Методы определения концентрации фолиевой кислоты Промышленными препаратами фолиевой кислоты является кристаллический продукт, а так же натриева соль фолиевой кислоты, драже и таблетки, содержащие фолиевую кислоту.
Фолиевая кислота не обладает флуоресценцией, но продукты распада, возникающие в результате её окисления, приобретают способность флуоресцировать голубым светом. На этом свойстве фолиевой кислоты основаны некоторые методы её химического определения.
В растворе соляной кислоты фолиева кислота может восстанавливаться цинковой пылью. Освобождающиеся аминокислота (I) диазотируется нитритом натрия, полученная соль диазония (II) сочетается с N-(1-нафтил)-этилендиамином дигидрохлоридом (III) в присутствии сульфата аммония (NH2SO2ONH4) или мочевины (NH2*CO*NH2). Образуется фиолетовая окраска раствора, интенсивность которой пропорциональна концентрации и может служить для целей количественного определения.
Химизм в описанном методе реакций может быть представлен следующим образом — рис. 2.
Обычно в препаратах фолиевая кислота содержится с примесью п-аминобензоилглутаминовой кислоты. Ниже представлены методики определения фолиевой кислоты в порошках и таблетках.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ В КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРОДУКТЕ Составление калибровочного графика. 0,05 г п-аминобензойной кислоты (т. пл. 186—187°, с содержанием не ниже 99%) отвешивают в стакан емкостью 15—20 мл и растворяют в спирте. Раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 мл, стакан промывают несколько раз спиртом (общее количество спирта 25 мл), раствор доводят в колбе водой до метки и перемешивают: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу емкостью 250 мл, туда же прибавляют 175 мл воды, 45 мл разведенной НС1, 2,5 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают. В 1 мл раствора содержится 0,004 мг п-аминобензойной кислоты.
В 5 колб емкостью 15—20 мл помещаютотмеренные пипеткой 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 и 2,5 мл приготовленного распора и доводят объем в каждой колбе до 5 мл водой. В каждую колбу добавляют по 1 мл разведенной НС1, по 1 мл 0,1% раствора нитрита натрия, хорошо перемешивают и оставляют на 5 минут. Затем в каждую колбу приливают по 1 мл 12% водного раствора мочевины, перемешивают и вновь оставляют на 5 минут. В каждую колбу добавляют по 1 мл 0,1% водного раствора N-(1-нафтил)-этилендиамина дигидрохлорида, по 6 мл воды, перемешивают и точно через 10 минут измеряют оптическую плотность растворов на электрофотоколориметре со светофильтром 550 тц (зеленый) в кюветах с толщиной слоя 3 см. Для построения калибровочного графика на оси абсцисс откладывают количество пара-аминобензойной кислоты в миллиграммах, а на оси ординат наносят показания гальванометра. График должен иметь вид прямой линии.
Определение свободной и связанной п-аминобензоилглутаминовой кислоты. Точную навеску препарата в количестве 0,049—0,050 г отвешивают в стакане емкостью 15—20 мл, смачивают несколькими каплями воды и растворяют и 0,1 н. растворе N aOH.
Раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 мл, стакан промывают несколько раз 0,1 н. раствором N aOH, сливая промывную жидкость в ту же колбу, объем раствора доводят 0,1 н. раствором N aOH до метки и хорошо перемешивают. Из полученного раствора отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 100 мл, добавляют 75 мл воды, 18 мл разведенной НС1, 1 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают (раствор А).
Переносят 70 мл раствора, А в коническую колбу емкостью 150 мл, прибавляют 0,5 г цинковой пыли и оставляют на 15 минут при частом перемешивании раствора. Раствор фильтруют через сухой фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 15—20 мл фильтрата. Из фильтрата отбирают 2 мл, переносят в колбу емкостью 15—20 мл, • прибавляют 3 мл воды, 1 мл разведенной НС1 и далее поступают, как указано выше (начиная со слов: «1 мл 0,1% раствора нитрита натрия…»).
Определение свободной п-аминобензоилглутаминовой кислоты. Переносят 2 мл раствора, А в колбу емкостью 15—20 мл, добавляют 3 мл воды, 1 мл разведенной соляной кислоты и далее поступают, как описано при определении общего количества п-аминобензоилглутаминовой кислоты, начиная со слов: «1 мл 0,1% водного раствора нитрита натрия…»
Вычисление содержания фолиевой кислоты в препарате. Из показателя плотности, соответствующего содержанию общей п-аминобензоилглутаминовой кислоты, вычитают показатель плотности, соответствующий свободной п-аминобензоилглутаминовой кислоте, и по калибровочному графику находят содержание связанной п-аминобензоилглутаминовой кислоты в испытуемом растворе в миллиграммах.
Содержание фолиевой кислоты в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
x = (c*50*100*3.22*100)/(1*2*a*1000)
где с — содержание фолиевой кислоты, найденное по калибровочному графику, в мг;
а — навеска в г;
50 — объем первого разведения в мл;
100 — объем второго разведения в мл;
1 — количество раствора первого разведения, взятое для второго разведения, в мл;
2— количество раствора первого разведения, взятое на определение, в мл;
3,22 — постоянный коэффициент;
100— пересчет в %;
1000 — пересчета г.
При сокращении формула приобретает следующее значение:
x = (c*250*3.22)/a
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ТАБЛЕТКАХ С ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТОЙ И ДРУГИМИ ВИТАМИНАМИ Точную навеску порошка растертых таблеток около 5 г (при содержании в 1 таблетке 1 мг фолиевой кислоты) или около 2,5 г (при содержании 2 мг фолиевой кислоты) помещают в стакан емкостью 50 мл, смачивают небольшим количеством воды и растворяют в 10 мл 0,1 н. раствора едкого натра. Раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 мл, промывают стакан несколько раз 0,1 н. раствором едкого натра, сливая его в ту же колбу, объем раствора в колбе доводят 0,1 н. раствором едкого натра до метки, тщательно перемешивают и фильтруют, отбрасывая первые порции фильтрата.
1 мл фильтрата переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и далее поступают, как описано при определении свободной и связанной п-аминобензоилглутаминовой кислоты, начиная со слов: «добавляют 75 мл воды…» и т. д. Содержание фолиевой кислоты в миллиграммах в 1 таблетке (х) вычисляют по формуле:
x = ((c — c1)*50*100*3.22*d)/(a*1*2)
где с — содержание суммы свободной и связанной п-аминобензоилглутаминовой кислоты в мл;
c1— содержание свободной п-аминобензоилглутаминовой кислоты в мг;
а— навеска в г;
50 и 100— разведение в мл;
d— средний вес 1 таблетки в г; 1; 2; 3,22— см. выше.
Список литературы
Василенко
Ю. К. Биологическая химия. — М.: Высшая школа, 1978. — 320 с.
С. Д. Варфоломеев, К. Г. Гуревич Биокинетика: Практический курс. — М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. — 720 с.: ил.
Тюкавкина Н. А. Биоорганическая химия: учебник для вузов / Н. А. Тюкавкина, Ю. И. Бауков. -
4-е изд., стереотип. — М.: Дрофа, 2005. — 542 с.: ил.
Харкевич Д. А. Фармакология: Учебник. — 8-е изд., перераб., доп. и испр. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. — 736 с.: ил.
Несмеяноа А. Н., Несмеянова Н. А. Начала органической химии. В двух книгах. Книга 2. — изд. 2-е. — М.: Химия, 1974. — 744 с.: ил.
Марри Р., Греннер Д., Мейес П. и др. Биохимия человека: Пер. с англ. — М.: Мир, 2004. — 381 с.: ил.
В. А. Девятин Методы химического анализа в производстве витаминов. — М.: Медицина, 1964. — 361 с.: ил.
Приложение рис. 1
рис. 2
Таблица. Физико-химические свойства фолиевой кислоты Показатель Характеристика Состояние вещества Желтые гигроскопические кристаллы Формула C19H19O6N7 Молекулярный вес 441,4
Температура плавления Не установлена Растворимость Не растворима в воде, спирте и органических растворителях Растворяется в разбавленных щелочах и кислотах
Максимум абсорбции (для раствора в 0,1 н. NaOH)
256 mμ (Е11%см = 590); 282 mμ (Е11%см = 570); 365 mμ (Е11%см =206)
При разведении 1: 600
(Е11%см 256 mμ)/ (Е11%см 365 mμ) = 2,8 — 3,0 Флуоресценция Голубая у продуктов окисления Абсорбционный максимум флуоресценции продуктов окисления
470 mμ
