Основная часть. 
Критерии идентификации электрофоретического спектра для целей сортового контроля и сертификации

Результаты, используемые для оценки базовых критериев идентификации белкового электрофоретического спектра, были получены в рамках практической деятельности Испытательной лаборатории качества семян в системе сортового контроля, осуществляемого в Республике Беларусь. Основываясь на специфике работы, предъявляемым требованиям к процедуре оценки сортовой чистоты с использованием метода электрофоретического анализа запасных белков семян, были оценены, отработаны имеющиеся подходы в данной области. Причем отработка имеющихся подходов и адаптация их к специфике сортового контроля проводилась по группам сельскохозяйственных растений, имеющих отличия как по типу используемых белковых систем, так и по своим генетико-селекционным особенностям.

Идентификация белковых компонентов спектра, основанная на оценке их относительной электрофоретической подвижности, позволила выявить объективность данного метода вне зависимости от условий проведения анализа. В целом особенности данного метода идентификации можно выразить рядом базовых позиций:

• — применение данного метода возможно только в случае полного нивелирования собственного заряда белковой молекулы, что недостижимо в условиях стандартного нативного гель-электрофореза;
• — в случае использования «маркерных» позиций (белковых компонентов) какого-либо сорта первоначальный анализ последнего следует проводить в условиях градации компонентов только по их молекулярному весу;
• — создание «общего», одинакового заряда белковых молекул возможно только в условиях, создаваемых при использовании электрофореза в комплексе с ДДСNa (додецилсульфат натрия). Именно в данных условиях будет наблюдаться прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой белка и их относительной подвижностью;
• — на основе использования данного метода возможно оценить как молекулярные массы неизвестных белков (позиций белкового спектра), так и относительную электрофоретическую подвижность на основе обратного калибровочного графика.

Определение молекулярных масс белков по подвижности осложняется различиями в их зарядах, связанных с различиями в первичной структуре. Нивелирование этих различий достигается при образовании комплексов белков с додецилсульфатом натрия (ДСН или SDS) (рис. 1).

Рис. 1. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат)

Примечание. 1 — сывороточный альбумин; 2 — яичный альбумин; 3 — пепсин; 4 — химотрипсиноген; 5 — миоглобин; 6 — цитохром с; Х — белок с неизвестной молекулярной массой.

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсульфата натрия, приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью гель-электрофореза белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что электрофоретическая подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму ее молекулярной массы и выражается линейной зависимостью.

Для применения данного метода идентификации компонентов необходимо использовать калибровочные наборы белков с известной молекулярной массой. Однако это также не является полной гарантией получения линейной зависимости молекулярной массы от подвижности компонента. Как установлено в наших исследованиях, только использование правильных рабочих стоковых растворов формирует такую молекулярную решетку гелевого носителя, в которой эффект разделения белковых компонентов прямо пропорционален их молекулярной массе.

В ходе практической работы вышеуказанная методика используется нами для идентификации белковых компонентов 11S-глобулинов зернобобовых культур и построения калибровочных спектров по пшенице, ячменю, овсу, тритикале.

Согласно методике определения для семян зернобобовых культур [17], для идентификации белковых компонентов используется «скользящая соевая шкала», градуированная с учетом условий хода фракционирования белков и позволяющая идентифицировать компоненты в виде сортовой белковой формулы. В качестве реперных позиций компонентов рекомендуется использовать стабильный спектр, полученный на основе фракционирования белков культурной сои. Однако именно на данном этапе нередко возникают затруднения с правильной идентификацией маркерных компонентов спектра сои, что может повлиять на результативность анализа в дальнейшем.

Вместе с тем возможно точное нахождение относительной электрофоретической подвижности неизвестных компонентов, если использовать калибровочный график, построенный для данного типа гелевого носителя с использованием тех маркеров молекулярного веса (набора стандартных белков), размах величин молекулярного веса которых перекрывает размах оцениваемых белков примерно на 10−20 кДа.

Определив таким образом относительную подвижность стандартных белков, возможно точное определение этого же параметра и у реперных позиций белкового спектра сои.

В отношении запасных белков зерновых возможно применение такой же модели на этапе построения калибровочного спектра сорта-стандарта, на основе реперных компонентов которого можно идентифицировать остальные позиции спектра. Однако в данном случае следует делать поправку с учетом того, что оценка подвижности реперных компонентов происходит в системе SDS-электрофореза, а фракционирование испытываемых проб — в алюминий-лактатном буфере (рН 3,1−3,3), где накладывается эффект собственного заряда белковых молекул.

Для определения относительной электрофоретической подвижности также можно использовать метод, практикующийся в гель-хроматографии, активно используемый в целом ряде биохимических лабораторий. Суть этого метода основана на специфике маркерного лидирующего красителя, добавляемого совместно с буфером нанесения к экстракту фракционируемого белка, что выражается в гораздо большей подвижности маркера в сравнении с самым быстроподвижным белковым компонентом белка.

В целом принцип идентификации спектра основан на сопоставлении относительной электрофоретической подвижности оцениваемого белкового компонента и подвижности лидирующего красителя (рис. 2).

Рис. 2. Критерии идентификации белковых компонентов электрофоретического спектра пшеницы и тритикале

Примечание. Rf (а) — расстояние, пройденное лидирующим красителем;

Rf (b) — расстояние, пройденное белковым компонентом.

В данном случае значение относительной подвижности белкового компонента вычисляют по формуле.

Rf = (Rpr / Rcol) • 100, (1).

где R_f — относительная подвижность белкового компонента;

R_pr — расстояние, пройденное белковым компонентом от стартового кармана геля (мм);

R_col — расстояние, пройденное лидирующим красителем от стартового кармана геля (мм).

Значение R_col при оптимальных условиях электрофоретического фракционирования, как правило, совпадает с размером гелевой пластины, на которой проводят разгонку белка. Идентифицированные значения относительной подвижности (с коэффициентом равным 100) по отдельным белковым компонентам будут соответствовать порядковому номеру позиции.

Таким образом, описанные выше способы идентификации белковых компонентов позволяют наиболее четко оценить компонентную представленность анализируемого образца, его внутреннюю структуру (полиморфность или однородность), сформировать «белковую формулу» для целей составления каталога. Вместе с тем использование данных подходов в системе сортовой идентификации допустимо только в случае наработок в виде комплексного каталога, включающего максимально большое число вариантов сочетаний компонентного состава (сортовых белковых формул и электрофоретических спектров сортов и их белковых биотипов). Определенные трудности в данном случае вызывает идентификация форм перекрестноопыляемых культур или культур, имеющих сложную генетическую природу (тритикале, сахарная свекла), в связи с тем что внутренняя структура, определяемая методом электрофореза, представлена не двумя-тремя белковыми биотипами, а гораздо большим числом (иногда превышающим 10−12 биотипов). В таком случае довольно сложно идентифицировать сортовую принадлежность образца путем сравнения со всеми возможными биотипами. Для таких вариантов рекомендуется использовать калибровочный график на основе стандартных белков и на его основе определять подвижность (а, следовательно, и номер позиции) суммарного белкового спектра основных (занимающих наибольшую долю в популяции) белковых биотипов. Следует отметить, что подход, основанный на использовании суммарного электрофоретического спектра анализируемой формы, является одним из позиций международного стандарта ISO 8981:1993(Е) в области контроля качества семян с помощью электрофореза [10].

Наряду с критериями идентификации белковых компонентов, большое значение также имеют критерии оценки сортовой чистоты в рамках сортового контроля. Если в случае идентификации сорта необходимо использовать каталоги максимального разнообразия видовых форм, то в случае оценки сортовой чистоты дополнительно — каталоги оригинальных электрофоретических спектров и сортовых формул всех сортов, внесенных в Реестр сортов и древесно-кустарниковых пород. Однако следует заметить, что использование каталогов допустимо только в случае полной воспроизводимости методики определения, любое нарушение условий воспроизводимости может повлечь искажение визуальной картины распределения белковых компонентов и, как следствие, к неправильной оценке сортоспецифичных компонентов спектра (таблица).

Сравнительная оценка относительной подвижности с использованием разных критериев оценки

Примечание:

• 1 — графическое изображение спектра (модельная матрица);
• 100 — значения приведены для образца со 100-%ной сортовой чистотой;
• *- БСА;
• ** - овальбумин;
• *** - эндонуклеаза рестрикции

Как наглядно свидетельствуют данные таблицы, при нарушении условий воспроизводимости методики определения, что может быть вызвано как человеческим фактором, так и технологическими неточностями в ходе анализа, получаемая картина распределения сортовых маркерных компонентов спектра может отличаться от ранее идентифицированной и, как следствие, вывод о сортовой чистоте будет некорректен.

Результаты практической работы наглядно показывают, что наиболее оптимальным, объективным и менее зависящим от условий воспроизводимости анализа является использование белкового экстракта оригинальных семян оцениваемого образца. В данном случае белковый экстракт оригинальных семян сорта наслаивается в два-три кармана в центре гелевой пластины в том же объеме и при тех же условиях, что и оцениваемый образец. В результате вне зависимости от условий фракционирования белка будет получена картина белкового спектра, на которой возможно корректно сопоставить маркерные позиции аутентичного образца (белок оригинальных семян) и оцениваемого сорта.

Таким образом, на основе многократной практической апробации подходов к идентификации компонентов белкового спектра, осуществляемой в рамках разработки методик определения для целей сортового контроля, установлена универсальность и приемлемость их для целей сортовой идентификации, сортовой дифференциации, оценки внутренней структуры сортов, линий, биотипов. Вместе с тем, несмотря на приемлемость данных методов идентификации, их следует применять в условиях использования стандартизированных и унифицированных методик определения актуализированных в области, аккредитации всех профильных лабораторий, использующих метод электрофоретического анализа.