Сравнительные результаты иммуногистохимических исследований клеточного состава тимуса крупного рогатого скота

Сравнительные результаты иммуногистохимических исследований клеточного состава тимуса крупного рогатого скота

По исследованию вопросов морфологии тимуса крупного рогатого скота в странах СНГ имеется ряд научных работ [1−4].

Гатин И.М. (1990) исследовал морфогенез и клеточный состав тимуса у бычков разного возраста при откорме в индивидуальном секторе и в промышленных условиях. Состав и соотношение клеточных элементов тимуса бычков при откорме в индивидуальном секторе отражают антигеннезависимые изменения. Морфология тимуса 16-месячных бычков при откорме в промышленных условиях характеризуется большим разнообразием клеток, наличием значительного числа гранулоцитов, тканевых базофилов с выраженной деградацией, резким огрубением ретикулярных волокон стромы, мукоидным набуханием стенок сосудов микроциркуляторного русла. Выявленные изменения являются морфологическим эквивалентом возникновения аллергических реакций гиперчувствительности замедленного типа [1].

Применение кормовой добавки препарата «Привес-40» нормализовало морфологию тимуса, т. е. соотношение лимфоидных клеток коркового и мозгового вещества в сторону увеличения их количества в коре долек тимуса. При этом произошло снижение содержания эозинофильных гранулоцитов и тканевых базофилов.

Фомина Н.М. (1990) исследовала возрастную морфологию лимфоидных органов, в том числе тимуса у крупного рогатого скота в зависимости от различной степени двигательной активности [2].

У новорожденных телочек тимус имеет значительно развитую лимфоидную ткань, которая хорошо дифференцирована на корковое и мозговое вещество. Корковое вещество занимает большую площадь, чем мозговое. Тимус за период от новорожденного до девятимесячного возраста меняет свою топографию. Цвет органа изменяется от бледнорозового у новорожденных до серо-розового у 9 месячных, его консистенция с возрастом уплотняется. Форма тимуса становится лентовидной. В условиях гиподинамии тимусу характерна более ранняя возрастная регрессия. Этот процесс начинается у телят с 4 месячного возраста и отчетливо прослеживается к 9 месяцам, а у телят, получавших дозированное принудительное движение, признаков возрастной регрессии еще нет.

Сабирова Э.С. (2009) изучала строение и иннервацию тимуса крупного рогатого скота холмогорской породы в онтогенезе. По ее данным во всех исследованных этапах (плоды 5−8 — месячного возраста, новорожденные, 2-, 4 — месячные телята, 2 — летние животные) развития органа, тимус холмогорской породы имеет непарную грудную и парные шейные доли. Грудная доля располагается в предсердном средостении, а шейные тянутся вдоль трахеи по обе стороны, топография которых в возрастном аспекте не претерпевает значительных изменений. В постнатальном онтогенезе (у новорожденных, 2-, 4 — месячных телят, 2 — летних животных) изменение абсолютной массы тимуса неравномерное: у новорожденных телят — 152,64 ± 10,42 г., у 2- месячных телят — 113,11 ± 6,60 г., у 4 — месячных телят — 121,93 ± 5,92 г., у 2 — летних животных — 244,84 ± 9,87 г., а относительная масса органа неукоснительно снижается с 0,56 у новорожденных до 0,06 у 2 — летних животных. К 2 — летнему возрасту у животных происходит замещение части рабочей паренхимы на жировую ткань. При выраженной возрастной инволюции в дольках тимуса обнаруживаются кровеносные сосуды, с хорошо развитыми стенками и большое количество тимусных телец [3].

Фисенко С.П. (2010) с помощью морфологических и морфометрических исследований изучала динамику интенсивности роста и возрастные морфологические изменения тимуса телят черно-пестрой породы от рождения до восьмимесячного возраста. По ее данным тимус телят крупного рогатого скота представлен анатомически сформированным органом, состоящим из двух отделов — грудного и шейного и имеющим светло-серый цвет с розоватым оттенком [4].

Изучение гистологических изменений в тимусе телят в возрастном аспекте показало: период от рождения до семи месяцев постнатальной жизни характеризуется быстрым увеличением массы и объема железистой ткани, стабилизацией структуры, преобладанием коркового вещества над мозговым, возрастанием количества долек, увеличением плотности и усилением митоза тимоцитов в подкалсулярной зоне коры, количественным и качественным многообразием тимусных телец. Тимус в указанный период достигает максимального развития, что соответствует его высокой функциональной значимости как органа лимфоэпителиальной системы. Начиная с восьмимесячного возраста в тимусе появляются первые признаки инволютивных явлений: появление жировых клеток в соединительнотканых элементах железы, преобладание мозгового вещества над корковым, уменьшение плотности расположения клеток мозговой зоны и снижение митотической активности клеток корковой.

В научных трудах вышеуказанных авторов исследованы макроморфология, морфометрия, топографическая анатомия, клеточный состав тимуса на основе гистологических исследований в зависимости от возраста и условий содержания и отсутствуют исследования, посвященные дифференцировке популяции иммунокомпетентных клеток в тимусе.

Сегодня в развитых странах мира в гуманитарной и ветеринарной медицине морфологами и патологами широко применяются иммуногистохимические методы, которые дают возможность дифференцировать исследуемые клетки и показать их непосредственно в гистосрезах.

На сегодня полии моноклональные антитела, используемые для дифференцировки поверхностных маркеров лейкоцитов человека и пролиферации клеток, применяются в экспериментальной биомедицине, ветеринарной медицине для выявления лейкоцитов экспериментальных, домашних и диких животных [5−10].

Цель настоящей работы заключается в выявлении и демонстрации в парафиновых гистосрезах, фиксированных в формалине, структуры и клеточного состава тимуса крупного рогатого скота с помощью гистологических и иммуногистохимических методов.

Материалы и методы исследования

Работа выполнялась на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, гистологии и патологии факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Кыргызского национального аграрного университета им. К. И. Скрябина и в лаборатории иммуногистохимии и гематологии института ветеринарной патологии факультета ветеринарной медицины Гиссенского Университета (Гиссен, Германия, руководитель института — профессор Манфред Рейнахер).

После забоя 7 голов крупного рогатого скота в возрасте от 1,5 до 7 лет в убойных пунктах городов Ош и Бишкек все органы забитых животных были подвергнуты детальному осмотру для исключения каких-либо патологии в органах. При исследовании в тимусе отсутствовали макроскопические и гистологические изменения.

Объектом исследования служил тимус. Гистологическому исследованию подвергнуты все 7 голов крупного рогатого скота, а иммуногистохимическому исследованию 3 головы.

Кусочки от тимуса после детального осмотра были зафиксированы в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина в соответствии с методикой. После фиксации дальнейшая гистологическая процедура (обезвоживание и заключение в парафин кусочков) производилась в обычных лабораторных условиях (вручную) и в специальной машине в вакууме (автоматически). Из парафиновых блоков готовились серийные срезы на санном микротоме толщиной 4−6 мкм и на микротоме новой модификации толщиной 2−3 мкм. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином для описания и анализа общей гистокартины тимуса, селезенки и лимфатических узлов.

При иммуногистохимическом исследовании был использован РАР (peroxidase-antiperoxidase complex) метод для выявления Т-лимфоцитов, макрофагов и пролиферации клеток. Для выявления Т-лимфоцитов использовали антисыворотку Polyclonal Rabbit AntiHuman T cell, CD 3. Code No. A. 0452, (PAP); макрофагов — антисыворотку Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clone MAC 387. Code Nr. M0747 (PAP); пролиферацию клеток — антисыворотку Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone PC10. Code-Nr. M 0879 (PAP). При положительной реакции CD 3 положительные клетки (Тлимфоциты), клетки в состоянии пролиферации окрашивались в коричневый цвет, MAC 387 положительные клетки (макрофаги) — в темно-коричневый цвет.

Результаты исследований

Гистологически тимус крупного рогатого состоит из капсулы, междольковых перегородок и паренхимы. В паренхиме тимуса крупного рогатого скота в возрасте 1,5 лет имеются дольки, в которых четко дифференцированы корковое и мозговое вещество. Между дольками тимуса можно наблюдать наличие жировой ткани. В корковом веществе тимоциты располагаются густо, особенно, в подкапсулярной зоне. Из-за рыхлого расположения лимфоцитов, мозговое вещество выделяется светлой окраской. В мозговом веществе, помимо тимоцитов и макрофагов, выделяются тимусные тельца или тельца Гассаля (Рисунок 1а).

Рисунок 1 — Парафиновые срезы тимуса крупного рогатого скота.

Окраска гематоксилином и эозином. а. Активное морфофункциональное состояние тимуса с началом процесса инволюции. Четко выражено корковое и мозговое вещество тимуса. Небольшая часть паренхимы замещена жировой тканью. Возраст — 1,5 лет. bar=200µm; б. Выраженная возрастная инволюция тимуса. Отсутствует корковое вещество долек тимуса. Возраст — 7 лет. bar=100µm.

При сравнительном исследовании тимусных телец, можно выделить одноклеточные, мелкие и крупные слоистые тельца, а также слоистые тельца с кистозным перерождением. Тимус у крупного рогатого скота старшего возраста подвержен выраженной возрастной инволюции, которая на гистологических срезах характеризуется наличием большого количества жировой ткани, уменьшением площади паренхимы тимуса. В дольках тимуса отсутствуют корковое вещество. В отдельных местах паренхима тимуса полностью замещена жировой тканью (Рисунок 1 б).

Иммуногистохимические исследования парафиновых срезов тимуса крупного рогатого скота разных возрастов показали следующие результаты:

В тимусе крупного рогатого скота в возрасте 1,5 лет Тлимфоциты в большом количестве расположены в корковом веществе и умеренно в мозговом веществе (Рисунок 2 а).

Макрофаги расположены в междольковых перегородках, вокруг сосудов, в корковом и мозговом веществе, но в мозговом веществе количество макрофагов преобладает (Рисунок 3а).

В корковом и мозговом веществе тимуса, особенно в подкапсулярной зоне коркового вещества, отмечена интенсивная пролиферация тимобластов (Рисунок 4а).

Рисунок 2 — Иммуногистохимическое выявление Т-лимфоцитов в тимусе. РАР метод. а.

Масса Т-лимфоцитов в корковом веществе тимуса при его активном морфофункциональном состоянии. Возраст — 1,5 лет. bar=100µm.; б. Наличие Т-лимфоцитов только в мозговом веществе тимуса его при выраженной инволюции. Возраст — 7 лет. bar=100µm.

Рисунок — 3. Иммуногистохимическое выявление макрофагов. РАР метод. а.

Макрофаги в паренхиме тимуса. Возраст — 1,5 лет. bar=200µm; б. Увеличение макрофагов в паренхиме тимуса при ее выраженной возрастной инволюции. Возраст — 7 лет. bar=100µm.

В тимусе крупного рогатого скота в возрасте 7 лет при выраженной возрастной инволюции Тлимфоциты располагаются только в мозговом веществе (Рис. 2б), увеличено количество макрофагов, особенно в мозговом веществе (Рис. 3б), выявлена слабая пролиферация клеток в мозговом веществе (Рис. 4б).

Рисунок — 4. а. Иммуногистохимическое выявление пролиферации лимфоидных клеток. РАР метод.

Интенсивная пролиферация лимфоидных клеток в корковом и мозговом веществе тимуса при ее активном морфофункциональном состоянии. Возраст — 1,5 лет. bar=200µm; б. Ослабление митотической активности долек тимуса при выраженной его инволюции. Возраст — 7 лет. bar=100µm.

Выводы

Результаты проведенных гистологических и иммуногистохимических исследований позволяют нам сделать следующие выводы:

• 1. Исследован клеточный состав тимуса крупного рогатого скота в активном морфофункциональном состоянии и при возрастной инволюции.
• 2. Установлено, что Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3 антисыворотку можно использовать для выявления Т-лимфоцитов, Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clone MAC 387 антисыворотку — для выявления макрофагов, а Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone PC10 — для выявления пролиферирующих клеток в парафиновых срезах тимуса крупного рогатого скота, фиксированные в формалине.
• 3. Вышеуказанные полии моноклональные антитела в дальнейшем можно использовать при исследовании нормы и патологии тимуса крупного рогатого скота.
• 4. Впервые демонстрированы и показаны места локализации Т-лимфоцитов, макрофагов и митоза лимфоидных клеток в тимусе в активном морфофункциональном состоянии и при возрастной инволюции.

• 1. Гатин И. М. Биоморфология тимуса и селезенки крупного рогатого скота при откорме / Автореф. дис… канд. вет. наук 16.00.02. — Казань, — 20 с.
• 2. Фомина Н. М. Возрастная морфология лимфоидных органов у крупного рогатого скота в зависимости от различной степени двигательной активности / Автореф. дис… канд. биол. наук. 00.02. -Москва, 1990. — 20 с.
• 3. Сабирова Э. С. Особенности строения и иннервации тимуса крупного рогатого скота холмогорской породы в онтогенезе/ Автореф. дис… канд. биол. наук 16.00.02. — Казань, 2009. -22 с.
• 4. Фисенко С. П. Морфологическая характеристика щитовидной железы и тимуса молодняка крупного рогатого скота черно-пестрой породы/ Автореф. дис… канд. биол. наук 06.02.01. — Саранск, 2010. — 20 с.
• 5. Mackay C. Sheep leukocyte molecules: a review of their distribution, structure and possible function. Vet. Immunol. Immunopathol. 1988. — 19. -p. 1−20.
• 6. Иргашев А. Ш., Алдаяров Н. С. Демонстрация иммунокомпетентных клеток в периферических органах иммуногенеза у клинически здоровых собак // Вестник КАУ,№ 2(6), Бишкек, 2006. С. 85−89.
• 7. Иргашев А. Ш., Асанова Э. И., Manfred R. Выявление иммунокомпетентных клеток в лимфатических узлах яка// Вестник КАУ, № 1(7), Бишкек, 2007. -С. 165 —
• 8. Иргашев А. Ш., Асанова Э. И., Manfred R. Иммуноморфология селезенки яка // Исследования, результаты, № 3, 2 -С. 105 — 108.
• 9. Марасулов А. А., Алдаяров Н. С., Иргашев А. Ш. Возрастная морфология тимуса у домашних кроликов //Вестник Кыргызского национального аграрного университета. -№ 4 (15). — С. 162−168.
• 10. Irgashev, Mitrofanov B., Arbaev K., Gutberlet K., Rudolph R. Demonstration of Tand Blymphocytes and proliferative cells in formalin-fixed paraffin embedded thymus, lymph nodes and spleen of clinically healthy sheep.// Материалы 1-международного ветеринарного конгресса, Алматы, 2002. -С. 108−110.