Теоретические аспекты функционирования электрохимических биосенсоров

Электрохимическая детекция в прямых (безмедиаторных) биосенсорах основана на прямом каталитическом переносе электронов между поверхностью чувствительного элемента сенсора электрода и активным центром биораспознающего реагента. Перенос электронов может происходить непосредственно на поверхности электрода либо на предварительно модифицированнои? его поверхности, обеспечивающеи? прямои? перенос электрона.

К медиаторам, обеспечивающим работу биосенсоров, предъявляются следующие основные требования:

• 1) медиатор должен быстро реагировать с восстановленнои? формои? биораспознающего фермента;
• 2) гетерогенные реакции с участием медиатора должны быть обратимы;
• 3) перенапряжение процесса регенерации окисленного медиатора должно быть низким и не зависеть от рН;
• 4) медиатор должен быть устои? чивым как в окисленнои?, так и в восстановленнои? форме;
• 5) восстановленныи? медиатор не должен реагировать с кислородом;
• 6) медиатор должен быть нетоксичным.

Выбор медиатора с учетом указанных требовании? осуществляется, исходя из окислительно-восстановительных свои? ств активного центра биохимического реагента.

Биосенсоры — это система на основе амперометрических ферментных электродов, которые генерируют сигнал, пропорциональныи? концентрации субстрата и независимыи? от содержания медиатора или кофермента. Из биосенсоров наибольшее развитие и применение получили системы на основе ферментов в качестве биораспознающего компонента. При адсорбции ферментов на твердых поверхностях (металлы, керамика, полимеры) они частично или полностью сохраняют свою структуру и каталитическую активность, которая в ферментных биосенсорах проявляется в ускорении процесса обмена электронами между субстратом и поверхностью электрода.

Одним из ферментов, которые используются в биосенсорах непосредственно в качестве биокатализатора или в качестве метки, является пероксидаза хрена.

Структура и механизм деи? ствия пероксидазы хрена:

Пероксидаза — один из наиболее распространенных ферментов, содержащии? ся в растениях, микробах, тканях животных. Этот фермент катализирует окисление широкого спектра органических соединении? перокси водорода с образованием токсичных пероксидов, удаляющихся из живых организмов. Пероксидаза представляет собои? гликопротеид, состоящии? из полипептиднои? цепи, формирующеи? двухдоменную глобулу, и гемовои? простетическои? группы с атомом железа, располагающеи? ся между доменами.

Основнои? отличительнои? особенностью в структуре пероксидазы хрена по сравнению с другими растительными пероксидазами является наличие участка длинои? в 34 аминокислотных остатка между спиралями остатков фенилаланина (F) и глицина G (рис. 1). Эта область, которая является частью канала для доступа субстрата, не встречается у пероксидаз других классов, более того она имеет отличия даже в пределах своего класса, например, в сравнении с арахисовои? пероксидазои?. Для пероксидазы С хрена, характеризующеи? ся большеи? F-G-вставкой. Изофермент С пероксидазы хрена уникален тем, что имеет кольцо из трех периферии? ных остатков Phe142, Phe68 и Phe179, которое защищает подход к подвергающемуся воздеи? ствию краю гема. Эта ароматическая область важна для реализации способности пероксидазы связывать ароматические субстраты.

Особенностью процессов пероксидазного катализа является образование ряда спектрофотометрически различимых комплексов. В реакции пероксидазного окисления, помимо пероксида водорода, в качестве окислителя (первого субстрата) могут выступать органические субстраты — алкилгидропероксиды, пероксибензольные кислоты и др. По отношению ко второму субстрату пероксидаза проявляет меньшую специфичность, поэтому целыи? ряд электронодонорных соединении? могут использоваться в качестве субстратов пероксидазы и являться основои? детектирующих систем в методах аналитическои? биохимии и клиническои? медицины.

Важным направлением в развитии ферментативных методов анализа является использование сопряженных реакции?, катализируемых различными ферментами. Сопряженными называются ферментные системы, в которых продукты первои? ферментативнои? реакции служат субстратами для второи? реакции и так далее. Используя сопряженные реакции, можно существенно повысить чувствительность анализа, а также упростить детектирование определяемого вещества. В биосенсорах, основанных на использовании сопряженных систем, на поверхности электродов иммобилизуют совместно два разных фермента; конечные продукты реакции определяют электрохимическими методами.

На основе сопряженных полиферментных систем разработан ряд биосенсорных устрои? ств для определения L-аминокислот, глюкозы, лактата, оксалата и множества других соединении?. Классическим примером таких устрои? ств являются биосенсоры для определения глюкозы. В этих биосенсорах на поверхности электродов совместно иммобилизованы глюкозооксидаза и пероксидаза. Окисление глюкозы сопровождается образованием пероксида водорода, ферментативное восстановление которого с участием пероксидазы детектируется электрохимически. ованных меркаптоэтиламином.

Иммунобиосенсоры с пероксидазои? хрена в качестве метки Пероксидаза применяется в качестве метки одного из биокомпонентов в биосенсорах, основанных на принципах иммунохимического распознавания. В этих биосенсорах осуществляется реакция антиген— антитело, что существенно улучшает специфичность распознавания определяемого вещества в образцах сложного состава, а использование фермента значительно повышает чувствительность метода. Благодаря относительно невысокои? стоимости пероксидазы в сравнении с флуоресцентными или радиоактивными метками, биосенсоры с пероксидазои? в качестве метки получили широкое распространение.

Иммуносенсоры имеют преимущество при выполнении анализов, когда требуется высокая чувствительность определения. Это необходимо в медицинскои? практике для диагностики различных биологически активных соединении?, для контроля качества продуктов питания, экологического контроля объектов окружающей среды на наличие остаточных количеств загрязнителеи? и токсикантов. Иммуносенсоры особенно перспективны для проведения медицинских исследовании?, так как они обеспечивают необходимую чувствительность и специфичность при анализе сложных по составу биологических жидкостеи?. Недостаточно широкое внедрение биои иммуносенсоров в медицинскую практику связано с тем, что они не позволяют, как правило, определять несколько соединении? одновременно Очень интересен и перспективен ДНК-сенсорныи? метод, основанный на способности пероксидазы окислять производные тирамина с образованием промежуточных высокоактивных радикальных частиц, которые затем могут ковалентно связываться с поверхностью белковои? глобулы фермента в непосредственнои? близости от активного центра фермента — источника их образования. Радикальные частицы, иммобилизованные на поверхности вблизи фермента, могут быть также выявлены конъюгатом стрептавидинпероксидаза. Таким образом, на поверхность вводятся дополнительные молекулы пероксидазы, что обеспечивает расширение диапазона аналитического сигнала.

В настоящее время потребность в биосенсорах огромна, поскольку они не требуют сложного или дорогого оборудования, могут использоваться в полевых условиях и даже быть имплантированы в человеческии? организм для непрерывного мониторинга различных биологически активных соединении?.

Основное ограничение использования биосенсоров в области медицины и охраны окружающеи? среды связано с необходимостью применения одного типа сенсора для определения только одного соединения. Развитие принципов биосенсорного анализа направлено на решение задачи определения нескольких веществ одновременно. В мультибиосенсорных устрои? ствах пероксидаза хрена сохраняет свои преимущества как компонент сопряженных ферментных систем, так и в качестве метки биораспознающего элемента.

Биосенсоры на основе уреазы для обнаружения тяжёлых металлов использовались для количественной оценки общего загрязнения воды ионами тяжёлых металлов.