Оспа птиц. 
Бешенство у коров

Министерство сельского хозяйства РФ Департамент научно-технологической политики образования ФГБОУВПО «Красноярский Государственный Аграрный Университет»

ИПБ и ВМ Кафедра эпизоотологии и паразитологии Контрольная работа по Ветеринарной вирусологии Выполнила: студентка заочного отделения

4 курса Группа В-41

Беляева А. Г.

Проверила:

к.в.н., доцент, И. Я. Строганова Красноярск 2013

1 вопрос

Почему в животноводческих комплексах приобретают важное значение болезни, вызываемые слабопатогенными вирусами (парагрипп, аденовирусная инфекция крупного рогатого скота и другие болезни)?

Большое значение приобретают в животноводческих комплексах болезни, вызываемые слабопатогенными вирусами (парагрипп, аденовирусная инфекция КРС и другие). Так как при неблагоприятных условиях содержания животных, такие вирусы вызывают заболевания. Тогда эти заболевания становятся чрезвычайно заразными, быстротечными, вследствие чего высока вероятность падежа животных. Это так же несет за собой экономические потери.

У слабопатогенных микроорганизмов, где бы они ни пребывали в организме ли животного, насекомого, клеща или вне его, вырабатывается своеобразная устойчивость к различным факторам неблагоприятного внешнего для них воздействия. Они особенно хорошо приспосабливаются к жизни в живом микроорганизме, где они находят соответствующие для себя питательные вещества, температуру и реакцию среды. Это подтверждается фактами длительного микробоносительства при ряде инфекционных болезней. При благоприятных условиях: остаются в течение некоторого времени жизнеспособными; постепенно накапливаясь, создают резервуар возбудителя инфекции; способствуют созданию условий заражения здоровых животных. Внешняя среда обычно не является местом их естественного обитания, так как: чаще всего не имеет необходимых для их нормальной жизнедеятельности условий (питательные вещества, температура, влажность, оптимальная рН); подвержена существенным изменениям. Многие патогены могут относительно продолжительно сохраняться не только жизнеспособными, но даже вирулентными в объектах, содержащих большое количество органических веществ (молоко, мясо, фекалии). В средах, бедных органическими веществами выживаемость менее продолжительна.

Исходя из указанного выше видно, насколько необходимо осуществлять в животноводческих хозяйствах и других объектах ветеринарно-санитарного обслуживания регулярную дезинфекцию как способ уничтожения или обезвреживания патогенных микроорганизмов.

2 вопрос

Назовите методы, с помощью которых можно установить наличие вируса в материале от больных и павших животных.

Диагностика играет одну из решающих ролей в системе мероприятий по борьбе с болезнями животных вирусной этиологии. Быстрый и правильно поставленный диагноз обеспечивает успех в ликвидации вспышки болезни, так как позволяет четко выяснить эпизоотическую ситуацию и своевременно принять целенаправленные меры по оздоровлению поголовья животных с наименьшими потерями.

Для постановки диагноза требуется сбор, изучение, анализ и сопоставление целого комплекса различных данных. Поэтому диагноз — результат кропотливой и вдумчивой работы.

Окончательный диагноз на вирусную болезнь в большинстве случаев может быть поставлен только с учетом результатов лабораторных исследований. В лабораторной диагностике вирусных болезней точность диагноза прежде всего зависит от правильности взятия материала (пробы) от больных и павших животных, его транспортировки, качества приготовления и техники исследования вирусного материала.

Материал для исследования следует брать как можно быстрее после проявления четких признаков болезни или не позднее 1−2 ч. после клинической смерти или убоя (позже начинается бактериальное обсеменение, и по мере продолжения инфекционного процесса количества вируса может уменьшаться в результате воздействия защитным механизмов организма). При взятии материала для выделения вируса следует исходить из патогенеза предполагаемой инфекции (входные ворота, пути распространения вируса в организме, места его размножения, клинические признаки и пути выделения). В лабораторию направляют тот материал, который с наибольшей вероятностью может содержать возбудителей болезни. При этом необходимо соблюдать следующие общие правила:

1. материал должен быть взят строго асептически

2. материал должен быть немедленно законсервирован (помещен в термос с охлаждающей смесью или добавлением 50-%- ого стерильного глицерина), чтобы предотвратить разрушение вирусов;

3. материал удобнее брать в стерильные пробирки с резиновой пробкой или во флакончики из-под антибиотиков. Для исследования вполне достаточно 5−10 г. материала;

4. на пробирках должна быть не смываемая этикетка;

5. материал направляют с нарочным и сопроводительным письмом, в котором указываю хозяйство, вид больных животных, предварительный диагноз, вид и количество патологического материала, на что следует провести исследование, дату и фамилию врача.

В зависимости от симптомов болезни, а значит, и локализации возбудителя от больного животного может быть взят следующий материал:

1. Смывы со слизистой оболочки носа, глаз, с задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц. Берут их стерильными ватными тампонами, которые погружают в пробирки или флаконы, содержащие 3−5 мл соответствующей жидкости (раствор Хенкса, среды Игла, 199 и др.) с антибиотиками;

2. Содержимое везикул, пустул, стенки везикул, корочки на коже;

3. фекальные массы непосредственно из прямой кишки;

4. кровь на выделение вируса и кровь для получения парных сывороток крови для обнаружения и определения титра антител.

Для этой цели кровь берут дважды у одного и того же животного — в начале болезни и через 2−3 нед, т. е. в начале и в конце болезни.

От трупов патологический материал должен быть взят не позднее 1−2 ч после клинической смерти или убоя животного. В качестве патологического материала берут кусочки органов, которые:

1. имеют видимые отклонения от нормы;

2. могут быть поражены и содержать вирус на основании клинической картины болезни;

Наиболее часто содержат вирус: селезенка, печень, легкие, почки, головной мозг, лимфатические узлы.

В лаборатории часть материала берут для исследования, оставшуюся часть хранят на случай дополнительных исследований. Затем составляют план исследования присланного материала, которые включает следующие задачи:

1. обнаружение (индикация) вируса в материале;

2. выделение (изоляция) вируса из материала;

3. идентификация выделенного вируса;

4. при необходимости требуется доказать этиологическую роль выделенного вируса;

5. ретроспективная диагностика.

Методы обнаружения вирусов в материале от больных животных и трупов. Для обнаружения вируса чаще всего используют экспресс-методы, которые позволяют в материале:

1. обнаружить вирусные белки (антигены), для этой цели используют серологические реакции: РИФ, ИФА, РНГА, РСК, РДП;

2. обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ДНК-зонда;

3. обнаружить вирионы вирусов. Электронная микроскопия позволяет обнаружить вирусы любых размеров, а крупные вирусы (вирусы оспы) можно увидеть под световым микроскопом. Этот метод называется вирусоскопия.

Электронная микроскопия используется в основном в исследовательских целях. Электронный микроскоп — сложный и дорогой прибор, в диагностических ветеринарных лабораториях его нет. Хотя исследование с его помощью — очень эффективный экспресс-метод при диагностике рота-, коронавирусных и других инфекций. Если в материале содержится не менее 10−7 вирионов на 1мл, он не требует дополнительных методов очистки концентрации;

4. Обнаружить тельца — включения под световым или люминесцентным микроскопом.

Тельца-включения — это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках при репродукции в них некоторых вирусов. По природе они представляют собой либо скопления (колонии) вирионов, либо измененный под действием вируса клеточный материал, либо комбинацию первого со вторым. Тельца-включения могут находиться в цитоплазме (чаще это РНК-содержащие вирусы) или в ядре (чаще это ДНК-содержащие вирусы, кроме вируса оспы), или в цитоплазме и ядре клетки (вирус чумы собак). Тельца-включения, образуемые некоторыми вирусами, получили специальное название, так, тельца-включения при оспе кур называются тельцами Боллингера, при чуме плотоядных — Ленца, при бешенстве Бебеша-Негри и др. При обнаружении телец Бебеша-Негри в мазках головного мозга погибшего животного наличие бешенства считается доказанным. При других вирусных инфекциях обнаружение телец-включений имеет лишь вспомогательное диагностическое значение;

5. обнаружить вирусные гемагглютинины, которые являются белками некоторых вирусов (орто-, парамиксовирусов и др.).

Гемагглютинирующие вирусы способны аггютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температуры и рН среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале ;

6. для обнаружения вируса в активной форме (инфекционной) используют довольно длительные вирусологические исследования. С этой целью применяют метод биопробы на живых чувствительных к предполагаемому вирусу системах: лабораторных животных, куриных эмбрионах, культурах клеток. В редких случаях приходится использовать естественно восприимчивых животных.

Методы выделения вирусов из материала больных животных и трупов.

Выделение вируса из исследованного материала — самый важный этап в диагностике вирусных болезней. Его проводят на живых чувствительных к предполагаемому вирусу системах: на животных: куриных эмбрионах и культурах клеток.

Для заражения чувствительных систем из материала (кусочки органов и тканей) готовят суспензию. С этой целью материал измельчают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком, разводят стерильным физиологическим раствором или раствором Хенкса (1:5−1:10), освобождают от крупных частиц путем центрифугирования в течении 20−30 мин. при 2000;3000 мин-1. За тем суспензию освобождают от бактерий и грибов, используя для этой цели антибиотики (обычно смесь пенициллина стрептомицина по 200−1000 ЕД на 1 мл жидкости и нистатина), или пропускают через бактериальные фильтры (редко). Контролируют эффективность такой обработки посевом на питательные среды для аэробов, анаэробов и грибов. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения живых объектов.

Смывы для заражения готовят следующим образом. Тампоны, погруженные в специальный раствор, встряхивают 10−15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют при 2000;3000 мин-1 20 мин. Недостаточную жидкость отсасывают в стерильные пробирки, обрабатывают антибиотиками и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.

Полученной таким образом суспензией заражают чувствительные к предполагаемому вирусу живые объекты (животных, куриные эмбрионы, культуры клеток,) и регистрирует появления у них признаков размножения вируса, что служит показателем наличия вируса в исследуемом материале. Однако вирус не всегда проявляет действие в первом пассаже. В этом случае необходимо провести 3−4 «пассажа», чтобы вирус адаптировался к используемому живому объекту и накопился в количестве, достаточном для проявления своего действия.

Выделение вируса на культуре клеток.

Культуры клеток пригодны для выделения большинства вирусов животных. Для этой цели используют как первично-трипсинизированные, так и перевиваемые и диплоидные культуры клеток.

Заражение культур клеток проводят следующим образом. Из пробирок или матрасов выросшим монослоем клеток удаляют ростовую питательную среду, отмывают монослой клеток от ростовой среды (в ней могут быть антитела к исследуемому вирусу и неспецифические ингибиторы) раствором Хекса и вносят вируссодержащий материал. После контакта (1−1,5 ч), необходимого для адсорбции вируса на клетках, вируссодержащий материал удаляют и вносят поддерживающую питательную среду, которая не способствует размножению клеток, не обеспечивает их жизнедеятельности. Пробирки и матрасы помещают в термостат для инкубации. Адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают в клетки, репродуцируются в них и выводят в культуральную жидкость, заражают новые клетки, затем следующие и так до тех пор, пока не останется живых клеток.

Обнаружить вирус в клетках можно следующими методами (или признаками):

1.По цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическому эффекту (ЦПЭ). ЦПДэто любые изменения клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Для обнаружения ЦПД зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД могут быть весьма разнообразными, что зависит от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т. д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2−3 суток после заражения (энтеровирусы), другие- 1−2 нед. (аденовирусы). Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация, округление клеток, симпластообразование.

Фрагментация — разрушение клеток на отдельные фрагменты (вирус везткулярного стоматита др.)

Округление — клетки принимаю шаровидную форму и отделяются от стекла (адено-, пикорнавирусы и др.)

Симпластобразование — образование гигантских клеток: цитоплазма соседних клеток сливается в следствие растворения клеточных оболочек и образуется одна большая клетка со многими ядрами (вирус ПГ-3, чумы крупного рогатого скота и др.);

С ее помощью в культуре клеток можно обнаружить некоторые вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами: вирусы ПГ-3, гриппа и др. реакцией гемадсорбции. Гемадсорбцией называется прилипание (адсорбция) эритроцитов крови на поверхности клеток, зараженных вирусом. Этот метод широко используется при диагностике П-3 крупного рогатого скота, при этом используют эритроциты морской свинки (цв.вкл., рис.19);

2. Методом образования «бляшек». Этот метод технически сложнее других и применяется главным образом для титрования и клонирования вирусов;

3.Обнаружение вируса в РИФ. В том случае, если размножение вирусов в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить при помощи флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусных инфекций, бешенства и др.;

4. Иммунопероксидазной реакцией;

5. путем обнаружения внутриклеточных включений. Для выявления телец-включений культуру клеток выращивают на покровных стеклах, помещенных в пробирки, заражают испытуемым материалом и через определенные сроки инкубации (при 37°С), стекла промывают, фиксируют и окрашивают различными методами (гематоксилин-эозином, акридиновым оранжевым и др.).

Размножающиеся в культурах клеток вирусы частично или полностью (в зависимости от степени разрушения клеток) выходят в культурную жидкость, которая и используется как готовая суспензия вируса. Если не все клетки культуры разрушились в результате размножения в них вируса, то их разрушают путем 2−3- кратного замораживания и оттаивания или ультразвуком.

Выделение вируса на куриных эмбрионах.

Куриные эмбрионы чувствительны к большинству вирусов птиц и к некоторым вирусам млекопитающих (болезни Ньюкасла, гриппа, оспы птиц, ПГ-3 др.). Используют куриные эмбрионы от 5-го до 12-го дня инкубации. Вирусы в них могут репродуцироваться в клетках самого зародыша, хорион-аллантоисной (ХАО) и амниотической оболочках, в стенках желточного мешка, накапливается в этих структурах и в жидкостях аллантоисной и амниотической полостей. В разных структурах могут репродуцироваться различные вирусы.

Разработано несколько методов заражения куриных эмбрионов, но в практике чаще используют следующие методы:

1. на ХАОнапример, вирусы оспы птиц и др.;

2. в аллантоисную полостьвирусы гриппа, ПГ-3 крупного рогатого скота, вирус болезни Ньюкасла и др.;

3. в амниотическую полостьвирусы гриппа;

4. в желточный мешоквирус ринопневмании лошадей.

В редких случаях используют метод заражения куриных эмбрионов в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО.

Обнаружить вирус в куриных эмбрионах можно по следующим признакам:

1. по гибели зародыша в определенные характерные для соответствующего вируса сроки инкубации;

2. по патологоанатомическим изменениям в структурах куриного эмбриона, например, белые узелки (оспины) при оспе птиц, инфекционном ларинготрахеите кур и других инфекциях или желто-зеленый цвет аллантоисной жидкости при гепатите утят и т. п.;

3. по реакции гемагглютинации (для обнаружения гемагглютинирующих вирусов, например, вируса болезни Ньюкасла, гриппа, ПГ-З и др.) При наличии вируса в эмбриональной жидкости куриного эмбриона через 3−7 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвести эритроцитов соответствующего вида животного образуются хлопья эритроцитов (агглютинация). Так, для выявления вируса ПГ-3 крупного рогатого скота используют эритроциты морской свинки, вирусов гриппаэритроциты кур и т. д.

Выделение вируса на лабораторных животных.

Для этой цели чаще всего используют белых мышей, белых крыс, золотистых хомячков, морских свинок, кроликов и др. Существует большое количество методов введения инфекционного материала лабораторным животным. Наиболее часто используют внутримышечное, подкожное, внутривенное, интраназальное и интрацеребральное введение, Выбор метода заражения зависит от тропизма исследуемого вируса и вида животного.

За зараженными животными устанавливают контроль, отмечая изменения их поведения, появление специфических признаков болезни (так, вирус болезни Ауески у кроликов вызывает зуд, расчесы в месте инъекции вирусного материала, затем паралич и гибель животного).

Материал для вирусологических исследований от лабораторных животных следует брать как можно быстрее после появления четких специфических признаков болезни или после их гибели (так, при выявлении вируса ящура на новорожденных мышатах их убивают в агональной стадии и используют скелетные мышцы для приготовления антигена в РСК).

Признаками размножения вируса в организме лабораторных животных после экспериментального заражения служат гибель, клинические симптомы болезни и патологические изменения (устанавливают при вскрытии). Если зараженное животное пало, его немедленно вскрывают, а если не погибло, убивают (через соответствующий срок) и тоже вскрывают для обнаружения патологоанатомических изменений, взятия вируссодержащего материала и дальнейшего исследования или следующего пассажа. Использованных животных обезвреживают автоклавированием или сжиганием в специальной печи.

Выделение вирусов на естественно восприимчивых животных.

Используют редко и только в случаях, когда нет возможности использовать лабораторные чувствительные живые системы (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторных животных).

Методы идентификации выделенных вирусов.

Выделенный вирус необходимо идентифицировать, т. е. установить, какой это вирус (семейство, род, вид). Идентификацию неизвестного (выделенного) вируса проводят с помощью серологических реакций: РТГА, РТГАд, РН, РИФ, ИФА, РНГА, РСК, РДП, и др. При этом выделенный вирус используют как антиген и с ним в серологических реакциях применяют специфические сыворотки, содержащие антитела к заведомо известным вирусам. Та сыворотка, с которой выделенный вирус будет давать продолжительную реакцию (образование комплекса антиген + антитело) и укажет, какой это вирус.

Важно правильно выбирать серологическую реакцию. Каждая лаборатория предпочитает те или иные методы, основываясь на чувствительности, специфичности, скорости. Удобствах и стоимости. Так, если вирус выделили на культуре клеток и он дает гемадсорбацию, то проще и быстрее его идентифицировать в РТГАд. Например, вирус ПГ-3 крупного рогатого скота дает гемадсорбцию с эритроцитами морской свинки и может быть идентифицирован в РТГАд. Вирусы, обладающие гемагглютинирующей активностью, целесообразно идентифицировать в РТГА.

Для идентификации выделенных вирусов используют РИФ, ИФА, РНГА, РДП, ПСК. Наиболее универсальной и дающей более достоверные результаты при идентификации выделенных вирусов является РН, в которой используют те же живые чувствительные системы, на которых и был выделен исследуемый вирус.

Применение моноклональных антител с определенной специфичностью позволяет проводить идентификацию многих вирусов до уровня подтипов, штаммов или вариантов. Для обнаружения и идентификации вирусов кроме серологических реакций используют прямые методы идентификации вирусных нуклеиновых кислот: ДНК-зонды, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). С их помощью выявляют нуклеиновые кислоты вирусов.

Методы ДНК (или РНК)-зондов основаны на реакции гибридизации нуклеиновых кислотспособности односпиральных комплиментарных цепей ДНК или РНК формировать двуспиральные структуры. Реакция может протекать между комплиментарными молекулами вида: ДНК+ДНК, ДНК+РНК, РНК+РНК.

Геном вирусов, представленный в виде специфической последовательности нуклеидов в молекулах нуклеиновых кислот, наиболее информативен и является надежным критерием для идентификации.

У большинства ДНКсодержащих вирусов (адено-, герпес-, покс-, папилломавирусы и др.) нуклеиновая кислота находится в виде двух цепей, которые связаны (водородная связь) комплиментарно через азотистые основания (аденин-тимин, гуанин-цитозин).

5"___________Г, А А Т Т Ц____________3″

||| || || || || |||

3"__________ Ц Т Т, А А Г ____________5″

Так, у аденовирусов таких нуклеидных пар 35−36,5 тыс., у герпесвирусов- 125−240 тыс., у поксвирусов-130−375 тыс. и т. д.

Если водный раствор ДНК нагреть до 100 °C или сильно защелочить (рН 13), то комплиментарные пары оснований теряют связь, и ДНК быстро дисоциирует на две отдельные цепи. Этот процесс называется денатурацией или плавлением.

Если комплиментарные цепи ДНК выдерживать в течении определенного времени при температуре 65 гр. С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали. Этот процесс получил название ренатурация или гибридизация.

Все типы реакций гибридизации зависят от солевого состава среды, температуры инкубации, длины реагирующих цепей, их нуклеотидного состава.

Любой вирус включает одну специфическую для него молекулу ДНК (или РНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов. Чтобы в исследуемом материале обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей (если она двуспиральная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты, предварительно как — либо помеченной. Такая меченая односпиральная молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная молекуле нуклеиновой кислоты определенного вируса, называется ДНК-зондом. Для каждого вида вируса зонд готовят заранее и вводят в него метку в виде атома радиоактивного фосфора (32Р) или в виде биотина, или другим веществом.

Методы ДНК-зондов сводятся к следующему:

1. получение односпирального фрагмента ДНК определенного вируса и его метки — это ДНК-зонд; выделение из исследуемого материала нуклеиновых кислот и их денатурация;

2. контакт образовавшихся односпиральных молекул ДНК (или РНК-зондом при 55−56 гр. С, приводящих к образованию двуспиральных молекул (гибридизация) в случаях их взаимной комплиментарности;

3. удаление всех негибридизированных односпиральных молекул нуклеиновых кислот (отмывают или добавляют нуклеазы);

4. обнаружение (по метке) образовавшихся двуспиральных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в исследуемом материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.

Если использовали радиоактивный зонд, то результаты учитывают методом авторадиографии или путем подсчета импульсов в счетчике.

Существует большое количество модификаций метода гибридизации с мечеными нуклеиновыми кислотами. Их можно разделить на две основные группы: способы гибридизации в растворе и способы гибридизации на твердых носителях.

Наиболее популярен метод гибридизации с использованием носителей нитроцеллюлозных или нейлоновых фильтров и твердых полимеров. Он заключается в том, сто одну нуклеиновую кислоту (чаще исследуемую), предварительно денатурированную, иммобилизуют на носителе (фильтре), проводят гибридизацию с ДНК-зондом и непрореагировавшие молекулы зонда отмывают, а иммобилизованные меченые гибриды остаются на фильтре. Сигнал, подаваемый связанным зондом, обнаруживают посредством авторадиографии, если зонд был радиоактивным, или путем образования цветных пятен, если использовали меченный ферментом зонд.

Достоинства метода: высокая чувствительность и специфичность; быстрота анализа; универсальность; отсутствие необходимости в стерильной работе, математической обработке результатов. Недостатки: относительная технологическая сложность и трудность получения зонда; если метка радиоактивная, то нельзя зонд нарабатывать впрок, так как период полураспада 32Р-14 сут, а 1311- 8 сут; если метка нерадиоактивная, то чувствительность метода снижается в 10 раз и более.

Методы ДНК (РНК)-зондов из диагностической практики постепенно выясняются новым методомполимеразной цепной реакцией.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов. Впервые этот метод разработал К. Мюллис (США) в 1983 г. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и простое выполнение его широко применяют в генетике, судебной медицине, диагностике и других областях.

Суть методаамплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК лат. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплиментарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин-тимин и гуанин-титозин.

ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплиментарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймерэто фрагмент ДНК, состоящий из 20−30 нуклеотидов. Эти праймеры (завтраки) комплиментарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующих молекул ДНК. Обычно ПЦР ставят в 25−40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первыйденатурация при 92−95 гр.С. При этом две цепи ДНК расходятся, второй отжиг, или присоединение праймеров при 50−65 гр. С; третийэлонгация, или полимеризация при 68−72 гр. С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплиментарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25−40 циклов насинтезировать миллионы (2п) фрагментов ДНК-количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных для определенного возбудителя.

Методика постановки ПЦР сводиться к следующему; из исследуемого материала выделяют ДНКматрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую вводят ДНКполимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, меси, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1−2%- ном аэрозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе). Все процедуры ПЦР занимают 1−2 рабочих дня.

С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР, ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.

В настоящее время внедряется новая технология ПЦР-ПЦР в реальном времени. Ее принципиальная особенность-мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов (цв.вкл., рис.37). Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить предъявляемые к ПЦР требования лаборатории. ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зоны для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течении 20−50 мин и теоретически способна детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе. Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции «real-time» (мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплификацированной ДНК. Система включает в себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), на 3-конце-блакатором (quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором. В результате копирования последовательности полимераза достигает 5- конца зонда.5"-3″ экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 5" — конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флуоресценции. Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого методапроблема контаминации ампликонами.

Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.

Ввиду того, что чувствительность ПЦР может достигать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.

ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической диагностике. Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусоспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.

3 вопрос

вирус оспа птица бешенство корова

На птицефабрике у взрослых кур стали замечать единичные случаи заболевания, которое характеризовалось появлением на коже у основания клюва, век, на гребне, бородках и других участках тела округлых красноватых пятен. Эти узелки через 1−3 дня сливались, а затем через 10−14 дней приобретали шероховатый вид и темно-коричневый цвет. Корочки на 16−18 день отпадали, не образуя заметных рубцов.

Падёж больной птицы был незначительным и составлял примерно 10%. У некоторых птиц на слизистой рта, языка, носа, гортани, трахеи, бронхов появились узелки, они быстро увеличивались, сливались, приобретая жёлтый цвет, с содержанием творожистой некротической массы. Эти наложения затрудняли птице дыхание, из-за чего больные птицы издавали свистящие или хрипящие звуки.

Оспа птиц

Контагиозная болезнь птиц отряда куриных, голубиных, воробьиных, характеризующаяся поражением эпителия кожи, дифтеритическим и катаральным воспалением слизистых оболочек ротовой полости и верхних дыхательных путей.

Экономический ущерб складывается из потерь от падежа и вынужденного убоя птицы, снижения выводимости цыплят на 40−60%, отставания в росте молодняка, снижения естественной резистентности к другим заболеваниям у переболевшей птицы, а также затрат на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий.

Возбудитель

Вирус оспы птиц, который относится к роду Avipox семейства Poxviridae и тесно связан с другими вирусами оспы птиц, включая вирусы индеек, голубей и канареек. Размеры вириона от 120 до 330 ммк.

По патогенным и иммуногенным свойствам эти вирусы различаются между собой.

Вирус оспы хорошо культивируется на куриных и утиных эмбрионах.

Устойчивость вируса к действию физических и химических факторов различная и зависит от его состояния. Вирус, находящийся в высушенных эпителиомах, сохраняет вирулентность при колебании температуры от 20 до 29 °C и относительной влажности 25−48% в течение от 117 до 148 дней. Поэтому в недостаточно хорошо продезинфицированных помещениях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время. Химические вещества влияют на вирус в зависимости от концентрации и наличия белка, защищающего вирион. Под действием 1−3%-ных растворов гидроксида натрия, фенола, 20%-ного раствора гидроксида кальция вирус быстро погибает. Пары формальдегида, используемые для дезинфекции инкубаторов, инактивируют вирус в течение 30 мин. Пары формальдегида можно использовать также для дезинфекции скорлупы яиц, пуха, пера. При биотермическом самонагревании помета, содержащего вирус оспы, последний инактивируется в течение 28 дней.

Эпизоотология

Наиболее восприимчивы куры, индейки, голуби, цесарки, фазаны, мелкие певчие птицы. Заболевание чаще встречается в осенний и зимний периоды. Осенью преобладает кожная форма инфекции, в остальное время — поражение слизистых оболочек. Наиболее предрасположены к оспе линяющая птица и молодняк, находящийся в неблагоприятных условиях содержания и неполноценного кормления. Относительную устойчивость к оспе у взрослой птицы можно объяснить наличием иммунитета после прививок или иммунизирующей субинфекции. В промышленных птицеводческих хозяйствах при поточной системе выращивания птицы заболевание оспой может постепенно поражать вначале птицу старшего возраста, а в дальнейшем и 10−30-дневных цыплят. Оспа протекает наиболее тяжело при недостатке в рационе каротина и витамина А. Эта недостаточность приводит к повышению чувствительности эпителиальных тканей. В хозяйствах с относительно хорошими условиями содержания при наличии источника инфекции оспа принимает затяжное течение, поражает единичные экземпляры при относительном благополучии остальных птиц.

Источник возбудителя

Источником возбудителя инфекции является больная и переболевшая птица, которая в течение 2 мес. после клинического выздоровления выделяет вирус в окружающую среду (с эпителиальными корочками, пометом, слизью из носовой и ротовой полостей).

Резервуаром инфекции служат кровососущие насекомые (клопы, комары, москиты, кровососущие мухи), а также инфицированный корм, подстилка, вода, предметы ухода за птицей.

Заражение чаще происходит при склёвывании птицей инфицированного корма, подстилки, употреблении воды. Предрасполагающими факторами в заражении птицы служат скученное содержание в холодных сырых помещениях, травмы гребешка и слизистых оболочек ротовой полости гравием.

Вспышки оспы обычно носят характер энзоотии, а иногда эпизоотии. Переболевание птицы в хозяйстве продолжается 6 нед и более. При неудовлетворительных условиях содержания погибает 50−70% птиц. У больной птицы значительно (в 5 раз и более) снижена яйценоскость, которая после выздоровления восстанавливается медленно. Выводимость цыплят во время болезни и в течение значительного времени после переболевания кур оспой остается низкой и составляет лишь 20−25%. Птица, переболевшая оспой, надолго утрачивает естественную резистентность и вследствие этого становится более чувствительной к другим болезням.

Патогенез

Вирус оспы — эпителиотропный возбудитель, поэтому начинает размножаться сразу же после попадания в чувствительные эпителиальные клетки. Размножающийся вирус вызывает гибель клетки и в большом количестве прорывается в кровоток, приводя к вирусемии. В дальнейшем вирус оседает в новых эпителиальных клетках и обусловливает вторичные поражения, поэтому принято различать первичный и вторичный оспенные процессы.

Пораженные эпителиальные клетки образуют бородавчатые разращения на коже или дифтеритические пленки на слизистых оболочках. В патогенезе инфекции немалое значение имеет участие условно-патогенной микрофлоры, которая осложняет течение оспы. В стадии вирусемии вирус можно обнаружить в крови, печени, почках, нервной системе.

Болезненный процесс развивается, как правило, в течение З-4нед. Течение оспенного процесса у кур в отличие от млекопитающих не имеет отдельных стадий. Оспой поражаются открытые части тела, головы, лапок, область отверстия клоаки.

Течение и клиническое проявление

Инкубационный период: от 7 до 20 дней. Болезнь обычно протекает хронически. Различают следующие формы: кожную, дифтеритическую, смешанную и катаральную.

При кожной форме на 4−5-й день после заражения или позже на коже у основания клюва, век, на гребне, бородках и на других участках тела появляются круглые, сначала бледно-желтые, а затем красноватые пятна, постепенно превращающиеся в небольшие узелки — папулы. Последние часто сливаются между собой. Через несколько дней их поверхность становится шероховатой, темно-коричневого цвета. Оспины формируются 7−9 дней, а иногда до 14 дней. У их основания появляются кровоизлияния, а поверхность покрывается клейким серозным экссудатом, который, засыхая, превращается в красно-коричневые корочки. Чем вирулентнее вирус и моложе птица, тем более злокачественно протекает заболевание. В тяжелых случаях поражаются оперенные участки тела, что приводит к быстрой гибели птицы. После отпадения корочек на их месте остается гладкая регенерированная ткань.

При дифтеритической форме поражаются слизистые оболочки верхних дыхательных путей и ротовой полости. Через 2−3 дня после возникновения катаральных симптомов появляются возвышающиеся образования, имеющие округлую форму и желтовато-белую окраску. Они сливаются друг с другом и образуют напоминающие сыр наложения, которые глубоко проникают в слизистую оболочку, затрудняют прием корма и воды. При поражении респираторных органов проявляются клинические симптомы затрудненного дыхания.

Патологоанатомические признаки

Оспины представляют собой конгломерат в виде тутовой ягоды, состоящей из более мелких элементов (оспинок). Кроме видимых изменений на коже и слизистых оболочках, в том числе трахеи, пищевода, зоба, возникает дифтеритическое воспаление синуса, их просвет заполняется катарально-фибринозным экссудатом, происходит атрофия глазного яблока.

В желудочно-кишечном тракте изменения отмечают редко. Дифтеритический оспенный энтерит протекает тяжело, при общей депрессии и быстрой гибели птиц. У индеек нередко оспа сопровождается поражением конъюнктивы глаз без типичных оспенных изменений.

Предварительный диагноз

Должен быть подтвержден результатами лабораторных исследований. В лабораторию обычно отправляют пораженные участки кожи, из которых делают мазки-отпечатки и гистосрезы для обнаружения возбудителя. Выполняют биопробу на неиммунных цыплятах, которым вируссодержащую жидкость втирают в перьевые фолликулы бедра. Также готовят срезы для гистологического исследования и окрашивают их по методу Морозова или Пашена для обнаружения телец-включений Боллингера. В мазках-отпечатках из срезанных оспинок можно обнаружить и тельца Борреля. Серологические исследования проводят в РДП или РИФ.

Оспу птиц необходимо дифференцировать от инфекционного ларинготрахеита, парши, дерматонекрозов, вызываемых стафилококками, гиповитаминоза А.

Иммунитет, специфическая профилактика

После переболевания оспой у птицы формируется иммунитет длительностью 2−3 года. В настоящее время в птицеводческих хозяйствах широко применяется сухая вирус-вакцина из штамма ВГНКИ, которая оказалась более иммуногенной, чем ранее рекомендованные. Вакцину вводят уколом специальной иглой в перепонку крыла.

Профилактика

Профилактика оспы птиц складывается из соблюдения комплекса мероприятий по содержанию и кормлению птиц. Для предупреждения заноса оспы в хозяйства нужно выдержать вновь завозимую птицу изолированно от остальной птицы хозяйства в течение 3 нед. После перевода каждой партии птицы птичники тщательно очищают от остатков корма, помета, грязи. Насесты, гнезда, кормушки, поилки моют горячим 2−3%-ным раствором гидроксида натрия.

В корм птице включают необходимые витамины и микроэлементы. Для профилактики оспы и повышения общей резистентности в рацион полезно включать следующие препараты: витамины A, B1,2и D3, окситет-рациклин и мясокостную муку.

Лечение

Лечение больной птицы не разработано. В индивидуальном секторе на небольшом поголовье для ценной в племенном отношении птицы можно применить противооспенный глобулин, виркон-С, бетапан, йодглицерин.

Меры борьбы

После установления диагноза на хозяйство накладывают карантин, больную птицу убивают, мясо используют после проварки. Яйца из неблагополучных птичников используют только для пищевых целей.

В случае угрозы разноса инфекции в хозяйстве желательно провести убой всей птицы неблагополучной группы, а условно здоровое поголовье вакцинировать. Необходимо привить также птицу частного сектора в угрожаемой зоне.

Для дезинфекции птичников применяют горячие растворы гидроксида натрия, формалин в виде аэрозоля, раствор свежегашеной извести (гидроксид кальция). Пух, перо дезинфицируют смесью формалина и гидроксида натрия. Помет от больной птицы складируют в навозохранилище для биотермического обеззараживания.

Карантин с хозяйства снимают через 2 мес. после ликвидации заболевания. Перед снятием карантина необходимо провести тщательную дезинфекцию птичников. Не рекомендуется соединять оставшуюся после вспышки оспы птицу с вновь приобретенной, неболевшей птицей. Вывоз цыплят и взрослой птицы в другие хозяйства допускается не ранее чем через 6 мес. после снятия карантина.

Вакцинацию против оспы в ранее неблагополучных хозяйствах проводят в течение 2 лет; если новых случаев заболевания не отмечается, то в дальнейшем прививки отменяют.

Вопрос 4

С какими вирусными заболеваниями животных вы имели возможность встречаться в своей практике? На каком основании вы считаете, что это именно названное вами заболевание, как его диагностировали и какие меры принимали для его ликвидации?

В своей практике приходилось встречаться с бешенством у коров.

Бешенство — острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие животные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфекции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши — вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от места и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1−3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у собак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (паралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бешенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения может не быть. Патологоанатомические изменения не специфичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Проникая с периферии (место укуса) по нервным стволам в центральную (нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион вируса — РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °C убивает его через 5−10 мин, солнечный свет — за 5−7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5−10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наружный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих антител, а нуклеокапсидный — комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

Эпизоотические штаммы вируса бешенства в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности.

В организме вирус локализуется главным образом в центральной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне. Культивируется на мышах, кроликах, морских свинках и других животных, а также в первичных культурах клеток (почки сирийского хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках (ВНК-21, КЭМ-1 и др.). Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предварительной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуцирует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они передают вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 1960;х годов основным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, имеющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным материалом необходимо строго соблюдать меры личной безопасности: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, резиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защитные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных та заболевание бешенством животных в полевых условиях запрещено.

Лабораторная диагностика. Она включает: обнаружение вирусного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша — Негри и биопробу на белых мышатах.

Методика постановки РИФ. На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок и продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 15−20 °С) от 4 до 12 ч, высушивают на воздухе, наносят флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влажную камеру при 37 °C на 25−30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдаются разной величины и формы флуоресцирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток. В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах. Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и т. д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген ++ антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).

Реакцию ставят на предметных стеклах, на которые наливают 2,5−3 мл расплавленного 1,5%-ного раствора агара. После застывания в агаре делают лунки по трафарету диаметром 4−5 мм, помещенному под предметное стекло с агаром. Агаровые столбики вынимают ученическим пером. Лунки в агаре заполняют компонентами по схеме.

От крупных животных исследуют все отделы головного мозга (левой и правой стороны), от средних (крысы, хомяки и др.) — какие-либо три отдела мозга, у мышей — весь мозг. С помощью пинцета из мозга готовят пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки.

Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят на отдельном стекле по тому же трафарету.

После заполнения лунок компонентами препараты помещают во влажную камеру и ставят в термостат при 37 °C на 6 ч, затем при комнатной температуре на 18 ч. Учет результатов ведут в течение 48 ч.

Реакцию считают положительной при появлении одной или 2−3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-глобулин.

Бактериальная нестерильность и загнивание мозга не препятствуют использованию его для РДП. Материал, консервированный глицерином, формалином и другими средствами, для РДП не пригоден.

Выявление телец Бабеша — Негри. На предметных стеклах делают тонкие мазки или отпечатки из всех отделов головного мозга (как для РИФ), не менее двух препаратов с каждого отдела мозга, окрашивают по одному из методов (по Селлерсу, Муромцеву, Манну, Ленцу и т. д.).