Фармацевтический и химико токсикологический анализ фенобарбитал

Когда-то выдающийся французский ученый XIX века Клод Бернар сказал: «Создание хорошего метода приносит иногда науке больше пользы, чем высокие теоретические соображения». Яркой иллюстрацией этой мысли является появление хроматографии. Рассмотрим основные принципы проведения хроматографического анализа.

В 1903 г. русский ученый М. С. Цвет, изучая хлорофилл, должен был найти доказательства выдвинутого им предположения о сложности состава хлорофилла, который до этого считался индивидуальным веществом. В 1906 г. на собрании Московского общества естествоиспытателей М. С. Цвет сделал доклад о своей работе, в результате которой были выделены составляющие хлорофилл-компоненты. Одновременно М. С. Цвет изложил разработанный им новый метод разделения сложных веществ.

Со времени открытия метода хроматографического анализа принципы, заложенные в основу этого метода разделения сложных смесей химических веществ, по сути не изменился. В основе его лежит принцип различия в сорбционной способности каждого химического вещества на том или ином сорбенте (веществе с большой адсорбционной емкостью). Продвигаемая носителем (элюентом) вдоль сорбента смесь веществ из-за разной величины адсорбционных свойств в одних и тех же условиях подвергается разделению (подобно разделению по температурам кипения, которое происходя при перегонке). При этом слой сорбента может находиться в виде тонкого слоя на пластинке, а продвигать смесь веществ может растворитель (или смесь растворителей) за счет капиллярных сил. В этом случае данный метод разделения будет называться тонкослойной хроматографией (ТСХ), сорбент может быть упакован в достаточно тонкую стеклянную или металлическую трубку, а анализируемая смесь продвигается вдоль колонки либо газом (газноситель) и тогда метод называется «газовая хроматография» (ГХ), либо потоком ра створителя (смесью растворителей), подаваемого в колонку под давлением (иногда довольно значительным) с помощью насоса — в этом случае мы имеем дело с жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

Проведя хроматографическое разделение, необходимо обработать полученные данные, определить, что мы получили в результате анализа и в каком количестве, т. е. провести качественный и количественный анализы. Такие анализы проводятся обычно с помощью приборов, называемых детекторами, а запись полученного сигна ла осуществляется с помощью электронных интеграторов, самописцев или современных компьютерных программ в виде аналоговой формы электронного сигнала детектора. В результате мы получаем хроматограмму — картину разделения, где каждому разделенному веществу соответствует индивидуальный пик. Для проведения количественного определения полученные пики обсчитываются, калибруются и с помощью различных электронных устройств оператор получает полную количественную картину состава исследованного образца. Таким примерно образом проводится обычный хроматографический анализ многокомпонентных смесей.

Для успешного решения задач количественного анализа хроматографическими методами необходимо проводить достаточно сложные процедуры подготовки проб для анализа.

Вопросы подготовки проб, выбора метода анализа, разработки метода, количественной обработки полученных данных требуют серьезного отношения и использования профессионально подготовленных специалистов. Собственно весь процесс проведения любых фармакокинетических исследований предполагает использование специалистов самого различного уровняврачей, биохимиков, химиков-аналитиков, математиков. От тщательности проведения каждого отдельного этапа зависит результат всей работы.

Большинство фармакокинетических методов исследования базируется на изучении уровня концентрации того или иного препарата в крови пациента. При возникновении той или иной фармакокинетической задачи перед исследователем возникает вопрос: каким методом предстоит воспользоваться — ГЖХ, ТСХ, ВЭЖХ, ГХ-МС, иммунным, радиологическим, полярографическим или каким-либо другим.

Большое внимание следует уделять вопросам подготовки и обработки биологических проб для анализа. От того, какой биологический объект будет изучаться, зависит как выбор метода анализа, так и способ его проведения. Оттого, каким методом предстоит воспользоваться, зависит многое, например способ подготовки проб для анализа.

В основном процесс подготовки проб для анализа сводится к следующим процедурам:

1. Получение сыворотки крови.

2. Извлечение препарата в удобной для анализа форме (одноили многократная экстракция препарата химическими растворителями или процесс осаждения белков тем или иным реагентом. В последнем случае необходимо помнить, что при осаждении белков сыворотки крови происходит разбавление образца, что влияет на чувствительность метода анализа).

3. Сохранение образца в виде сывороточных экстрактов, сыворотки крови, упаренных образцов в сухом виде и т. д. для последующего хроматографического анализа.

Следует помнить, что при проведении фармакокинетических исследований некоторые препараты довольно быстро подвергаются биотрансформации (окислению, гидролизу и т. п.). Исходя из этого, каждый исследователь определяет минимальные и максимальные сроки проведения анализа. В процессе разработки метода следует также рассмотреть и исключить (или по возможности стандартизироиать} все возможные варианты потерь вещества при проведении основных и вспомогательных операций, чтобы избежать ошибок в анализе.

Как же осуществляется выбор метода анализа лекарственного препарата? Очень часто этот выбор зависит от наличия той или иной аппаратуры в распоряжении исследователя. Требования, предъявляемые к выбранному методу анализа, можно сформулировать следующим образом.

Метод анализа должен быть достаточно чувствительным для получения надежных результатов, воспроизводимым, дешевым и достаточно экспрессным. Процесс подготовки проб для анализа не должен занимать много времени и должен быть достаточно простым и воспроизводимым. Выбранный метод должен обладать большой производительностью.

Примерно такие же процедуры необходимы при проведении газохроматографического анализа, с той лишь разницей, что при данном анализе практически исключена возможность анализа водосодержащих проб. Кроме того, при проведении подобного анализа возникает необходимость применения высокочистых сжатых газов (азот, гелий, водород и воздух), что соответственно удорожает весь анализ.

Итак, мы знаем пути получения точных данных по уровню концентрации лекарственного препарата в той или иной биологической среде. Эти данные необходимо использовать при проведении фармакокинетических исследований в клинических условиях. Крайне важной областью применения этих данных и является терапевтический лекарственный мониторинг.

Производные барбитуровой кислоты имеют достаточно широкий спектр терапевтического действия, препараты этой группы являются депрессантами центральной нервной системы и используются как седативно-снотворные средства. В литературе описаны случаи острых отравлений барбитуратами, в частности фенобарбиталом. Поэтому разработка эффективной, экспрессной и экономичной схемы исследования биологического материала на производные барбитуровой кислоты является актуальной задачей химико-аналитических исследований.

Процесс пробоподготовки, как правило, является наиболее трудоемкой и сложной стадией анализа реальных образцов. Основным методом выделения, очистки и концентрирования определяемых веществ является жидкостная экстракция. Перспективным направлением в, настоящее время является применение метода сорбционного концентрирования (твердофазная экстракция). По сравнению с жидкостной экстракцией при ТФЭ реализуются более широкие возможности варьирования селективности за счет изменения природы и силы взаимодействия образца, как с сорбентом, так и с элюентом. При использовании твердофазной экстракции возрастает степень извлечения определяемых компонентов, воспроизводимость результатов определения.

Для концентрирования фармацевтических препаратов из биологических жидкостей все большее применение находят сорбенты на основе сверхсшитого полистирола. В настоящей работе рассматривается сорбция производноrо барбитуровой кислоты — фенобарбитала на сорбенте типа Стиросорб — MN-200, обладающего анионообменными свойствами.

Эксперимент В качестве объекта исследования в работе использовался фенобарбитал (5-этил- 5фенилбар6итуровая кислота) фармакопейной чистоты. Растворы фенобар6итала готовили растворением в этаноле порошков препарата.

Сорбентом выступал сверхсшитый полимер типа «Стиросорб» — МN-200 в С1- и ОНформах (Syд=1000 м2/г), содержащий в качестве функциональных аминогруппы. Для удаления органических и неорганических примесей ионообменник подвергался кондиционированию. Для подготовки сорбента Стиросорб к работе навески его заливали ацетоном, оставляли на 6 часов. Далее сорбент отмывали дистиллированной водой и переводили в соответствующую форму. Контроль за содержанием ацетона в растворе осуществляли спектрофотометрическим методом при длине волны 211 нм.

Сорбцию фенобарбитала проводили из водных растворов при температуре 200с. Соотношение раствор/сорбент было постоянным и составляло 100 / 1. Для поддержания определенного значения рН среды использовали ацетатный (СНзСООН, СНзСООNа) и боратный (Na2B407, HCI, NaOH) буферы. Количество сорбированного вещества определяли по разности концентраций в исходном и равновесном растворах спектрофотометрически при л=240 нм, рН 9,20. Ионообменную составляющую контролировали титрованием равновесного раствора 0,01 М Нg (NОЗ)2 И 0,01 М НС! ДЛЯ измерений использовали микробюретку .

Статистическую обработку результатов исследования проводили на IВM РС по стандартным программам. Вычисляли среднее значение показателя с доверительным интервалом х+Λх. Оценку достоверности проводили по критерию Стьюдента при Р=0,95. Стандартное отклонение полученных результатов сорбционных опытов не превышало 0,01.

Десорбцию фенобарбитала проводили в динамических условиях. В качестве органической фазы при экстракции использовали смесь хлороформ — изопропанол (6:1). Растворители имели квалификацию ч.д.а. Скорость пропускания растворителей составляла 1,5 мл/мин.

Определение фенобарбитала с помощью метода ВЭЖХ выполняли на жидкостном хроматографе «Милихром» со спектрофотометрическим детектированием Таким образом, в данном эксперименте продемонстрирована возможность сорбционного концентрирования фенобарбитала из водных растворов на сверхсшитом сорбенте MN-200 и целесообразность последующего изучения в условиях эксперимента с биологическими жидкостями.

Анализ барбитуратов методов ГХ обычно производится в виде их алкильных эфиров. Прямое введение в хроматограф образцов, содержащих такие активные агенты, как, тетраметиламмония гидроксид или диазометан, ведет к повреждении. хроматографической системы, поэтому большинство этих методик предполагают после проведения алкилирования повторную экстракцию полученных продуктов в органический растворитель и операцию по его испарению. Эта сложная схема существенно увеличивает время подготовки прбы к анализу и делает эти методики малопригодными для срочных токсикологических анализов.

К 1 мл крови добавляют 50 мкл раствора внутреннего стандарта в эталоне (гексабарбитал 0,02 мг/мл), 0,5 мл 1 н раствора дигидрофосфата натрия и 5 мл этилацетата. Смесь встряхивают 5 минут и центрифугируют. Верхний слой органического экстракта отделяют и пропускают через безводный сульфат натрия. Растворитель испаряли в потоке воздуха досуха. К сухому остатку добавляли 100 мкл диметилсульфоксида, 20 мкл 25% раствора гидроксида тетраметиламмония в метаноле и после 2-х минут выдержки 40 мкл йодметана. После выдержки при комнатной температуре в течении 10 минут к смеси добавляли 100 мкл 1 н раствора соляной кислоты и 500 мкл толуола. Смесь тщательно перешивали и переносили в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл с крышкой, пробирку закрывали и встряхивали 1 мин на встряхивателе. После отстаивания 1 мкл верхнего органического слоя анализировали методом газовой хроматографии-масс спектрометрии.

Описанная методика используется во многих бюро судебно-медицинской экспертизы при подозрении на отравление барбитуратами. Методика определения фенобарбитала в крови может быть рекомендована для клинико-токсикологических анализов.

Методы определения антиконвульсантов (карбамазепин, фенитоин, фенобарбитал) Для определения концентрации антиконвульсантов в крови человека разработано достаточно большое количество методов, основанных на различных физико-химических свойствах этих препаратов. В настоящее время наиболее широко применяются иммуно-флюоресцентные и хроматографические методы. Различными авторами разработано большое количество газохроматографических методов и методов, основанных на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии. На основе этих публикаций нами разработана оригинальная модификация метода определения концентрации антиконвульсантов с применением ВЭЖХ. Отличительная особенность разработанного нами метода заключается в одновременном определении карбамазепина, фенобарбитала, суксилепа и дифенина и з одного образца крови и в возможности применения микроколоночного варианта ВЭЖХ. Для получения максимальной чувствительности суксилепа необходимо проводить анализ при другой длине волны поглощения.

В том случае, когда исследователь имеет дело с монотерапией вышеназванных антиконвульсантов, вполне возможно применять наиболее простой способ подготовки биологических проб для анализа — использовать метод прямого осаждения белков сыворотки крови. Осаждение белков может осуществляться, например, метиловым спиртом, 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты или ацетонитрилом с последующим центрифугированием и вводом надосадочной жидкости в хроматографическую колонку. В случае наличия в одной пробе двух и более препаратов наиболее целесообразно применение однократной экстракции.

После отбора крови (1−2 мл) из локтевой вены ее выдерживают 30 мин. при комнатной температуре для образования сгустка, затем центрифугируют при 1500 об./мин. 15 мин при комнатной температуре. Полученную сыворотку крови замораживают (если не требуется проведения немедленного анализа) и хранят до проведения анализа при -20°С в морозильной камере.

Анализ проводят методом ВЭЖХ с использованием однократной экстракции препарата хлористым метиленом или хлороформом и анализом сухого (после упаривания растворителя) на обратно-фазной хроматографической колонке на оптимальной длине волны спектрофотометрического детектора следующим образом. К 0,2 мл сыворотки крови, полученной описанным выше способом, приливали 1,5 мл хлористого метилена (возможно применение хлороформа, однако температура кипения хлористого метилена существенно ниже, что заметно влияет на скорость проведения всего анализа в целом). Смесь энергично встряхивали на вибромиксере 2 мин., центрифугировали при 5000 об./мин. при комнатной температуре 15 мин и затем отбирали 1,2 мл нижнего органического слоя. Для получения сухого остатка хлористый метилен упаривали при 50 °C в токе азота. Сухой остаток растворяли в 120 мкл элюента и 50 мкл полученного раствора вводили в хроматографическую колонку.

Хроматографическое разделение проводили при комнатной температуре (20+/-4°С) на колонке (4,6*250 мм) «Партисил ОДС-2» зернением 5 мкм. В качестве детектора использовали переменно-волновой спектрофотометр «Алтекс-Хитачи 155−40» с объемом ячейки 8 мкл на длине волны 254 нм. В качестве элюента использовалась смесь: 37% ацетонитрила и 63% бидистиллированной воды. Объемная скорость элюирования составляла 1,0 мл/мин. Время удерживания карбамазепина в этих условиях составляло 4,5+/-0,5 мин.

Количественное определение препарата проводили по методу абсолютной калибровки. Для этого составляли контрольные растворы сыворотки крови, содержащие известные концентрации карбамазепина в диапазоне от 50 до 1000 нг/мл. Анализ каждого контрольного образца проводили не менее трех раз. По результатам проведенных определений составляли калибровочный график. Коэффициент корреляции r=0,998. Относительная ошибка определения карбамазепина при концентрации препарата в контрольном образце 2 мкг/мл составила 7,8% отн. Предел детектирования составлял 25 нг/мл.

Аналогичным способом проводили анализы фенитоина и фенобарбитала. Вышеназванные препараты отличались только временем удерживания хроматографического пика и составляли 3,7+/-0,3 и 2,4+/-0,2 мин. соответственно.

Существенное преимущество дает применение микроколоночного варианта ВЭЖХ. При использовании колонок с внутренним диаметром 2 мм и длиной 85−120 мм расход элюента уменьшается во много раз (например, в случае определения антиконвульсантов, расход элюента составлял 0,2 мл/мин), что существенно удешевляет стоимость проведения анализа, дает возможность использовать значительно меньший объем биологической пробы и увеличивает чувствительность определения препарата. Так, в нашей лаборатории разработаны методы определения антиконвульсантов с применением отечественных микроколонок, заполненных суспензионным способом отечественными носителями на основе «Диасорба С16» и других сорбентов.

Типичная хроматограмма сывороточных экстрактов до приема препаратов и содержащих фепобарбитал, фе-нитоин и карбамазепин представлена на рис. 1.

Рисунок 7. Хроматограммы сывороточных экстрактов до приема препаратов — I и содержащих фенобарбитал (Ф), фенитоин (D) и карбамазепин (К) — II

Список литературы

Машковский М. Д. Лекарственные средства. — М.: Новая волна, 2009. — Т.1−2

Елизарова О.Н., Жидкова Л. В., Кочеткова Т. А. «Пособие по токсикологии для лаборантов» М.:Медицина 2008 г.

Еремин С. К. Анализ наркотических средств. М.: Мысль, 2010 г — 276 с.

Токсикологическая химия / Под ред. Т. В. Плетеневой. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. — 512с. С. 39.

Химико-токсилогичекий анализ веществ, вызывающих одурманивание., 2010 г, 803 с

Kushnir M.M., Use of a statistically designed/, 2010 p. 129−136

Hodgson E. «Modern toxicology» 2009

http://medvam.ru/