Применение полимеразной цепной реакции в медицине

В статье приведены данные о возможностях применения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в медицине. Описаны принцип и преимущества ПЦР как метода диагностики по сравнению с другими методами (ИФА, бакпосев). Определено, что ПЦР применяют в медицине для диагностики инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний, а также в персонализированной медицине. В статье рассмотрены возможности применения метода ПЦР для диагностики некоторых бактериальных и вирусных инфекций, передающихся половым путем, гепатитов, а также некоторых наследственных и онкологических заболеваний. Отмечено, что в персонализированной медицине ПЦР применяют для определения индивидуальных различии пациентов в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных.

Полимеразная цепная реакция, известная более как ПЦР, не сходит со страниц научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 г., за что он и был удостоен Нобелевской премии в 1993 г. [1]. Часто ПЦР описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. «Иглой» является крошечный фрагмент генетического материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естественное свойство ДНК — репликацию (размножение), делает его копии.

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) — способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участкам НК-мишени. Прай-мер — самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонук-леотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus). Указанную выше реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых нуклеиновых кислот.

Типичная ПЦР-амплификация состоит в многократном повторении следующих реакций: полимеразный бактериальный гепатит онкологический.

• · Денатурация. Первый этап ПЦР состоит в тепловой денатурации образца ДНК выдерживанием его при температуре 95 °C в течение 1 мин. Помимо ДНК, в реакционной смеси содержатся в избытке 2 праймера, термостабильная ДНК-полимеразаTaq и 4 дезоксирибонуклеотида.
• · Ренатурация. Температуру смеси медленно понижают до 55 °C, при этом праймеры спариваются с комплементарными последовательностями ДНК.
• · Синтез. Температуру повышают до 75 °C величины, оптимальной для ДНК-полимеразыTaq. Начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3'-гидроксильной группой праймера [2].

Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате — термо-циклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30−50 раз, в соответствии с заданной программой термоциклера. В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии. Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксировано искусственно синтезированным праймером.