Гуморальные факторы регенерации поврежденной почки

Важным моментом в изучении механизмов регенерации поврежденной почки является выяснение вопроса, каким путем происходит активация ранее неактивных СК. Предполагается, что сигналом, активирующим СК, могут быть некоторые внутриклеточные компоненты, выделяемые погибшими клетками.

Развитие острой почечной недостаточности независимо от ее генеза сопровождается гибелью более или менее значительной части эпителия почечных канальцев. I. Grgic и соавт. показали, что индукция апоптоза эпителиальных клеток проксимальных почечных канальцев стимулирует пролиферацию выживших клеток канальцевого эпителия [41]. Индукция острой почечной недостаточности введением циспластина крысам приводила к пролиферации клеток почечных канальцев с наибольшей выраженностью в наружной пластинке мозгового вещества почки. Там же наблюдалось и наиболее выраженное повреждение почечных канальцев [42].

«Сигналами опасности», выделяемыми погибшими клетками, могут служить ядерные белки, такие как белки высокой подвижности группы В1 или гистоны, которые активируют иммунную систему через распознающие рецепторы? Toll-like-рецепторы (TLR) [43]. Показана активация сигнальных путей через TLR и выделение ядерного фактора высокой мобильности группы В1 и гистонов в интерстиций при острой почечной недостаточности, вызванной ишемией или нефротоксическим фактором [44]. Кроме этого «сигналами опасности» могут служить небелковые молекулы, устойчивые к нагреванию, в частности, простаноиды и АТФ, выделяющиеся из апоптозных клеток, которые также могут быть инициаторами процесса клеточной регенерации. При облучении культуры почечных клеток ультрафиолетом, вызывающего гибель значительной части клеток, в супернатанте выявляли повышенную концентрацию АТФ. Добавление этого супернатанта в культуральную среду стимулировало пролиферацию культивируемых клеток, а дополнительное добавление в нее ингибиторов пурин-эргических сигнальных путей (апиразы или сурамина) уменьшало выраженность этого эффекта [42].

Активация СК приводит к повышению их пролиферативных и секреторных свойств. При этом если ранние исследования связывали действие СК различного происхождения с их высокой пластичностью и действием в качестве ткане-специфичных прогениторных клеток, способных интегрироваться в тканевые структуры и замещать поврежденные клетки с ткане-специфичной дифференцировкой, то в более поздних исследованиях их действие все больше связывают с генерацией этими клетками широкого спектра таких биоактивных молекул, как цитокины, хемокины, ангиогенные факторы и факторы роста, которые объединяют термином «секретом» стволовых клеток [45 [. Многие исследования подтверждают, что именно секретом и его ауто-кринно/паракринные эффекты стимулируют регенерацию поврежденных клеток и этот механизм вносит бОльший вклад в терапевтическое действие СК, чем их тканеспецифичная дифференцировка [46].

В ряде исследований было показано, что экзогенно введенные МСК являются относительно коротко живущими клетками после миграции в зону действия, и практически не встраиваются в новообразованные ткани [47]. Их действие может реализоваться через секрецию биоактивных факторов, способных тормозить апоптоз, рубцевание ткани, стимулировать ангиогенез и оказывать иммуномодулирующее действие.

Предполагается, что секретом СК кодируется около 10% генома человека, регулирующего широкий спектр сывороточных белков, факторов роста, ангиогенных факторов, гормонов, цитокинов, белков внеклеточного матрикса, протеаз внеклеточного матрикса и в меньшей степени липидных медиаторов и генетического материала [48]. Секретируемые молекулы выделяются СК через классический и неклассический механизмы секреции, включая транслокацию белков, экзоцитоз и инкапсуляцию везикул или экзосом [49]. Они могут действовать как непосредственно на поврежденные клетки, так и опосредованно, путем индукции секреции функционально активных молекул неповрежденными клетками окружающих тканей.

Неклассический вариант секреции молекул, включая фактор роста фибробластов и семейство цитокинов, может происходить путем прямой транслокации белков через клеточные мембраны или выделение в виде везикул, покрытых белковой или мембранной оболочкой (микровезикулы, экзосомы, апоптотические тельца) [48,50]. Экзосомы, выделяемые МСК, содержат различные белки, липиды и функционально активную РНК (мРНК, микроРНК), играющих важную роль в межклеточных взаимодействиях.

[50]. Апоптотические тельца являются продуктами распада клеток, подвергшихся апоптозу, и могут служить активаторами сигнальных путей, связанных с регенерацией поврежденных клеток [51].

Внеклеточные везикулы, образованные клетками почки, могут быть выделены из мочи. Протеомный анализ показал, что они преимущественно являются экзосомами, происходящими из апикальной плазматической мембраны канальцевого эпителия и лишь незначительная часть происходит из собирательных трубочек или попадает в мочу с фильтратом в почечных клубочках [52]. Также установлено, что значительная часть внеклеточных везикул несет маркеры почечных прогениторных клеток (CD133+ и CD24+), что позволяет предполагать их паракринное действие на функцию нефрона. Внеклеточные везикулы из проксимальных отделов нефрона могут захватываться эпителиальными клетками дистальных канальцев, влияя на их функциональную и пролиферативную активность [53].

Экзогенное введение внеклеточных везикул модулирует действие различных типов клеток, влияя на такие процессы, как активность клеточной пролиферации, ангиогенез и иммунную толерантность. Выраженный биологический эффект оказывают внеклеточные везикулы из мезенхимных клеток различного происхождения? почек, костного мозга, жировой ткани, пупочного канатика. Их однократное введение ускоряет функциональное восстановление почки после острой почечной недостаточности, вызванной токсическим действием глицерина или ишемическим повреждением, а также развитие хронической болезни почек [54,55]. При остром повреждении почек их действие в значительной степени связано с подавлением апоптоза и стимуляцией регенерации выживших эпителиальных клеток [55,57], а при хронической болезни почек? в сохранении микроциркуляторного русла, замедлении развития гломерулосклероза и тубулоинтерстициального фиброза [56].

Только внеклеточные везикулы из малодифференцированных клеток обладают нефропротективным действием, поскольку везикулы из зрелых фибробластов не улучшают функцию поврежденной почки [55−57].

Развитие исследований по изучению возможных механизмов стимуляции регенерации поврежденной почки при действии СК привел ряд авторов к выводу о возможности использования только секрета СК без самого клеточного субстрата. Использование бесклеточной терапии в регенеративной медицине имеет определенные преимущества перед традиционным использованием СК. Оно решает такие важные проблемы, как иммунная совместимость, онкогенез, перенос вирусной инфекции. Использование секретома СК уменьшает длительность и стоимость терапии за счет устранения необходимости в размножении и поддержания стволовости культивируемых клеток, также потенциально дает возможность использовать этот вид лечения в экстренных случаях, в частности при инфаркте миокарда, инсульте, военной травме [58].

Доказана способность секретома МСК стимулировать ангиогенез как в опытах in vitro, так и in vivo. Это действие обусловлено наличием в нем фактора роста эндотелия сосудов, фактора роста фибро-бластов 2 (FGF-2), интерлейкина 6 (IL-6), плацентарного фактора роста, ангиопоэтина-1, моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 и индуктора ангиогенного фактора, обогащенного цистеином 61 (Cyr61) [59]. Секреция этих ангиогенных факторов может модулироваться рядом хемокинов и гипоксическим состоянием. В частности, показано, что трансформирующий фактор, а (TGFa) может увеличивать содержание ряда факторов роста (VEGF, фактор роста гепатоцитов, тромбоцитарный фактор роста ВВ, IL6 IL-8) в секретоме МСК. Среда культивирования МСК, обработанных TFGa, вызывала более быстрый рост сосудов по сравнению с немодифицированной средой в опытах in vivo [60].

МСК способны уменьшать клеточное повреждение, секретируя специфические белки, известные как классические ингибиторы апоп-тоза. МСК снижали экспрессию проапоптотического фактора Вах и каспазы-3, при увеличении уровня антиапоптотического белка Bcl-2 с возрастанием экспрессии про-ангиогенных факторов (основного фактора роста фибробластов, VEGF) и фактора хоминга СК SDF-1 [61].

Использование кондиционированной среды культивирования МСК может воспроизводить терапевтический эффект, оказываемый самими СК [62].

Секретом СК играет важную роль в регенерации почки. Показано, что внутрибрюшинная инъекция МСК из костного мозга или жировой ткани мышам с циспластинидуцированной острой почечной недостаточностью ускоряет восстановление функции почек за счет стимуляции пролиферации эпителия почечных канальцев и уменьшения их апоптоза при отсутствии включения введенных клеток в почечные канальцы и выявлении единичных меченых клеток в интерстиции [63]. Терапевтический эффект МСК в отношении функции поврежденной почки полностью воспроизводится введением секре-тома МСК. При моделировании хронической почечной болезни введение кондиционированной среды культивирования МСК тормозит прогрессирование заболевания, уменьшая повреждение клубочков и развитие гипертонии [64]. Показано ренопротективное действие таких компонентов секре-тома СК, как фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста эпидермиса (EGF), инсулиноподобный фактор роста-1(IGF-I), EGF-подобный фактор роста, связывающий гепарин (HBEGF), тромбоцитарный фактора роста (PDGF), белок костного морфогенеза-7 (BMP-7) [65].

В опытах на мышах, лишенных EGF-рецепторов в проксимальных почечных канальцах, показана важность активации EGF-рецепторов в ранней восстановительной фазе после острого повреждения почки [66]. В опытах на генетически-модифицированных мышах, не имеющих HGF-рецепторов (c-met), специфичных для почечных канальцев, продемонстрирована антиапоптотическая и противовоспалительная роль этих рецепторов, способствующая уменьшению выраженности функциональных и метаболических расстройств при остром повреждении почки [67].

Ведутся исследования по повышению паракринной, аутокринной и эндокринной активности МСК методами их прекондициони-рования (культивирования в условиях гипоксии, воздействия комплексом цитокинов, совместном культивировании с другими клетками) или модификации экспрессии генов с использованием вирусной или невирусной доставки генов для усиление секреции ими ткане-специфичных тропных факторов [68]. Пре-кондиционирование культивированных МСК жировой ткани в гипоксической среде (2% О2) повышало пролиферативный потенциал культивируемых клеток за счет индукции клеточного приона белка PrPC, участвующего в активации JAK2 и STAT3-механизмов регуляции активности супероксиддисмутазы и каталазы, что способствует уменьшению оксидантного стресса и повышению выживаемости клеток ишемизированных тканей [69].