Методы наблюдения при оптической микроскопии

Структуру объекта можно различить, если разные его части по-разному поглощают и отражают свет, либо отличаются одна от другой (или от среды) показателями преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, отраженных или прошедших через различные участки объекта, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения, применяемые в оптической микроскопии, выбираются в зависимости от характера и свойств изучаемого объекта.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных объектов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Таковы, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и материалов радиоэлектроники. В отсутствии объекта пучок лучей из конденсора 6 (см. рис. 1) проходит через объектив 8 и дает равномерно освещенное поле вблизи фокальной плоскости окуляра 9. Если в объекте 7 имеется абсорбирующий объект, то он отчасти поглощает и отчасти рассеивает падающий на него свет (штриховая линия), что и обусловливает, согласно дифракционной теории, возникновение изображения. Метод может быть полезен и при неабсорбирующих объектах, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть пучка не попадает в объектив.

Метод светлого поля в отраженном свете (рис.2) применяется для наблюдения непрозрачных объектов, например, шлифов металлов 4.

Рис. 2. Метод светлого поля в отраженном свете

Освещение объекта производится от осветителя 1 и полупрозрачного зеркала 2 сверху через объектив 3, который выполняет одновременно и роль конденсора. Изображение создается в плоскости 6 объективом совместно с тубусной линзой 5; структура объекта видна из-за различия в отражающей способности ее элементов; на светлом поле выделяются неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля в проходящем свете (рис.3) применяется для получения изображений прозрачных, неабсорбирующих объектов. Свет от осветителя 1 и зеркала 2 проходит специальный конденсор темного поля 3 в виде полого конуса и непосредственно в объектив 5 не попадает. Изображение создается только светом, рассеянным микрочастицами объекта 4. В поле зрения 6 на темном фоне видны светлые изображения частиц, отличающихся от окружающей среды по показателю преломления.

Рис. 3. Метод темного поля в проходящем свете

Метод ультрамикроскопии, основанный на этом же принципе (освещение объекта в ультрамикроскопах производится перпендикулярно направлению наблюдения), дает возможность обнаруживать сверхмелкие детали, размеры которых (2 нм) лежат далеко за пределами разрешения оптического микроскопа. Возможность обнаружения таких объектов, например, мельчайших коллоидных частиц, с помощью ультрамикроскопа обусловлена дифракцией света на них. При сильном боковом освещении каждая частица в ультрамикроскопе отмечается наблюдателем как яркая точка (светящееся дифракционное пятно) на темном фоне. Вследствие дифракции на мельчайших частицах рассеивается очень мало света. Поэтому в ультрамикроскопии применяют, как правило, сильные источники света. В зависимости от интенсивности освещения, длины световой волны, разности показателей преломления частицы и среды обнаруживаемые частицы имеют размеры (2−50) нм. По дифракционным пятнам нельзя определить истинные размеры, форму и структуру частиц: ультрамикроскоп не дает изображений оптических исследуемых объектов. Однако, используя ультрамикроскоп, можно установить наличие и численную концентрацию частиц, изучать их движение, а также рассчитать средний размер частиц, если известна их весовая концентрация и плотность. Ультрамикроскоп создали в 1903 г. немецкий физик Г. Зидентопф и австрийский химик Р. Зигмонди. В предложенной ими схеме щелевого ультрамикроскопа (рис. 4, а) исследуемая система неподвижна. Кювета 5 с изучаемым объектом освещается источником света 1 (2 — конденсор; 4 — осветительный объектив) через узкую прямоугольную щель 3, изображение которой проецируется в зону наблюдения.

В окуляр наблюдательного микроскопа 6 видны светящиеся точки частиц, находящихся в плоскости изображения щели. Выше и ниже освещенной зоны присутствие частиц не обнаруживается. В поточном ультрамикроскопе (рис. 4, б) изучаемые частицы движутся по трубке навстречу глазу наблюдателя. Пересекая зону освещения, они регистрируются как яркие вспышки визуально или с помощью фотометрического устройства. Регулируя яркость освещения наблюдаемых частиц подвижным фотометрическим клином 7, можно выделять для регистрации частицы, размер которых превышает заданный предел. Ультрамикроскоп применяют при исследованиях дисперсных систем, для контроля чистоты атмосферного воздуха, воды, степени загрязнения оптически прозрачных сред посторонними включениями.

При наблюдении по методу темного поля в отраженном свете (рис.5) непрозрачные объекты (например, шлифы металлов) освещают сверху специальной кольцевой системой, расположенной вокруг объектива и называемой эпиконденсором.

Рис. 5. Схема прибора для контроля чистоты поверхностей подложек в темном поле микроскопа: 1 — лампа осветителя темного поля; 2 — эпиконденсор; 3 — подложка; 4, 5 — линзы объектива микроскопа; 6 — отражающее зеркало призмы микроскопа; 7 — линза окуляра микроскопа

Лучи света от лампы осветителя темного поля 1, отражающиеся от эпиконденсора 2 и падающие под углом к поверхности подложки 3, рассеиваются инородными частицами. Эти рассеянные от инородных частиц лучи света проходят через линзы объектива микроскопа 4 и 5, отражаются от зеркала призмы микроскопа 6 и, проходя через линзу окуляра микроскопа 7, различаются наблюдателем в виде светящихся точек в темном поле.

Метод наблюдения в поляризованном свете (в проходящем и отраженном) применяется для исследования анизотропных объектов, таких как минералы, руды, зерна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и клетки. Оптическая анизотропия — это различие оптических свойств среды в зависимости от направления распространения в ней оптического излучения (света) и его поляризации. Поляризация света — физическая характеристика оптического излучения, описывающая поперечную анизотропию световых волн, то есть неэквивалентность различных направлений в плоскости, перпендикулярной световому лучу. Поперечность электромагнитных волн лишает волну осевой симметрии относительно направления распространения из-за наличия выделенных направлений (вектора Е — напряженности электрического поля и вектора Н — напряженности магнитного поля) в плоскости, перпендикулярной направлению распространения. Поскольку векторы Е и Н электромагнитной волны перпендикулярны друг другу, для полного описания состояния поляризации светового пучка требуется знание поведения лишь одного из них. Обычно для этой цели выбирается вектор Е. Свет, испускаемый каким-либо отдельно взятым элементарным излучателем (атомом, молекулой), в каждом акте излучения всегда поляризован. Но макроскопические источники света состоят из огромного числа таких частиц-излучателей; пространственные ориентации векторов Е и моменты актов испускания света отдельными частицами в большинстве случаев распределены хаотически. Поэтому в общем излучении направление Е в каждый момент времени непредсказуемо. Подобное излучение называется неполяризованным, или естественным светом. Свет называется полностью поляризованным, если две взаимно перпендикулярные компоненты (проекции) вектора Е светового пучка совершают колебания с постоянной во времени разностью фаз. Обычно состояние поляризации света изображается с помощью эллипса поляризации — проекции траектории конца вектора Е на плоскость, перпендикулярную лучу (рис.6).

Рис. 6. Примеры различных поляризаций светового луча при различных разностях фаз между взаимно перпендикулярными проекциями E_x и E_y. Плоскость рисунков перпендикулярна направлению распространения света. а) и д) — линейные поляризации; в) — круговая поляризация; б), г) и е) — эллиптические поляризации

Оптическая анизотропия проявляется в двойном лучепреломлении, изменении поляризации света и во вращении плоскости поляризации, происходящем в оптически активных веществах. Естественная оптическая анизотропия кристаллов обусловлена неодинаковостью по различным направлениям поля сил, связывающих атомы решетки. Естественная оптическая активность веществ, которые проявляют ее в любом агрегатном состоянии, связана с асимметрией строения отдельных молекул таких веществ и обусловленным ею различием во взаимодействии этих молекул с излучением различных поляризаций, а также с особенностями возбужденных состояний электронов и «ионных остовов» в оптически активных кристаллах. Наведенная (искусственная) оптическая анизотропия возникает в средах, от природы оптически изотропных под действием внешних полей, выделяющих в таких средах определенное направление. Это может быть электрическое поле, магнитное поле, поле упругих сил, а также поле сил в потоке жидкости. В методе наблюдения в поляризованном свете с помощью анализаторов и компенсаторов, которые включены в оптическую систему, изучается изменение поляризации света, прошедшего через объект.

Метод фазового контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при малом различии показателей преломления объекта и среды световая волна, прошедшая сквозь них, претерпевает разные изменения по фазе и приобретает фазовый рельеф. Эти фазовые изменения преобразуются в изменения яркости («амплитудный рельеф») с помощью специальной фазовой пластинки (фазового кольца), расположенной вблизи заднего фокуса объектива. Лучи, прошедшие через объект, полностью проходят через фазовое кольцо, которое изменяет их фазу на /4. В то же время лучи, рассеянные в объекте (отклоненные), не попадают в фазовое кольцо и не получают дополнительного сдвига фазы. С учетом фазового сдвига в объекте разность фаз между лучами отклоненными и неотклоненными оказывается близкой к 0 или /2, и в результате интерференции света в плоскости изображения объекта они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры объекта, в котором распределение яркостей воспроизводит указанный выше фазовый рельеф.

Рис. 4. Метод интерференционного контраста

Метод интерференционного контраста состоит в том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается: один проходит сквозь наблюдаемую частицу, а второй — мимо нее. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей d, которая выражается формулой: d=N= (n₀-n_m) d₀, где n₀, n_m — показатели преломления соответственно частицы и окружающей среды, d₀ — толщина частицы, N — порядок интерференции. Принципиальная схема одного из способов осуществления интерференционного контраста показана на рис. 4. Конденсор 1 и объектив 4 снабжены двоякопреломляющими пластинками (помечены на рисунке диагональными стрелками), первая из которых расщепляет исходный световой луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект 3, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом); величина этого запаздывания измеряется компенсатором 5. Метод интерференционного контраста в некоторых отношениях сходен с методом фазового контраста — оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших ее. Отличие интерференционного метода от метода фазового контраста заключается главным образом в возможности с высокой точностью (до /300) измерять разности хода, вносимые микрообъектом, используя компенсаторы. На основании этих измерений можно производить количественные расчеты, например, общей массы и концентрации сухого вещества в клетках биологических объектов.

Метод исследования в свете люминесценции основан на том, что под микроскопом изучается зелено-оранжевое свечение объекта, возникающее при его освещении сине-фиолетовым или УФ светом. Для этой цели перед конденсором и после объектива микроскопа вводят соответствующие светофильтры. Первый из них пропускает от источника-осветителя только излучение, вызывающее люминесценцию объекта, второй (после объектива) пропускает к глазу наблюдателя только свет люминесценции. Метод применяется в микрохимическом анализе, дефектоскопии.

Метод наблюдения в УФ лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность микроскопа, пропорциональную 1/. Этот метод расширяет возможности микроскопических исследований также за счет того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определенных длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографированием, либо с помощью электронно-оптического преобразователя или люминесцирующего экрана.

Метод наблюдения в ИК лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путем его фотографирования или с помощью электронно-оптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например, темных стекол, некоторых кристаллов, минералов.

Основные узлы оптического микроскопа. Кроме указанных выше оптических узлов (например, объектив, окуляр), в оптическом микроскопе имеются также штатив или корпус, предметный столик для крепления исследуемого объекта, механизмы для грубой и точной фокусировки, устройство для крепления объективов и тубус для установки окуляров. Применение того или иного типа конденсора (светлопольные, темнопольные и т. д.) зависит от выбора необходимого метода наблюдения. Объективы в большинстве современных оптических микроскопов съемные. Объективы различаются:

• а) по спектральным характеристикам — на объективы для видимой области спектра и для УФ и ИК микроскопии (линзовые и зеркально-линзовые);
• б) по длине тубуса, на которую они рассчитаны (в зависимости от конструкции микроскопа);
• в) по среде между объективом и объектом — на сухие и иммерсионные;
• г) по методу наблюдения — на обычные, фазово-контрастные и др.

Рис. 5. Микрофотографии нетравленого шлифа металла в светлом поле (а) и с фазово-контрастным устройством (б)

Тип применяемого окуляра при данном методе наблюдения определяется выбором объектива оптического микроскопа. Приспособления к оптическим микроскопам позволяют улучшить условия наблюдения и расширить возможности исследований, осуществлять разные виды освещения объектов, определять размеры объектов, фотографировать объекты через микроскоп, и т. п. Типы микроскопов определяются либо областью применения, либо методом наблюдения. Например, биологические микроскопы предназначены для исследований в микробиологии, гистологии, цитологии, ботанике, медицине, а также для наблюдения прозрачных объектов в физике, химии и т. д. Металлографические микроскопы предназначены для исследования микроструктур металлов и сплавов. Снятые с помощью такого микроскопа микрофотографии нетравленого шлифа металла представлены на рис. 5 (а — в светлом поле, б — с фазово-контрастным устройством). Поляризационные микроскопы снабжены дополнительно поляризационными устройствами и предназначены главным образом для исследования шлифов минералов и руд. Стереомикроскопы служат для получения объемных изображений наблюдаемых предметов. Измерительные микроскопы предназначены для различных точных измерений в машиностроении. Кроме этих групп микроскопов имеются специализированные оптические микроскопы, например: микроустановка для киносъемки быстрых и медленных процессов (движение микроорганизмов, процессы деления клеток, роста кристаллов и т. п.); высокотемпературные микроскопы для исследования объектов, нагретых до 2000 °C; хирургические микроскопы слабого увеличения, применяемые при операциях. Весьма сложными приборами являются микроспектрофотометрические установки для определения спектров поглощения объектов, телевизионные анализаторы микроизображений и др.

Как уже было сказано, независимо от вида используемых линз и способа их соединения, разрешающая способность оптических микроскопов ограничивается основным правилом оптической техники, сформулированным еще в 1873 г. (так называемый дифракционный предел разрешения Рэлея), в соответствии с которым минимальные размеры различаемых деталей рассматриваемого объекта не могут быть меньше, чем половина длины волны света, используемого для освещения. Поскольку самые короткие длины волн диапазона соответствуют примерно 400 нм, разрешающая способность оптических микроскопов принципиально ограничена половиной этой величины, то есть составляет около 200 нм. Единственным выходом из возникшей ситуации стало создание приборов, в которых используются волновые излучения с меньшей длиной волны, то есть излучения не световой природы.