Методы определения кротонового альдегида в пищевых продуктах

Обеспечение безопасности пищевой продукции, в том числе винодельческой, является одной из важнейших и актуальных стратегических задач любого государства, заботящегося о здоровье своих граждан. Необходимость ужесточения мер, направленных на выявление и уничтожение некачественной и небезопасной продукции, обусловлена, в первую очередь, возросшим числом случаев отравления и повышением уровня смертности населения, в том числе от суррогатного алкоголя. Многие продукты питания производятся путем микробного синтеза, в результате таких биохимических превращений могут образовываться побочные вещества, обладающие токсичным действием. К ним относятся микотоксины, биогенные амины и др.

Исследования алкогольных напитков учеными разных стран мира [1,2,3] свидетельствуют о том, что в алкогольной продукции могут содержаться в небольших количествах 2-пропеналь (акролеин, акрилальдегид) и 2- бутеналь (кротоновый альдегид). Как указывают некоторые авторы [4] эти компоненты могут образовываться в результате жизнедеятельности бактерий или в качестве побочных продуктов в процессе перегонки. вино кротоновый альдегид спектрофотометрия Кротоновый альдегид (2-бутеналь) является раздражающим веществом, входит в список «особо опасных веществ», указанных в Emergency Planning and Community Right-to-Know Act федерального закона США. Широко распространен в природе. Содержится в некоторых продуктах питания, например, в соевом масле [5]. Кротоновый альдегид относится к нестойким соединениям, на воздухе постепенно окисляется. Это вещество является сильным лакриматором, при попадании на кожу вызывает местную воспалительную реакцию с последующим изъязвлением верхнего слоя кожи. ПДК составляет 0,5 мг/м³. [6]. Данное вещество входит в перечень вредных веществ 3 класса опасности, содержание которого регламентируется в питьевой воде [7].

Исследованиями японских ученых установлено, что кротоновый альдегид вызывает болезнь Альцгеймера [8]. Токсичные свойства кротонового альдегида определяются его высокой реакционной способностью.

Известно, что кротоновый альдегид может содержаться в сигаретном дыме [9], в дыме, с помощью которого коптят рыбные продукты [10], а также в алкогольных напитках [11].

Важным аспектом проблемы является идентификация и количественное определение кротонового альдегида в пищевых продуктах в виду его особенных химических свойств.

В литературе приводится широкий набор методов определения содержания кротонового альдегида в пищевых продуктах как с помощью жидкостной, так и газовой хроматографии. Учеными [10] предложен метод определения кротонового альдегида в составе других альдегидов в рыбных продуктах путем жидкостной хроматографии с предварительной дериватизацией 2,4- динитрофенилгидразином и при длине волны 360 нм.

Авторы [11] предложили способ определения кротонового альдегида (2-бутеналь) в спиртосодержащих средах с помощью жидкостной хроматографии. Сущность метода заключается в предварительной перегонке спиртосодержащей смеси и анализе отгона на жидкостном хроматографе оснащенном колонкой RP-18 и спектрофотометрическим детектором 220 нм. В качестве элюента используется смесь метанол/вода в соотношении 25/75 соответственно. Предел обнаружения 2-бутеналя — 50 мгк.

В 2001 году на территории Российской Федерации вступил в силу ГОСТ Р 51 786−2001 [12], устанавливающий газохроматографический метод определения подлинности водки и спирта этилового из пищевого сырья по содержанию токсичных микропримесей: сивушного масла (2-бутанола, 1-пентанола, 1-гексанола), кротональдегида, кетонов (ацетона и 2-бутанона), ароматических спиртов (бензилового и 2-фенилэтанола), ароматического альдегида (бензальдегида), этилового эфира, сложных эфиров (изобутилацетата, этилбутирата), диэтилфталата.

Данный метод предусматривает одновременное определение содержания токсичных микропримесей, характерных для водки и спирта: метилового спирта (метанолом), сивушного масла (2-пропанола, 1-пропанола, изобутилового спирта, 1-бутанола, изоамилового спирта), уксусного альдегида, сложных эфиров (метилацетата, этилацетата). Диапазон измеряемых объемных долей метилового спирта составляет от 0,0001 до 0,1%, массовых концентраций остальных токсичных микропримесей — от 0,5 до 1000 мг/дм³.

Согласно данному стандарту, водка или спирт этиловый, в которых идентифицирован кротоновый альдегид, относятся к продуктам, полученным не из пищевого сырья, то есть фальсифицированными.

Исследования Савчука С. А. [13] позволили установить, что кротоновый альдегид не является маркером подлинности спиртосодержащих продуктов и его наличие характерно для некоторых пищевых продуктов и для этилового спирта любого происхождения.

В 2007 году вступил в действие ГОСТ Р 52 788−2007 [14]. Настоящий стандарт распространяется на этиловый спирт, полученный из пищевого или непищевого сырья, денатурированный кротоновым альдегидом, и спиртосодержащую пищевую продукцию, а также спиртные напитки и устанавливает газохроматографический метод определения объемной доли кротонового альдегида. Диапазон измеряемых объемных долей кротонового альдегида составляет от 0,10% до 0,40%.

На базе научного центра виноделия ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии в 2013 г. был разработан, апробирован и аттестован метод определения кротонового альдегида с помощью газовой хроматографии [15].

Настоящий стандарт распространяется на продукцию винодельческую и устанавливает газохроматографический метод определения массовой концентрации кротонового альдегида. Диапазон измеряемых массовых концентраций — от 0,2 до 5,0 мг/дм³. Разработанный метод основан на хроматографическом разделении летучих органических примесей, в том числе кротонового альдегида, с использованием капиллярных колонок и последующем детектировании пламенно-ионизационным детектором с применением градуировки методом внутреннего стандарта. Разработанный метод хорошо зарекомендовал себя при анализе алкогольной продукции на наличие кротонового альдегида.

Однако, недостатками вышеописанных методов определения кротонового альдегида в пищевых продуктах с помощью газовой и жидкостной хроматографии являются значительные трудои материалозатраты. Используемое оборудование является современным, высокоточным, но дорогостоящим в приобретении и использовании.

С целью разработки метода определения кротонового альдегида в винодельческой продукции необходимо решить следующие задачи:

• 1. осуществить подбор оптимальных параметров и условий анализа кротонового альдегида в вине;
• 2. подобрать условия для выделения кротонового альдегида из анализируемой пробы вина;
• 3. провести сличительные испытания разработанного метода с существующими аттестованными методами определения кротонового альдегида;
• 4. осуществить апробацию разработанного метода в лабораторных условиях на опытных образцах винодельческой продукции.

Проведенные исследования по подбору оптимальных условий для анализа кротонового альдегида в винодельческой продукции, в частности винах столовых, позволили разработать качественный метод определения кротонового альдегида в вине с помощью спектрофотометрии.

В основу разработанного метода положен принцип качественной реакции, основанный на взаимодействии веществ с образованием окрашенного продукта.

Существует метод определения кротонового альдегида в воздухе рабочей зоны, основанный на образовании окрашенного соединения в результате взаимодействия кротонового альдегида с бензидином в уксуснокислой среде [16]. Недостатком вышеописанного способа является то, что присутствие в анализируемой среде ацетальдегида, который всегда присутствует в вине, мешает выполнению анализа.

Известно, что ненасыщенные альдегиды при взаимодействии с сульфаниловой кислотой образуют окрашенный продукт реакции [17]. Этим свойством обладают акролеин и кротоновый альдегид, присутствие других альдегидов в пробе не мешает протеканию качественной химической реакции.

В ходе исследований были поставлены эксперименты по определению содержания кротонового альдегида методом прямого добавления сульфаниловой кислоты в присутствии нитрита натрия в вино, однако были получены отрицательные результаты. Этот факт объясним присутствием в вине фенольных веществ, обуславливающих окраску вина и мешающие определению оптической плотности образовавшегося в ходе химической реакции кротонового альдегида с сульфаниловой кислотой окрашенного продукта.

Трудности, возникающие при исследовании таких объектов как вино, обусловлены следующими причинами: сложность разделения многокомпонентных систем, очистки от балластных веществ и примесей традиционными методами (например, экстракцией в системе жидкость — жидкость), а также сложность концентрирования разбавленных растворов. Решение такого рода проблем возможно при применении на стадии пробоподготовки метода твердофазной экстракции, позволяющего осуществлять одновременное выделение и концентрирование целевых компонентов. Такой подход дает возможность получения веществ в чистом виде, что в дальнейшем позволяет проводить идентификацию методом капиллярного электрофореза. Кроме того, использование твердофазной экстракции расширяет пределы применения методов тонкослойной и газовой хроматографии.

Пробоподготовка осуществляется с помощью патронов, заполненных силикагелем или модифицированными сорбентами на его основе. Подбор и варьирование типов патронов, а также применение различных растворителей в качестве элюентов дает возможность проводить одновременно процессы разделения, выделения, очистки и концентрирования веществ с высокой скоростью и эффективностью.

Результаты исследований показали, что, несмотря на эффективность очистки экстракта от нежелательных примесей, применение концентрирующих патронов не приводит к положительным результатам по определению кротонового альдегида в пробе вина.

При анализе спиртосодержащих продуктов очень часто применяют метод перегонки, т. е. способ отделения веществ, основанный на различных температурах кипения. Результаты исследований показали, что полученный в результате перегонки отгон пробы вина содержит кротоновый альдегид в случае его присутствия в опытном образце вина.

Экспериментальным путем были подобраны концентрации и объемы необходимых химических реактивов для идентификации кротонового альдегида в отгоне вина. Добавление к отгону вина, содержащему кротоновый альдегид, химических растворов в следующей последовательности: соляной кислоты, нитрита натрия, сульфаниловой кислоты и сернистой кислоты, приводит к получению окрашенного продукта химической реакции, оптическую плотность которого определяют при длине волны 435 нм. В качестве раствора сравнения служит контроль, который готовят одновременно и аналогично пробе.

Продолжительность анализа — не более 60 мин.

Анализ оптической плотности опытных образцов в сравнении с контролем осуществляли с помощью спектрофотометра «UNICO» модель 1201 (Производитель: ООО «Юнико-СиС», г. Санкт-Петербург).

При анализе использовали следующие реактивы и растворы:

• — азотная кислота по ГОСТ 4461–77;
• — сульфаниловая кислота по ГОСТ 5821–78;
• — натр едкий по ГОСТ 2263–79;
• — 0,3% раствор нитрита натрия в воде.
• — кислота соляная, разбавленная 1:4.
• — кислота серная, разбавленная 1:4;
• — раствор сульфанилата натрия готовится путем растворения 8 г сульфаниловой кислоты в 150 мл 2-% раствора едкого натра;
• — кротоновый альдегид производства фирмы «Merck» с массовой долей основного вещества не менее 98%.

При работе со спектрофотометром использовали кюветы толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Проведенные сличительные испытания и апробация разработанного качественного метода определения кротонового альдегида в вине показали, что предел обнаружения равен 0,1 мг/дм³.

Выводы

В процессе выполнения работы осуществлен анализ существующих методов определения кротонового альдегида в пищевых продуктах. Разработан и апробирован в лабораторных условиях качественный метод определения содержания кротонового альдегида в столовых винах, основанный на взаимодействии кротонового альдегида с сульфаниловой кислотой в присутствии нитрита натрия с образованием окрашенного в желтый цвет красителя и последующем измерении окрашенного продукта реакции при длине волны 435 нм.

Работа выполнена в рамках регионального гранта РФФИ 13−08−96 506 р_юг_а «Исследование механизмов и закономерностей биосинтеза биогенных аминов и кротонового альдегида биосистемами дрожжей и молочнокислых бактерий».

Библиографический список

• 1 Dubois, P. Ann Technol Agric / P. Dubois, A. Parfait, J. Dekimpe. 1973. 22:131
• 2 Sponholz, W-R Z Lebensm Unters Forsch / W-R Sponholz. 1982. 174:458
• 3 Greenhoff, K. Analysis of beer carbonyls at the part per billion level by combined liquid chromatography and high pressure liquid chromatography / K. Greenhoff, R. E. Wheeler // Journal of the Institute of Brewing.1981. №, 86.P. 35−41.
• 4 Serjak WC, Day C, Van Lanen JM, Boruff CS (1954) Appl Microbiol 2:4
• 5 Schulz, R. P. Crotonaldehyde and Crotonic Acid / R. P. Schulz, J. Blumenstein, C. Kohlpaintner // Ullmann’s Encyclopedia of Chemical Technology, Wiley-VCH, Weinheim: 2005.
• 6 Kirk Othmer encyclopedia, 3 ed., v. 7, N.Y., 1979, p. 207.
• 7 СанПиН 2.1.4.1074−01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения».
• 8 Kawaguchi-Niida, M. Crotonaldehyde accumulates in glial cells of Alzheimer’s disease brain / M. Kawaguchi-Niida //Acta Neuropathol. 2006. 111: 422−429.
• 9 Kataoka, H. Determination of Aliphatic and Aromatic Aldehydes in Cigarette Smoke by Gas Chromatography with Flame Photometric Detection / H. Kataoka, A. Sumida, M. Makita // Chromatographia Vol. 44, No. 9/10, May 1997. P. 491−496.
• 10 Varlet, V. Volatile aldehydes in smoked fish: Analysis methods, occurence and mechanisms of formation / V. Varlet, C. Prost, T. Serot / Food Chemistry 105. 2007. Р. 1536−1556.10 Von Drews B, Specht H, Brfimmer J-M (1965) Branntweinwirtschaft 105:77.
• 11 Lehtonen, P. Liquid Chromatographic Determination of 2-Propenal (Acrolein) and 2-Butenal (Crotonaldehyde) from Water-Ethanol Mixtures / P. Lehtonen, R. Laakso, E. Puputti / Z Lebensm Unters Forsch. 1984. 178: P. 487−489.
• 12 ГОСТ Р 51 786−2001 «Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод определения подлинности».
• 13 Савчук, С. А. Новые методические подходы к контролю качества алкогольной продукции и к выявлению наркотических веществ в биологических средах хроматографическими и хромато-масс-спектрометрическими методами: Автореф. дис. …д-ра хим. наук. С.-П., 2012. 48 с.
• 14 ГОСТ Р 52 788−2007 «Спирт этиловый и спиртосодержащая продукция. Газохроматографический метод определения содержания кротонового альдегида (денатурирующей добавки)».
• 15 Марковский, М. Г. Кротоновый альдегид: причины образования и методика определения / Марковский М. Г., Гугучкина Т. И., Агеева Н. М. // Биологизация и экологизация технологии производств — приоритетные направления развития виноделия: Научные труды ГНУ СКЗНИИСиВ (Материалы научно-практического форума «Роль экологизации и биологизации в повышении эффективности производства плодовых культур, винограда и продуктов их переработки»), г. Краснодар. 2013. Том. 4. С. 185−187.
• 16 МУК 4.1.241−96 Фотометрическое измерение концентрации метакролеина в воздухе рабочей зоны.
• 17 Технические условия на метод определения кротонового альдегида в воздухе [электронный ресурс: точка доступа http://www.libussr.ru/doc_ussr/usr_6652.htm].