Метод агглютинации в геле определения а/г эрироцитов и антиэритроцитарных а/т

Гелевая технология в микропробирках была предложена Лариерре в 1989 г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле «сефадекс», помещенном в микропробирки. Обычно система представляет собой пластиковые карты, содержащие микропробирки, заполненные гелем. ИГИ, основанные на реакции гемагглютинации, обычно проводятся в жидкофазных системах.

Одним из наиболее важным условием получения корректных данных реакции агглютинации является оценка результата. Слабая реакция может быть неверно интерпретирована, особенно неопытным персоналом. Ложные слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста могут иметь место за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки вследствие недостаточного эффективного отмывания эритроцитов. Неадекватное перемешивание эритроцитов и элюция слабо фикцированных А/т и процесс отмывания могут стать причиной ошибок при проведении непрямого антиглобулинового теста. Методика агглютинации в геле была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и получения достоверных результатов. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат). Центрифугирование в геле может быть конечной фазой любых серологических исследований, основанных на реакции гемагглютинации, кроме методов, требующих диспергирования для оценки результата.

Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по А/г эритроцитов не заменяет обязательное ИГИ (типирования А/г эритроцитов системы АВ0, резус, Келл, выявление антиэритроцитарных А/т, поиск и идентификацию аллоантиэритроциторных А/т), а лишь дополняет его.

Таким образом гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявить слабые варианты А/г эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимо для правильного выполнения теста, сводиться к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик. Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для обучающих целей в сложных для диагностики случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами.

Гелевый тест может применяться для проведения проб на совместимость по А/г эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются НАГТ и одностадийный ферментный метод. Гелевый тест выполняется и оценивается по вышеприведенным правилам. Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении НАГТ позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также, благодаря стабильности результатов теста, контролировать все полученные результаты.

Принцип гелевого теста Забуференный декстрановый гель Sephadex G 100 superfine, может быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками — в отличие от стандартных серологических методик — с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста. После инкубации следует центрифугирование в строго определенном режиме. Если условия центрифугирования не выполняются, могут иметь место ложноположительные результаты. Ложноотрицательные результаты также могут иметь место при нарушении условий центрифугирования. Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

• 1. нейтральный, не содержащий специфических А/т (применяется для поиска и идентификации А/т солевым ферментным методами, холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);
• 2. специфический, содержащий А/т (моноклональные или поликлональные) к А/г эритроцитов крови человека (применяется для типирования А/г эритроцитов систем АВ0, резус, Келл и т. д.)
• 3. антиглобулиновый, содержащий А/т (полиспецифические и моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для ПАГТ и НАГТ (реакции Кумбса) при поиске и идентификации аутои аллоиммунных А/т, пробе на совместимость крови донора и реципиента).

Характеристика идентификационных карт Идентификационные карты (ID-карты) Диа-Мед представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть микропробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля и антисывороток. Каждая карточка имеет шестую контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без А/т (сtl). Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым А/г, например: А-В-АВ-D-СDЕ-сtl или С-с-Е-е-К-ctl. ID карты для выявления А/т к А/г эритроцитов имеют некоторые отличия, например, карты «Coombs / Enzyme Test»: в трех пробирках, расположенных слева, содержится гель, содержащий А/т к глобулинам человека (моноспецифические анти-IgD или полиспецифические — к иммуноглобулинам различных классов) — реакция Кумбса. В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления А/т к А/г эритроцитов в солевой среде.

Общие правила использования идентификационных карт.

ID карты должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 18−25°С. Срок годности указан в паспортной части каждой карты и на упаковочных коробках.

Растворы для приготовления суспензии эритроцитов, а также стандартные сыворотки и стандартные ID-эритроциты, использующиеся в отдельных исследованиях, должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 2−8°С. Срок годности указан на этикетке каждого флакона и упаковочной коробке.

Во избежание получения ложных результатов исследований, запрещается использование любых реагентов и карт с истекшими сроками годности, а также высохших, содержащих пузырьки газа или при повреждении оболочки.

Заготовка крови осуществляется с применением современных флеботонических методик, а также пригодна артериальная, капиллярная и пуповинная (без отмывания) кровь. Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах.