142
• 6. Dirlewanger E. Development of microsatellite markers in peach Prunus persica L. Batsch and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry Prunus avium L. / E. Dirlewanger, P. Cosson, M. Tavaud, M.J. Aranzana, et al. // Theor. Appl. Genet. — 2002. — № 105. — P. 127−138.
• 7. Downey S.L. Polymorphic DNA Markers in Black Cherry Prunus serotina are identified using sequences from Sweet Cherry, Peach and Sour Cherry / S.L. Downey, A.F. Iezzoni // J. of Am. Soc. of Hort. Science. — 2000. — № 125. — P.76−80.
• 8. Gharbi O. Characterization of accessions of `Reine Claude Verte' plumusing Prunus SRR and phenotypic traits / O. Gharbi, A. Wьnsch, J. Rodrigo // Scientia Horticulturae. — 2014. — № 169. — P.57−65.
• 9. Horvath A. Phenotypic variability and genetic structure in plum (Prunus domestica L.), cherry plum (P. cerasifera Ehrh.) and sloe (P. spinosa L.) / A. Horvath, E. Balsemin, J.-C. Barbot, H Christmann, et al // 2011. — № 129. — P. 283−293.
• 10. Yuyinga S. Analysis of genetic diversity in Japanese apricot (Prunus mume Sieb. et Zucc.) based on REMAP and IRAP molecular markers / S. Yuyinga, D. Xiajunb, W. Fei et al // Scientia Horticulturae. — 2011. — V.132. — P.50−58.
• 11. Murray M.G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA / M.G.Murray, W.F. Thompson // Nucleic Acids Research. — 1980. — № 10. — R. 4321−4325.
• 12. Stepanov I.V. Aprobatsiya IRAP markerov na osnove retrotranspozona kassandra dlya provedeniya analiza geneticheskogo polimorfizma v rode PRUNUS / I.V. Stepanov, I.I. Suprun, S.V. Tokmakov, I.M. Balapanov // Nauchnyy zhurnal KubGAU [Elektronnyy resurs]. — Krasnodar: KubGAU. — 2014. — № 10 (104) Rezhim dostupa http://ej.kubagro.ru/2014/10/pdf/55.pdf.
• 13. Senkova S. Utilization of IRAP technique for plums genotypes differentiation. / S. Senkova, J. Ziarovska, M. Bezo et al // Bioscience Research. — 2013. — V.10 (1). — P. 1−7.