Диагностика. 
Дифференциальный диагноз

При вспышке болезни на фоне пассивного или поствакцинального иммунитета, а тем более в стационарно неблагополучном хозяйстве поставить диагноз бывает чрезвычайно трудно. В этих случаях тщательно изучают эпизоотическую ситуацию, клиническую и патологоанатомическую картину. Решающее значение имеют лабораторные исследования — выделение вируса на куриных эмбрионах, его индикация и идентификация в РГА — РТГА, определение вирулентности вируса на куриных эмбрионах и цыплятах, а также выявление антител в сыворотке переболевших или вакцинированных птиц в РТГА.

Вирус, в зависимости от его тропизма можно выделить из головного и костного мозга, трахеи, кишечника, селезенки, легких, печени. Для исследования рекомендуется брать голову, легкие, трахею и селезенку от только что павших или вынужденно убитых птиц. Вирус удается выделить только в период вспышки болезни. Через 15 дней выделить его обычными методами, как правило, не удается. Поэтому патологический материал необходимо брать в начале вспышки и направлять в лабораторию в термосе со льдом. Внутренние органы можно помещать в стерильный 50%-ный раствор глицерина на дистиллированной воде. Смывы из трахеи и клоаки лучше консервировать на холоде или при температуре не выше 4 °C. Мазки-отпечатки исследуют методом ферментного анализа, срезы — с помощью электронной микроскопии, а суспензию — в реакции гемагглютинации. Это позволит выявить специфический антиген (вирус) и ГА-агент в течение 3−5 ч, определить направленность дальнейших исследований [18].

Заражение КЭ.

Эмбрионы 9−11-дневного возраста заражают по 0,2 мл, не менее 10 КЭ на каждый материал, в аллантоисную полость общепринятым методом и инкубируют 72 ч при 37,5°С (погибших в первые 24 ч эмбрионов не учитывают). Если через 72 часа нет погибших эмбрионов, то 5 из партии зараженных убивают, оставляя их при 4 °C на ночь. Остальные 5 инкубируют до 120 часов и затем убивают. Аллантоисную жидкость от погибших и живых КЭ проверяют на гемагглютинацию в РГА с куриными эритроцитами (1−5%-ная взвесь). Обычно велогенные штаммы вируса вызывают гибель эмбрионов уже через 32−60 ч после заражения, мезогенные — через 60−90, а лентогенные — через 100 ч и более.

Заражение культуры клеток производят в тех случаях, когда в лаборатории можно получить культуру фибробластов куриных эмбрионов и специалисты владеют этим методом, его можно применять для выделения и идентификации вируса. Приготовление вирусной суспензии, выращивание и заражение культуры клеток куриных фибробластов производят общепринятым методом. Можно использовать перевиваемые линии ВНК-21 и Нер-2 [5].

В зараженной культуре фибробластов КЭ вирус НБ через 48−60 ч вызывает ЦПИ, специфичность которых подтверждается реакцией гемадсорбции с эритроцитами кур. С вируссодержащей культуральной жидкостью может быть поставлена РГА в отношении эритроци тов крови кур. Обычно при первичном выделении ГА-титр культурального вируса не превышает 1:32 — 1:128. Отсутствие или низкие титры ГА вируса в первом пассаже на культуре ткани не дают основания исключить НБ.

Заражение птиц.

Вирус можно выделить на неиммунной к болезни Ньюкасла птице. Для этого испытуемый материал 1:10 (0,5 мл) внутримышечно инокулируют цыплятам в возрасте 2−4 мес. За инфицированной птицей наблюдают 10−12 дней. При появлении характерных для болезни симптомов птиц в атональном состоянии убивают и берут пробы головного мозга и селезенки, которые можно использовать для заражения КЭ и иммунологи ческой пробы (для одновременного заражения птиц иммунной и неиммунной групп).

Титрование вируса обычно проводят на КЭ, культурах клеток по общепринятой методике и на 6−10 недельных цыплятах. Доза инокуляции вируса для цыплят 0,5 мл (внутримышечно или внутривенно). Срок наблюдения 15 дней.

Экспресс-методы выявления антигена вируса болезни Ньюкасла.

Для идентификации РНК вируса НБ пользуются экспресс-методом ПЦР, амплифицирующей участок длиной 238 п.н. в гене белка слияния F с использованием в качестве праймеров нуклеотидов, фланкирующих последовательность.

Через 24 часа в инфицированных культурах клеток (шт. Н) наблюдают появление многоядерных симпластов и цитоплазматических эозинофильных включений неправильной глыбчатой формы. Через 48 часов после заражения цитоплазма бывает нафарширована тельцами-включениями. В ядрах изменений не отмечалось. Разработан высокочувствительный авидин-биотиновый ИФА. В данном тесте применяют монАТ к вирусу НБ, очищенные и меченые биотином. Тест характеризуется простотой выполнения и короткими сроками (3−4 ч) получения результатов. Непрямой точечный вариант ИФА является быстрым, легким, специфическим методом обнаружения вируса в смывах с различных органов.

В организме птицы, зараженной вирусом, в процессе продолжительного контакта с вирусом эритроциты теряют способность гемагглютинации (становятся инаглютинабельными). Чтобы косвенно доказать присутствие вируса в организме, от исследуемой птицы берут 0,04 мл крови в формалинизированую (0,1%-ную) вируссодержащую аллантоисную жидкость, вирус дол жен обладать высокой агглютинирующей активностью. Если на стекле наступает гемагглютинация, это свидетельствует об отсутствии в исследуемой капле крови вируса НБ. Учет реакции ведут через несколько секунд. Метод применим для выявления патогенного вируса в вакцинированном стаде, так как вакцинные штаммы лентогенной группы инагглютинабельности эритроцитов не вызывают.

Реакция гемагглютинации (РГА).

Используют с целью ориентировочного определения присутствия вируса в исследуемом материале и для его титрования. ГА вируса входят в состав вирусной частицы (вириона) и могут содержаться в инфицированных аллантоисной и амниотической жидкостях, оболочках и органах КЭ, легких, печени, почках и селезенке погибшей птицы, в жидкой и клеточной фракциях тканевых культур. Можно брать эритроциты крови кур, морской свинки, лошади, человека. Разные виды вирусов могут отличаться друг от друга способностью агглютинировать эритроциты указанных животных. Спектр гемагглютинации служит характеристикой биологической активности вируса и штаммов [11].

Серологическая идентификация.

Вирусы болезни Ньюкасла можно идентифицировать в реакции нейтрализации (РН), реакции связывания комплемента (РСК), реакции иммунофлуоресценции (РИФ) и других.

Реакцию нейтрализации на куриных эмбрионах используют для идентификации вируса редко, так как она трудоемка и длительна. Реакцию используют в спорных ситуациях. РН ставят общепринятым методом обычно в варианте разведения вируса и постоянной дозы сыворотки. Реакцию считают положительной при индексе нейтрализации >21g.

Реакция связывания комплемента в диагностической практике используют редко. Предложена РСК как быстрый и дешевый метод дифференциации штаммов вируса по вирулентности.

Реакция иммунофлюоресценции. Метод основан на применении родаминсульфохлорида для конъюгации иммунной сыворотки к вирусу с целью идентификации вирусного АГ в пораженных клетках павших и убитых птиц. Применение этого красителя наиболее приемлемо и удобно благодаря яркому оранжево-красному свечению АГ. ФИТЦ-конъюгаты (флюоресцеинизотиоцианат) менее пригодны. Для обнаружения специфического антигена применяют гомологичные РСХ-конъюгаты общепринятым методом. В большинстве случаев антиген выявляется в ядрах клеток белой крови (лимфоцитах, моноцитах, псевдоэозинофилах и эозинофилах) или пораженных клеток указанных органов в виде яркой флюоресценции оранжево-красного цвета. В контрольных препаратах, обработанных теми же гомологичными конъюгатами, подобного свечения не наблюдается, лишь в некоторых случаях выявляется точечное желто-оранжевое свечение в цитоплазме юных эозинофилов.

Идентификация при помощи монАТ.

Исследованы различные штаммы вируса и изоляты НБ на гомологичное родство к монАТ. В результате тестирования 40 изолятов и штаммов с использованием набора из 9 монАТ выявлено 8 групп. Вирусы каждой группы обладали не только общими АГ-свойствами, но и одинаковыми эпизоотическими чертами. МонАТ к ГА и гликопротеину F рекомендовано использовать для определения патогенности и биологической характеристики штаммов, циркулирующих в стадах вакцинированных и невакцинированных птиц. Они могут быть использованы для идентификации полевых изолятов, АГ-родственных шт. La Sota и В1, быстрой дифференциации этих вакцинных штаммов от вирулентных полевых изолятов.

Биопроба.

Цыплят заражают в клоаку. Несколько особей заражают в глаз, внося туда каплю вируса. За птицами наблюдают 10 дней. Если в течение этого периода ни один цыпленок не погибает, считают, что штамм не относится к WND. Если же птицы заболеют и погибнут в течение 10 дней, производят вскрытие.

В США принята следующая оценка интенсивности изменений (в баллах): точные кровоизлияния или некротические изменения в трахее — 25; точечные кровоизлияния или некротические изменения в трахее и сопутствующая им отечность трахеи и в области входа в грудную клетку — 100; точечные кровоизлияния или некротические изменения в зобе — 100; некроз и изъязвление желез слепой кишки и пейеровых бляшек — 100; точечные кровоизлияния или некротические изменения слизистой оболочки клоаки — 10; воспаление брюшины в области яичника — 10; точечные кровоизлияния в других местах — 10. Диагностика WND считается обоснованной, если общее число баллов достигает 150 или более [8].

Серодиагностика и ретроспективная диагностика.

Критерием, позволяющим судить о персистенции вирулентного вируса в стаде, являются титры антител в сыворотке крови птиц. Исследования проводят только с парными сыворотками, полученными от одних и тех же птиц (или на одной и той же группе птиц). Первую пробу берут перед вакцинацией (или в начале болезни), вторую — на 15−20-й день, последующие — в любое время (обычно 1 раз в месяц).

РТГА.

Реакцию ставят с 4 ГАЕ в макро — и микровариантах по общепринятой методике. Результаты считают положительными, если разница в титрах 1-й и 2-й сывороток составляет не менее 3-х разведений. Повышение числа положительно реагирующих в РТГА между двумя исследованиями свидетельствует о распространении инфекции в стаде.

Дифференциальная диагностика.

Болезнь Ньюкасла следует дифференцировать от инфекционной бурсальной болезни птиц, гриппа, микоплазмоза птиц.

Для лабораторной диагностики гриппа птиц и болезни Ньюкасла используют диагностикумы биофабричного производства.