Получение низкомолекулярных пептидов молока и исследование их иммуностимулирующей активности

Около пятидесяти лет назад было установлено, что пептиды экзогенного происхождения молекулярной массой 1500−5500 Да, зашифрованные в аминокислотной последовательности некоторых пищевых белков могут оказывать влияние на координацию функций многоклеточных организмов. В результате многолетних исследований показано, что факторы пептидной природы, получаемые в процессе гидролиза белков молока являются одними из наиболее физиологически активных, воздействуя на пищеварительную, иммунную, сердечно-сосудистую и нервную системы [1].

Цель работы Рационализация условий получения низкомолекулярных пептидов (НМП) 1500−5000 Да протеолизом белков молока препаратом «Панкреатин»; исследование образцов кисломолочных продуктов на наличие НМП; определение влияния НМП на иммунный статус организма; изучение влияния НМП на физико-химические показатели кисломолочного напитка смешанного брожения.

Материалы и методы пептид белок молоко низкомолекулярный При получении НМП использовались: обезжиренное коровье молоко (массовая доля жира не более 0.05%), ферментный препарат «Панкреатин» производства ЗАО «Фармпроект», хлороформ, культуры молочнокислых бактерий Streptococcus lactis, Lactobacillus acidophilus, а также естественные симбиотические закваски кумысная и кефирная из коллекции микроорганизмов кафедры технологии молока и пищевой биотехнологии СПбГУНиПТ. Выработка образцов кисломолочных продуктов проводилась при общепринятых продолжительности и температуре сквашивания, в случае продуктов смешанного брожения также присутствовала стадия созревания.

Молекулярно-массовое распределение (ММР) продуктов расщепления белков молока анализировали методом эксклюзионной аналитической гель-проникающей хроматографии на колонках с Sephadex G-75-medium и G-50-medium. Вариант элюирования — изократический, размеры аналитической колонки 0,5Ч0.015 м, элюент 0.15 М раствор хлорида натрия, скорость пропускания 20 млч перистальтическим насосом LKB Bromma 2132. Линейные области частных калибровочных кривых для Sephadex G-75-medium (y=-0,0546x + 5,8857, стандартная ошибка 0,0349, коэффициент корреляции 0,9951) и G-50-medium (y=-0,0727x + 6,3127, стандартная ошибка 0,2045, коэффициент корреляции: 0,9624) представлены на рисунках 1 и 2 соответственно. Математическая обработка экспериментальных данных проводилась с использованием пакетов программ MS Office 2010, CurveExpert 1.4.

Рисунок 1. Калибровочная кривая Рисунок 2. Калибровочная кривая Sephadex G-50-medium Sephadex G-75-medium.

В качестве детектора использовали проточный спектрофотометр LKB Bromma 2138 Uvicord S при длине волны 230 нм, которая является наиболее специфической для белков и пептидов, чувствительность 0.5. Данный этап экспериментов проводился на базе лабораторий № 9 (синтеза пептидов и полимерных микросфер) и № 5 (природных полимеров) ИВС РАН.

Клинические исследования проводились на линейных белых крысах 21 дневного возраста с первоначальным весом 84±3 г. Для каждой кратности эксперимента использовались животные одного помета. Учет величины антимикробных свойств сыворотки крови (БАСК) проводили фотоэлектронефелометрическим способом по методу О. В. Смирновой и Т. А. Кузьминой. Показатель лизоцимной активности сыворотки крови (ЛАСК) определяли фотоэлектроколориметрическим методом по А. Г. Дорофейчуку [2]. Определение фагоцитарной активности (ФА) лейкоцитов in vitro проводили по методу Е. А. Коста и М. И. Стенко (1947) [3]. Данный этап экспериментов проводился на базе кафедры физиологии СПбГАВМ.

Обсуждение результатов Первая часть экспериментов была направлена на рационализацию условий получения НМП расщеплением белков молока посредством ферментного препарата «Панкреатин»: фермент-субстратное соотношение (ФСС), продолжительность и температура ферментации, рН молока.

Установлено, что увеличение массы вносимого фермента от 0.01% до 0.4% от массы ферментируемой смеси позволяет повысить выход НМП до 75−77% (рис. 1), дальнейшее увеличение данного показателя не рационально, т.к. приводит к избыточному накоплению потенциально аллергенных материалов ферментного препарата в гидролизате, а также к удорожанию процесса.

При изучении влияние продолжительности ферментации выявлено, что накопление НМП происходит в течение 22−26 часов, причем, в первые 4−5 часов термостатирования пептидный профиль полученных гидролизатов претерпевает наиболее значительные изменения, что выражается в увеличении содержания искомой фракции приблизительно до 75−76%, в то время как дальнейшее ведение процесса несущественно повышает данный показатель (78−79%).

Ввиду того, что в состав «Панкреатина» входят протеолитические ферменты трипсин и химотрипсин с различными температурными и рН оптимумами (37 °С, 7.7−8.1 и 50 °C, 7.9−9.1 соответственно) необходима рационализация процесса по данным показателям. Установлено, что при 42−44 °С достигается предельное накопление НМП 72−74%, дальнейшее повышение температуры термостатирования приводит к значительному снижению выхода искомой фракции, с преобладанием практически не подвергшихся гидролизу белков молока — гидролизатов молекулярной массой 16−106 кДа (рис. 3).

На основании анализа биохимической кинетики показано, что рН-статирование обезжиренного молока оказывает значительное влияние. Так, при рН молока 5.0 содержание фракции НМП составляет 23−24% от общего содержания веществ пептидной природы в гидролизате и продолжает увеличиваться до максимальных при данных условиях 75−76% при рН 7.5−7.8. Необходимо отметить, что предпочтителен способ получения НМП без рН-статирования, т.к. при значениях рН 7.1−7.3, что соответствует собственному значению рН, обезжиренного молока выход НМП составляет 72−74%, что незначительно отличается от вышеприведенных показателей. Кроме того, катионы натрия, накапливающиеся в процессе добавления гидроксида натрия вероятно способны негативно сказаться на органолептических показателях и биологической ценности в дальнейшем.

Анализ литературы по проблеме микробиального гидролиза белков молока с целью получения биоактивных пептидов показал, что в данной области достаточно активно занимаются за рубежом [2−4]. Публикации отечественных исследователей по выделению и изучению биоактивных пептидов из белков молока, гидролизованного культурами молочнокислых бактерий, практически отсутствуют.

На наш взгляд проблему получения и использования биоактивных пептидов молока можно решить за счет традиционных кисломолочных продуктов. В этой связи актуально провести мониторинг молочных продуктов по вопросу содержания НМП, обладающих биологической активностью.

В следующей серии экспериментов были исследовано 4 образца, представляющие собой обезжиренное пастеризованное при 87±2 °С в течение 20 мин, сквашенное: Str. thermophilus (образец 1), Lbc. acidophilus (образец 2), а также кефирной (образец 3) и кумысной (образец 4) закваской.

Рисунок 5. Хроматограмма образца 1 Рисунок 6. Хроматограмма образца 2.

Рисунок 7. Хроматограмма образца 3 Рисунок 8. Хроматограмма образца 4.

Из представленных рисунков, наибольшее количественное содержание фракции НМП наблюдается в образце 4, также следует отметить отсутствие областей перекрывания пиков с близлежащей высокомолекулярной фракцией, другими словами, не происходит накопление веществ пептидной природы с промежуточными молекулярными массами, способными осложнить процесс последующей очистки НМП. Высота и ширина пиков свидетельствуют о высокой эффективности и достаточной селективности подобранной колонки в данном случае.

В образцах 1, 2, 3 относительно небольшое образование НМП на фоне более широкого спектра гидролизатов по молекулярной массе, четко прослеживается накопление пептидов молекулярной массой 3,2−4,4 кДа, 16,3−29 кДа и 96−100 кДа.

В биологическом эксперименте использовалась очищенная методом препаративной гель-хроматографии на колонке с гелем Sephadex G-75 и лиофильно высушенная фракция НМП полученная в результате гидролиза молока «Панкреатином». Препарат вводили перорально в виде 1% раствора из расчета 2,5 мг на животное.

Таблица 2 — ФА нейтрофилов крови подопытных животных.

*m-ошибка средней арифметической, **t-критерий достоверности Из данных таблицы 1 следует, что фагоцитарный индекс увеличился в 1,3 раз, фагоцитарная активность повышается на 14,9%, фагоцитарное число увеличилось в 1,4 раза, что говорит о повышении функциональной активности фагоцитирующей клетки.

Таблица 3 — Показатели ЛАСК и БАСК подопытных животных.

На заключительном этапе экспериментов было исследовано влияние добавки НМП на титруемую и активную кислотность кефира в процессе сквашивания. Масса вносимой добавки 2,5% от объема заквашиваемой смеси, внесение более 7% НМП приводит к ухудшению органолептических характеристик вследствие появления горьковатого привкуса. Было подготовлено 3 образца: контрольный; с добавлением 2,5% НМП; с добавлением 2,5% НМП, предварительно обработанного при температуре 87±2 °С в течение 15 мин. Гель-хроматография фракций НМП до и после тепловой обработки не показала значительных различий.

Последний образец был подготовлен для выявления возможного воздействия остаточного количества ферментного препарата на динамику кислотонакопления. Заквашивание и сквашивание образцов проводили при 25±1 °С.

На рисунках видно, что кислотонакопление в опытных образцах происходит более динамично, начиная с 5−5,5 ч, до этого момента значительных отличий не наблюдается. Следует отметить, что добавление НМП несколько снижает начальное значение рН заквашенного молока на 0,48−0,48 и на протяжении всего процесса данный показатель у опытных образцов ниже по сравнению с контрольным.

Добавка, не прошедшая предварительную тепловую обработку вызывает наибольшее кислотонакопление, а также образование творожистого сгустка, не характерного для кефира.

Интенсификация процесса сквашивания молока в опытных образцах, по-видимому, связана с наличием во фракции НМП продуктов ферментативного гидролиза молекулярной массой менее 1,5 кДа. которые необходимы для биосинтеза собственных белков лактобактерий, способные проходить через клеточную стенку и мембрану против градиента концентрации [4].

Выводы.

• — наибольшее количество НМП образуется в результате гидролиза белков молока ферментным препаратом «Панкреатин»;
• — определены рациональные условия ферментативного гидролиза (без использования рН-статирования, температура и продолжительность ферментации 43±1 °С и 4 ч соответственно, ФСС 1ч25);
• — в образцах кисломолочных продуктов также происходит накопление НМП, но большая часть представлена пептидами с молекулярной массой более 16 кДа
• — препарат НМП обладает иммуностимулирующей активностью, повышая показатели БАСК и ЛАСК на 18,7% и 15,4% соответственно.

• 1. Rowan, A.M., Haggarty, N.W., and Ram, S. 2005. Milk bioactives: discovery and proof of concept. Australian Journal of Dairy Technology 60: 114−120.
• 2. Хаитов Р. М. Аллергология и иммунология. Национальное руководство. -М.: ГЭОТАР-Медиа. — 2009. — 636 с.
• 3. Ярилин А. А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа. — 2010. — 752 с.
• 4. Гудков А. В. «Сыроделие: Технологические, биологические и физико-химические аспекты». — М.: ДеЛи принт. — 2004. — 804 с.