Приготовление препаратов тканей (мозга и крови)

Кровь и мозг мышей получали от самцов белых аутбредных мышей линии CD1 весом 20−25 г в возрасте 1.5 — 2 месяцев (Пущино, Россия), кровь крыс получали от самцов крыс популяции Wistar весом 160−180 г в возрасте 1.5 месяцев (Пущино, Россия), мозг кур получали от взрослых белых кур породы Леггорн весом 1.5−2 кг в возрасте 18 месяцев (Ногинская птицефабрика, Россия). Содержание животных и все манипуляции осуществляли в соответствии с требованиями комиссии ИФАВ РАН по биоэтике и «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н). Животных умерщвляли декапитацией в условиях CO2-анестезии.

Получение 9S фракции гомогената головного мозга мышей и кур.

Головной мозг мышей и кур после декапитации быстро выделяли на холоду, промывали раствором 0.9% (в/об) NaCl, осушали, взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70oC. Перед проведением измерений мозг медленно размораживали на льду, гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера (тефлон — стекло) при t = 40C в рабочем буфере (50 мМ трис-HCl, 0.2 мМ ЭДТА, pH 8.0) в соотношении 1 г ткани: 5мл буфера. Гомогенат центрифугировали на центрифуге К-24 (Германия) при 4оС в течение 15 мин при 9000Чg. Полученный супернатант 9S аликвотировали в пластиковые пробирки Eppendorf, замораживали в жидком азоте и хранили при -70oC до проведения измерений. Концентрация белка в гомогенатах мозга мыши составляла 5.9 -7.6 мг/мл (N=20), в 9S гомогенатах мозга кур 6.9 — 7.2 мг/мл (N=8).

Кровь мышей и крыс после декапитации собирали в стеклянные стаканчики, которые предварительно ополаскивали 3.8% (в/об) цитратом натрия. Сбор крови крыс проводили в стеклянные стаканчики, содержащие 3.8% цитрата натрия в соотношении 0.2 мл антикоагулянта на 1 мл крови. Для сбора крови мышей в качестве антикоагулянта добавляли гепарин (20 мкл раствора 500 E/мл). Затем кровь аликвотировали в пластиковые пробирки Eppendorf, замораживали в жидком азоте и хранили при -70oC до проведения измерений.

Образцы цельной крови человека получали от 9 здоровых добровольцев (женщины в возрасте 30−55 лет), не подвергавшихся воздействию антихолинэстеразных веществ. Забор крови проводили в условиях медицинского стационара с помощью вакуумной системы «Вакуэт» в пробирки с антикоагулянтом (цитрат натрия 3.8% в/об, при соотношении 0.2 мл антикоагулянта на 1 мл крови). Затем кровь аликвотировали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70oC до проведения измерений.

Плазму крови получали центрифугированием свежих образцов крови при 2500Чg в течение 15 минут на центрифуге Eppendorf 5702, аликвотировали в пластиковые пробирки, замораживали в жидком азоте и хранили при -70oC до проведения измерений.

Приготовление препаратов гемолизованной крови. Замороженную и хранящуюся при -70єC кровь оттаивали на водяной бане со льдом. Затем готовили 1:100 гемолизаты путем разбавления 1 объема крови в 100 объемах охлажденного на водяной бане со льдом соответствующего буфера: 0.1 М K-Na-фосфатный буфер pH 7.5 для АХЭ и БХЭ; 0.1 М K-Na-фосфатный буфер pH 8.0, содержащий 2 мМ ЭДТА для КЭ и 0,1 М трисHCl буфер pH 8.0, содержащий 1 мМ CaCl2 для PON1. После тщательного перемешивания на холоду в течение 2 минут гемолизованную кровь аликвотировали в пластиковые пробирки Falcon, немедленно замораживали в жидком азоте для обеспечения полноты гемолиза и хранили при -20єC до проведения исследований. Перед началом анализа образцы медленно оттаивали на водяной бане со льдом. Концентрация белка в препаратах цельной крови мышей составляла 11.3−18.7 мг/мл (N=24).

Определение концентрации белка в препаратах тканей проводили по методу Брэдфорда с использованием сывороточного альбумина в качестве стандарта [461].

Перед определением активностей исследуемых ферментов в тканях мы исследовали зависимость скорости гидролиза соответствующих субстратов от количества плазмы, крови и 9S гомогената мозга в реакционной смеси. Из линейных участков зависимостей были выбраны объемы плазмы, крови и 9S гомогената мозга с достаточной скоростью гидролиза для стандартного определения активности ферментов.

В качестве примера на Рисунке 2.2.-5 приведены зависимости скорости гидролиза АТХ от количества крови мыши и БТХ от количества 9S фракции Аналогичным образом были подобраны количества крови и плазмы человека, мыши и крысы, а также количества 9S фракции гомогената мозга мышей и кур для определения активности всех исследуемых ферментов в стандартных условиях.