Параоксоназа. 
Исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений

Другой важной группой эстераз являются параоксоназы (PON). PON широко распространены у млекопитающих, включая человека. PON-подобные белки обнаружены у различных классов организмов, включая бактерии и грибы, что говорит о филогенетической древности этой группы ферментов. PON не относятся к классу сериновых эстераз, каталитический центр PON содержит «гистидиновую диаду», в отличие от АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ, имеющих высококонсервативную каталитическую триаду, в состав которой входит активный остаток серина.

Параоксоназы относятся к классу А-эстераз: ФОС не ингибируют данные ферменты, а являются их субстратами, в отличие от B-эстераз (АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ), которые являются мишенями ФОС [69].

Локализация и субстратная специфичность PON

Параоксоназы человека разделены на три подсемейства (PON1, PON2 и PON3), гены которых картированы на длинном плече хромосомы 7 человека в локусе 7q21.3, рядом с геном АХЭ (7q22). Аминокислотные последовательности изоформ идентичны на 60−70% [399].

PON1 имеет два номера по классификации ферментов, поскольку гидролизует нитрофенилацетат (арилэстераза, КФ 3.1.1.2) и триэфир фосфорной кислоты — параоксон (арилдиалкилфосфатаза, фосфотриэстераза, органофосфатгидролаза, КФ 3.1.8.1).

У млекопитающих все три гена PON высоко консервативны и демонстрируют 79−95% идентичности на аминокислотном уровне и 81−95% на уровне нуклеотидов для различных генов [399, 400], что говорит об их важной физиологической роли.

PON1 изначально была идентифицирована как фермент, способный гидролизовать параоксон, первый и один из наиболее изученных субстратов. Впоследствии это название закрепилось за всем семейством ферментов. Однако только PON1 обладает значительной параоксоназной активностью, PON3 имеет очень низкую параоксоназную активность, а PON2 не обладает ею вообще [401], при этом все три изоформы обладают в той или иной степени арилэстеразной и лактоназной активностью. Название фермента дает ошибочное представление, будто параоксон является лучшим субстратом для фермента, на самом деле PON1 гидролизует фенилацетат (наилучший известный субстрат PON1) в 1000 раз быстрее, чем параоксон [402].

Все три изофермента PON1 обладают лактоназной активностью и участвуют в гидролизе некоторых общих субстратов — ароматических лактонов, но также обладают и собственной субстратной специфичностью. Все три параоксоназы очень эффективно взаимодействуют с производными арахидоновой и докосагексаеновой кислот, являющимися эндогенными субстратами ферментов семейства PON [403].

работе активность PON1 была исследована с использованием более 50 субстратов, принадлежащих к трем различным классам: сложные эфиры, фосфотриэфиры и лактоны. Полученные результаты подтверждают, что PON1 является скорее лактоназой, чем эстеразой или фосфотриэстеразой. Являясь ферментом с широкой субстратной специфичностью [404, 405], PON1 выполняет разнообразные биологические функции, что более подробно обсуждается ниже.

PON1 главным образом экспрессируется в печени и секретируется в кровь, в плазме крови она прочно связана с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП). Показано, что ферментативная активность и стабильность молекулы PON1 зависят от связи фермента с частицами ЛПВП.

Концентрация белка PON1 в плазме человека составляет примерно 60 мг/л Очень высокий уровень активности параоксоназы присутствует в печени и плазме крови грызунов, причем в плазме содержится более 50% всей параоксоназы.

Структура PON1

PON1 имеет молекулярную массу 43 кДа и состоит из 353 аминокислотных остатков. Остатки Cys42 и Cys353 образуют дисульфидный мостик, который связывает Nи C-концевые области молекулы, свободный Cys284 необходим для проявления лактоназной активности фермента, но не участвует в арилэстеразном и параоксоназном гидролизе [412], [413].

Кристаллическая структура PON1 представлена шестью в-слоями, организованными в виде пропеллера (Рис. 1.5.-1). В центральной части молекулы имеется канал, внутри которого располагается активный центр. Помимо в-складок, в молекуле имеется три б-спиральных домена, два из которых ограничивают вход в центральный канал и играют роль своеобразного якоря для закрепления молекулы фермента на поверхности частиц ЛПВП PON1 является Ca2± зависимой гидролазой: внутри центрального канала фермента располагаются два иона Ca2+, один из которых участвует в стабилизации структуры белка, другой необходим для каталитической функции PON1. ЭДТА полностью ингибирует активность фермента [410]. Ион кальция необходим как для гидролиза лактонов, так и для параоксоназной и арилэстеразной активностей PON1 [414]. Необходимость именно Ca2+ доказывалась его заменой на ионы цинка или магния: ферментативная активность со всеми субстратами сильно снижалась в присутствии Zn2+ и Mg2+ (приблизительно в 10−100 раз.

В активном центре фермента располагается «гистидиновая диада» — сопряженный комплекс остатков His115 и His134, участвующих в эстеразном и лактоназном гидролизе, но не в фосфотриэстеразной активности [415]. Структура активного центра указывает на общеосновный механизм катализа: His115 депротонирует молекулу воды, образующийся гидроксильный радикал атакует молекулу субстрата и вызывает ее гидролиз. His134 является донором протона, повышая основность His115. «Каталитический» ион Ca2+ стабилизирует образующийся отрицательно заряженный интермедиат. Ацил-ферментный комплекс в процессе гидролиза, по всей видимости, не образуется [416]. Аминокислотные остатки, обусловливающие фосфотриэстеразную активность и эстеразную/лактоназную активность PON1 находятся в разных областях активного центра [415, 416].

Физиологическая функция PON1

Физиологической функцией PON1 предположительно является гидролиз гомоцистеин-тиолактонов, что предотвращает гомоцистеинилирование белков и предупреждает развитие атеросклероза [417, 418]. PON1 гидролизует и другие эндогенные лактоны, например, лактон гомогентизиновой кислоты, промежуточный продукт распада циклических аминокислот — фенилаланина и тирозина [413].

Как уже отмечалось, PON1 синтезируется главным образом в печени и секретируется в кровь, где она связывается с ЛПВП. Одной из естественных физиологических функций PON1 является метаболизм токсичных окисленных липидов и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), а также ЛПВП, что снижает риск развития атеросклероза [419−424].

Активность PON1 понижена при ряде патологий, ассоциированных с атеросклерозом. Наблюдается обратная зависимость между уровнем активности PON1 и риском развития сердечно-сосудистых заболеваний [413, 425, 426], что свидетельствует о важном клиническом значении этого фермента.

[421, 427].

PON1 способна также гидролизовать фактор активации тромбоцитов (PAF), что значительно снижает тромбообразование и хемотаксис лейкоцитов.

Роль PON1 в метаболизме лекарственных средств

PON1 играет важную роль в гидролитическом метаболизме некоторых лекарственных препаратов, содержащих сложноэфирную и лактоновую группировку [403]. Так, PON1 гидролизует ловастатин, используемый для контроля уровня холестерина. [413].

Ингаляционная терапия кортикостероидами для лечении астмы предполагает устойчивость данных препаратов в легких, но при этом их быструю инактивацию при попадании в кровь во избежание побочных эффектов. Было показано, что именно лактоны, но не эфиры кортикостероидов обладают должным эффектом [429]. Их инактивация в крови обеспечивается PON1, тогда как в легких PON1 отсутствует.

PON1 и детоксикация ФОС

PON1 играет ключевую роль в детоксикации ряда ФОС, гидролизуя их активные метаболиты (оксоны), что показано в исследованиях на животных моделях [430, 431]. PON1 гидролизует оксоны ряда фосфорорганических инсектицидов (например, параоксон, хлорпирифос-оксон, диазинон-оксон, пиримифос-метилоксон), а также нервно-паралитические боевые отравляющие вещества, такие как зарин, зоман, табун и в меньшей степени VX [410]. Данные, полученные на животных моделях [432, 433], убедительно показали основную роль параоксоназ в детоксикации тионфосфорильных ФОС, метаболизм которых идет по пути Р450 / PON1.

Живые организмы с низким уровнем параоксоназы (например, птицы) более восприимчивы к специфическим фосфорорганическим соединениям, чем животные с высоким уровнем активности этого фермента (например, крысы, мыши и в особенности кролики) [400, 433, 434]. Гидролизуя ФОС, PON1 тем самым нейтрализует их токсическое действие на организм. Однако параоксоназная активность фермента в крови человека относительно невысока имеет значительные индивидуальные различия [435]. Исследуется возможность применения препаратов рекомбинантной PON1 человека (rHuPON1) в качестве каталитического биоскэвенджера при отравлениях ФОС.

Возраст является существенным фактором, определяющим активность PON1. Исследования на грызунах показали, что в печени и сыворотке крови у новорожденных животных наблюдается очень низкий уровень активности PON1, который увеличивается до нормального уровня к 21 дню жизни [437, 438]. Низкий уровень активности параоксоназы у молодых животных частично объясняет наблюдаемую у них более высокую чувствительность к ФОС.

Низкая активность PON1 в процессе вынашивания плода может представлять собой фактор риска повышения восприимчивости к токсическому действию некоторых фосфорорганических инсектицидов. У детей до двух лет наблюдается минимальная активность PON1, и только к 9 годам ее активность достигает уровня активности у взрослых людей сохраняется примерно на постоянном уровне после достижения взрослого состояния [437]. С возрастом наблюдается прогрессирующее снижение активности PON1. Это может быть связано с развитием окислительного стресса при старении, и имеет влияние на повышение риска заболеваемости атеросклерозом у пожилых людей [443]. В связи с пониженным уровнем активности PON1 в детском и пожилом возрасте эти категории людей более восприимчивы к токсическому воздействию ФОС [441].

Генетический полиморфмзм PON1

Определяющее значение имеют два наиболее распространенных полиморфизма в кодирующей области гена: L55M (Leu/Met) и Q192R (Gln/Arg) [444], которые оказывают влияние на каталитическую активность параоксоназы [444−447]. Частота встречаемости Leu55 и Met55 составляет, соответственно, 0.65 и 0.35 в Соединенных Штатах и Европе, тогда как в Японии 0.94 и 0.06, соответственно [448, 449]. Вариант Leu55 имеет более высокую активность в отношении гидролиза фенилацетата, чем Met55 [450]. Замена Gln192Arg (Q192R), определяет различную каталитическую активность PON1 в отношении некоторых фосфорорганических субстратов и повышенную склонность к ишемической болезни сердца и смертности среди женщин во второй половине жизни [451]. Встречаемость Q192 варьирует в диапазоне от для кавказской популяции до 0.3 для некоторых азиатских популяций [452]. Примерно в 98% случаев вариант аллеля R192 связан с вариантом L55. Было показано, что R192-форма белка быстрее гидролизует параоксон, чем Q192-форма, тогда как для зарина, зомана, диазоксона наблюдается обратная катртина.

T-108C представляет собой полиморфизм тимидин/цитозин в промоторной области гена PON1, следствием которого является значительная вариабельность концентрации РON1 [433, 449, 450]. C-108T полиморфизм оказывает наибольший эффект на уровень PON1 в плазме, причем для -108C аллеля уровень активности PON1 в плазме вдвое превышает таковой для -108T аллеля. Эти генетические факторы в значительной мере определяют индивидуальную чувствительность к ФОС, понижая как активность фермента, так и его содержание в крови.

Важность статуса PON1 для оценки восприимчивости организма к токсичным веществам или риска развития сердечно-сосудистых заболеваний указывает и на значимость факторов, влияющих на активность PON1. Хотя генетические факторы, такие как полиморфизм, о котором было сказано ранее, играют главную роль в определении PON1-статуса человека, вклад других факторов в регуляцию деятельности фермента также имеет значение. Так, показана модуляция экспрессии гена PON1 у человека широким спектром соединений: статины, желчные кислоты, этанол [453], полифенолы, флавоноиды, антиоксиданты, ацетилсалициловая кислота. Также оказывают влияние факторы окружающей среды (активные формы кислорода и азота, табачный дым [454], тяжелые металлы). Атерогенная диета и воспалительные процессы также способны влиять на уровень экспресии гена PON1.

Таким образом, в организме PON1 выполняет защитную функцию при действии антихолинэстеразных соединений, в первую очередь ФОС, гидролизуя потенциальные нейротоксиканты, и является биомаркером чувствительности к ФОС;

обладает антиатерогенной активностью, в составе ЛПВП проявляет антиоксидантные свойства, снижая риск заболеваний сердечно-сосудистой системы;

модулирует метаболизм лекарств, гидролизуя фармакологически значимые соединения, а также детоксицирует широкий спектр ксенобиотиков.

В связи с этим уровень активности PON1 в крови является важным показателем как для предсказания индивидуальной чувствительности к действию ФОС, так и для оценки риска кардиоваскулярных заболеваний, а также при проведении экспериментальных исследований в токсикологии и фармакологии.

Обзор литературных источников показал, что АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и PON1 играют важнейшую роль в организме человека и могут служить индикаторами различных патологических состояний, в том числе и вызванных контактами с токсичными ФОС и карбаматами. Показана важная роль ингибиторов АХЭ, БХЭ и КЭ как фармакологических препаратов. Отмечена значимость анализа активности указанных эстераз для своевременной диагностики и подбора индивидуальной лекарственной терапии в клинической практике и токсикологии.