Система ommp. 
Стабилизация мРНК злаков in vitro под влиянием кремния

В 90-е годы ХХ века было показано тождество закономерностей Mg-зависимого распада мРНК в живой клетке (in vivo) и в водных растворах (in vitro) [20−23]. Это было сделано в ходе двуциклической хроматографии РНК уже только методом аффинной хроматографии на поли-(У)-сефарозе, который является основным методом, позволяющим отделить полиаденилированную мРНК от общего пула РНК клетки.

Суть метода, как известно, состоит в том, что препарат тотальной РНК пропускают через колонку с аффинным носителем в растворе, содержащим относительно высокую концентрацию соли. В этих условиях полимеры носителя (поли-У) гибридизуются с поли-(А)±мРНК и связывают её; рибосомная и транспортная РНК не связываются с аффинным сорбентом. Поли-(А)±мРНК элюируется с колонки слабосолевым раствором при повышенной температуре (50−60оС). Существенным моментом выделения мРНК является возможность доочистки ее от неспецифической примеси рибосомной РНК путем повторного цикла аффинной хроматографии, т. е. получения поли-(А)+±мРНК.

В ходе выделения мРНК из проростков пшеницы, ячменя и созревающего зерна кукурузы были отмечены систематические изменения процентного выхода поли-(А)+±мРНК от количества поли-(А)±мРНК, впоследствии названного индексом стабильности мРНК (ИС мРНК), отражающим особенности генетики и физиологического состояния растения. Таким образом появилась возможность разработки молекулярно-кинетических маркёров, позволяющих количественно оценивать эффект взаимодействия «генотип-среда», то есть, норму реакции организма, изменение которой является основной целью селекции.

И сделано это на основе простого метода оценки относительной стабильности мРНК, который получил название ommp-системы, от латинского выражения «omnia mea mecum porto» — «все свое ношу с собой», так как есть основания предполагать наличие у самих молекул мРНК всех необходимых для дифференциального распада факторов, устойчивых к действию депротеинизирующих агентов, традиционно используемых для очистки РНК (фенол, хлорофором, додецилсульфат натрия, протеиназа К, диэтилпирокарбонат и др.). Система не зависит полностью от основного клеточного метаболизма, хорошо воспроизводима и позволяет проводить исследования относительной стабильности мРНК на широком биологическом материале в сравнительно простых экспериментах [18, 23, 26].

Закономерному распаду мРНК могут быть две причины: фракционирование или распад мРНК в ходе хроматографии. Фракция РНК, которая не сорбировалась поли-У-сефарозой при повторном нанесении на неё поли-(А)±мРНК («проскок»), собирали и подвергали исследованию ионообменной хроматографией на колонке МАК. При этом только 10% материала сорбировалось на МАК — это свидетельствует о том, что в «проскоке», помимо рибосомной РНК, присутствовало большое количество низкомолекулярных продуктов деградации РНК.

Логично было предположить, что распад мРНК осуществляют следовые примеси свободных РНКаз в высокоочищенных препаратах РНК. Для проверки этого предположения смешивали в соотношении 1:1 два препарата суммарной РНК, контрастно различающихся по выходу поли-(А)+±мРНК. Каждый раз подобный эксперимент давал рассчитанный средний выход поли-(А)+±мРНК ±1.0%. Кроме того, препарат поли-(А)+мРНК, сорбированный на поли-У-сефарозе, подвергали обработке проназой и протеиназой К, но это не отражалось на выходе поли-(А)+±мРНК. Эти факты доказывают отсутствие свободных РНКаз и позволяют предположить, что разрушение мРНК производится ассоциированными РНКазами [21,26].

Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что остановка синтеза белка в клетках эукариот циклогексимидом приводит к стабилизации короткоживущих мРНК. Это связывают с наличием у эукариот специфических короткоживущих РНКаз, которые быстро распадаются в условиях блокады синтеза белка.

Введение

циклогексимида в початок кукурузы (4 мг/початок, 5 ч) приводило к увеличению выхода поли-(А)+±мРНК с 40 до 80%; аналогичная обработка циклогексимидом зелёных проростков пшеницы Краснодарская 39 (20 мкг/мл раствора под корни, в течение 5 часов) также приводила к увеличению выхода поли-(А)+±мРНК с 15 до 80%. Эти факты позволили сделать предположение о том, что в ходе аффинной хроматографии происходит не только доочистка мРНК от примесей рибосомной РНК, но и частичный распад мРНК, чему, возможно, способствуют короткоживущие белки [26].

Однако являются ли эти короткоживущие белки рибонуклеазами или они участвуют в распаде мРНК in vitro опосредовано? Возможно, гипотетические короткоживущие белки участвуют в синтезе комплекса, определяющего явление РНК-интерференции. Здесь важно подчеркнуть, что последующее обнаружение длинных полиаденилированных некодирующих РНК (нкРНК) [16, 26] теоретически позволяет объяснить молекулярный механизм тождественности магний-зависимого распада РНК in vivo и in vitro тем, что в пуле поли-(А)+мРНК в обоих случаях имеются РНК-интерференции (iRNA), осуществляющие дифференциальный распад мРНК за счёт Mg+±зависимых рибозимных процессов.

Вторым, очень важным фактом, установленным в ходе изучения варьирования выхода поли-(А)+±мРНК, было то, что этот процесс является Mg+±зависимым. Потеря ионов магния в ходе выделения РНК приводила к нивелированию каких-либо различий по генетике или физиологии изучаемых объектов.

В основе понимания функционирования системы ommp лежит постулат об отсутствии принципиальных различий между механизмами высокоспецифического и неспецифического, катализируемого ионами двухвалентных металлов, гидролиза РНК, аналогичного щелочной и кислотной деградации РНК, но проходящей при невысокой температуре и, часто, при нейтральных значениях рН. Степень и интенсивность распада РНК определяется условиями выделения препарата РНК из тканей растений, которые влияют на состав, количество катионов металлов и особенности их взаимодействия с молекулами РНК.

По данным, полученным методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии, типичные условия, которые применялись для выполнения работ по изучению стабильности суммарной поли-А-содержащей мРНК и ген-специфических мРНК в системе ommp обеспечивали в составе высокомолекулярного препарата РНК содержание максимально до 4,0% катионов магния.

К типичным условиям следует отнести: 1) обеспечивающий защиту РНК от деградации РНКазами состав экстрагирующего буфера: 0, 2 М Трис-НCl, рН 8,5; 0,05 М MgCl2; 2) осаждение нуклеиновых кислот этиловым спиртом без подкисления (осадок хорошо формируется за счёт большой концентрации триса и наличия катионов магния в буфере А); 3) переосаждение препарата РНК концентрированным депротеинизирующим раствором в конечной концентрации: 4 М LiCl; 4 М мочевина.

Соли РНК в водном растворе подвергаются гидролизу, определяющему, как известно, кислотность раствора в зависимости от силы основания и кислоты. При вышеуказанных условиях выделения рН водного препарата РНК был около 10, что, вероятно, обусловлено слабощелочными свойствами гидрата окиси магния (или кумулятивным эффектом всех катионов, взаимодействующих с РНК). Распад РНК происходит и в присутствии других катионов двухвалентных металлов (марганец, кобальт, железо), гидрат окиси, которых имеет нейтральное значение, однако скорость деградации возрастает при повышении рН [23, 26].

Предположительно, в РНК остаются только так называемые сайт-специфические катионы магния, относительно прочно связанные с молекулой РНК, в отличие от диффузных катионов магния, легко теряемых при выделении.

Осаждение РНК этиловым спиртом, подкисленным ацетатом калия (натрия) рН 5,3 или уксусной кислотой, приводило к значительному снижению содержания катионов магния в препарате РНК и обусловливало значение рН раствора в пределах 5−6. При этом способность РНК к самораспаду резко ослабевала. Вероятно, в этих условиях утрачивается не только диффузные катионы магния, но и часть сайт-специфического магния [26] .