Влияние источника углерода на устойчивость к тяжелым металлам штаммов нефтеокисляющих актинобактерий, используемых в процессах биоремедиации

Из множества различных углеводородных контаминаций первое место по праву занимают нефтешламы, представляющие собой продукты длительного хранения нефти и нефтепродуктов с преобладанием тяжёлых фракций углеводородов, которые существенно усложняют процесс микробиологической детоксикации загрязнённого объекта. Дополнительную трудность для процесса биоремедиации представляют, содержащиеся в нефтешламах тяжёлые металлы. Ранее показано, что металлы могут замедлять или полностью подавлять рост микроорганизмов, вследствие повреждения какой-либо одной метаболической функции или сразу нескольких [1]. Степень ингибирования зависит от wконцентраций, влияющих на рост факторов. При концентрациях ингибитора не приводящих к гибели клеток происходит изменение биологического состава микробной биомассы, кинетических характеристик культуры и появление физиологических типов, устойчивых к действию ядов [2, 3] Известно, что часть тяжёлых металлов, содержащиеся в нефтешламах, такие, как медь, цинк, кобальт, никель, железо, в наномолярных концентрациях необходимы для жизнедеятельности микроорганизмов, но в микрои миллимолярных концентрациях являются токсичными для них. Другие же металлы (ртуть, кадмий) оказывают ингибирующее воздействие на микроорганизмы даже в миллимолярных концентрациях [4].

Цель настоящей работы — изучить устойчивость к железу, никелю, меди, цинку, кобальту, свинцу, ртути и кадмию некоторых штаммов нефтеокисляющих актиномицетов при использовании различных углеводородов в качестве источника углерода. А также проследить за изменением нефтеокисляющей активности в зависимости от присутствия тяжёлых металлов в среде. Полученные данные будут использованы в процессах биоремедиации, а также при создании регионально адаптированных нефтеокисляющих препаратов.

нефтеокисляющий актиномицет углерод металл МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали штаммы нокардиоморфных актиномицетов, выделенные из нефтешламов и нефтезагрязнённых почв Краснодарского края, находящихся в коллекции кафедры генетики и микробиологии Кубанского госуниверситета (Rhodococcus erythropolis. F1, Rhodococcus erythropolis B2, Arthrobacter sp. N15, Gordonia sp. K6, Micrococcus sp. 25, Rhodococcus sp. J8, Rhodococcus sp. 45, Rhodococcus sp. 1167). Идентификацию бактерий проводили согласно определителю Берги 9 издание [11]. Данные штаммы обладают характеристиками, позволяющими использовать их в процессах биоремедиации, а также создать на их основе серию регионально адаптированных нефтеокисляющих биопрепаратов для реабилитации экосистем, загрязнённых нефтепродуктами.

При выращивании бактерий для определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) металлов использовали плотную минимальную среду [12] с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии 1% сахарозы, дизельного топлива, нефти или мазута в зависимости от условий эксперимента. Для изучения влияния МИК на степень деструкции углеводородов использовали минеральную жидкую среду с углеводородами [12]. Для эксперимента были взяты следующие металлы, наиболее часто встречающиеся в нефтешламах: Cd (III), Cu (II), Zn (II), Ni (II), Pb (II), Hg (II), Co (II), Fe (III). Исследуемые штаммы бактерий выращивали в условиях глубинного культивирования при 25С на круговых качалках (150 об/мин) в качалочных колбах объёмом 250 мл с 50 мл питательной среды. В качестве посевного материала использовали трёхсуточные монокультуры, полученные на мясо — пептонном бульоне. Количество остаточных углеводородов определяли путем их экстракции гексаном с последующим измерением в анализаторе жидкости флюорат 02−3 М и гравиметрически.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Значительные успехи достигнуты в изучении резистентности к тяжелым металлам при использовании легко метаболизируемых источников углерода (глюкоза, сахароза, пируват) [5, 6, 7]. А также при оценке токсического воздействия тех или иных металлов на почвенное микробное сообщество [8, 9, 10]. Однако, опираясь на эти работы нельзя с уверенностью сказать о степени устойчивости к тяжелым металлам отдельных штаммов актиномицетов, часто используемых в процессе очистки углеводородзагрязнённого объекта. В ходе биологической детоксикации нефтешламов также возникает вопрос об устойчивости применяемых в очистке штаммов бактерий к тяжелым металлам в зависимости от углеводородного субстрата. В качестве объекта исследования нами были отобраны 8 штаммов актиномицетов, относящихся к различным таксономическим группам, обладающих наибольшей нефтеокисляющей активностью и успешно используемых в биоремедиации.

При определении МИК тяжёлых металлов источниками углерода служили: сахароза, как наиболее доступный субстрат, а также различные углеводороды, которые являются наиболее распространёнными поллютантами. Наибольшей устойчивостью к тяжёлым металлам обладают микроорганизмы, принадлежащие к роду Rhodococcus (рис. 1−5).

Рис. 1. Изменение МИК металлов при культивировании штамма

Rhodococcus erythropolis. F1 на различных источниках углерода.

Рис. 2. Изменение МИК металлов при культивировании штамма Rhodococcus erythropolis B2 на различных источниках углерода

Рис. 3. Изменение МИК металлов при культивировании штамма Rhodococcus sp. J8 на различных источниках углерода

Рис. 4. Изменение МИК металлов при культивировании штамма Rhodococcus sp. 45 на различных источниках углерода

Рис. 5. Изменение МИК металлов при культивировании штамма Rhodococcus sp. 1167 на различных источниках углерода

Наиболее чувствительными оказались представители родов Arthrobacter, Gordonia, и Micrococcus (рис. 6−8).

Рис. 6. Изменение МИК металлов при культивировании штамма Gordonia sp. K6 на различных источниках углерода

Рис. 7. Изменение МИК металлов при культивировании штамма Arthrobacter sp. N15 на различных источниках углерода

Рис. 8. Изменение МИК металлов при культивировании штамма Micrococcus sp. 25 на различных источниках углерода

Порог чувствительности последних был почти вдвое ниже, чем у родококков. Различные источники углерода существенно влияли на степень устойчивости к металлам. Так при использовании в качестве источника углерода легко метаболизируемых углеводородов (дизельное топливо и, в некоторых случаях, сырая нефть) отмечалось увеличение устойчивости к повышенным концентрациям тяжёлых металлов по сравнению с опытом, где в качестве источника углерода использовалась сахароза (рис. 1−8). На средах с мазутом в качестве источника углерода уровень устойчивости к тяжелым металлам несколько снижался по сравнению с дизельным топливом, и приблизительно соответствовал таковому при использовании сред с сахарозой.

При изучении влияния тяжёлых металлов на деструктивную активность нефтеокисляющих штаммов актиномицетов культуры высевались на среды с углеводородами, дополнительно содержащие тяжелые металлы в количестве 50% от МИК. В процессе инкубирования выяснилось, что наиболее сильно на процесс утилизации нефтепродуктов влияют Hg (II) и Cu (II), а наименее — Fe (III) и Ni (II), уровень влияния остальных металлов варьирует в зависимости от штамма (Таблица 1). Как следует из таблицы все металлы в зависимости от степени ингибирования процесса деградации углеводородов можно расположить в следующей последовательности: Fe2+>Ni2+>(Cd3+, Zn2+, Pb2+, Co2+)>Cu2+>Hg2+.

Таблица 1. Степень деструкции углеводородов штаммами актиномицетов в зависимости от присутствия тяжёлых металлов в среде.

Наибольшую нефтеокисляющую активность в присутствии металлов сохраняют штаммы, относящиеся к роду Rhodococcus, затем следуют штаммы Gordonia sp. K6 и Arthrobacter sp. N15, наименьшую активность проявляет штамм Micrococcus sp. 25.

Таким образом, проведённые нами опыты показали, что степень устойчивости исследуемых штаммов актиномицетов к тяжёлым металлам зависит от источника углерода и таксономической принадлежности микроорганизмов. При использовании данных культур микроорганизмов как основы биопрепарата для углеводородзагрязнённых территорий с повышенным содержанием тяжёлых металлов следует учитывать не только количественный, но и качественный состав поллютанта.

Штаммы Rhodococcus erythropolis B2, Rhodococcus erythropolis F1, Rhodococcus sp J8 могут быть иcпользованы в качестве основы при создании нефтеокисляющего биопрепарата, способного ликвидировать нефтяные загрязнения при наличии высоких концентраций тяжёлых металлов в среде.

Работа выполнялась в рамках проекта «Разработка научно-обоснованных подходов к культивированию биотехнологически перспективных микроорганизмов-нефтедеструкторов для создания регионально-адаптированных биопрепаратов» .

• 1. Ашмарин И. П., Ключарёв Л. А. // Ингибиторы синтеза белка. Л. 1975.
• 2. Александров В. Я. // Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука. 1975.
• 3. Фуряева А. В., Письман Т. И., Печуркин Н. С., Елпина Т. В. // Управление биосинтезом водородных бактерий и других автотрофов. Красноярск. 1976.
• 4. Hughes M. N, Pool R.K. // Metals and microorganisms. N.Y. 1986.
• 5. Семёнов А. М., Ховрычев М. П. Ингибирование роста Candida utulis некоторыми тяжёлыми металлами // Микробиология. 1979. Т.48. № 6 С. 1120.
• 6. Анисимова Л. А., Сиунова Т. В., Боронин А. М. Устойчивость к металлам грамотрицательных бактерий, изолированных из почв и сточных вод промышленных районов // Микробиология. 1993. Т62. № 5 С. 843.
• 7. Knight B.P., MeGrath S.P., Chaudri A.M. Biomass carbon measurements and substrate utilization patterns of microbial population from soils amended with cadmium, copper, or zinc. Applied and Environmental Microbiology. 1997. V.63. P.39−43
• 8. Kabata-Pendias A. Behavioural properties of trace metals in soils. Applied Geochemistry 1993. № 2. P.3−9
• 9. Scott-Fordsmund J.J. Toxicity of nickel to soil organisms in Denmark. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 1997. V.148. P.1−34
• 10. Giller K.E., Witter E., MeGrath S.P. Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils. Soil Biology & Biochemistry. 1998. V.30. P.1389−1414
• 11. Определитель бактерий Берджи 9 изд. / Москва. 1997. 799с.
• 12. Герхардт Ф. // Методы общей бактериологии. Москва 1983. Т1. 536с.