При объеме нанесения 10 мкл масса наносимых веществ составляла:
— этамбутол около 10 мкг,
— рифампицин около 5,5 и 5,6 мкг,
— изониазид около 2,7 и 3,8 мкг,
— пиразинамид около 14,5 и 18,8 мкг. Таблетки, не содержащие этамбутол. На линию старта пластин с помощью микрошприца наносили 1, 3 и 5 мкл испытуемого раствора. При объеме нанесения 3 мкл масса наносимых веществ составляла:
— изониазид около 3 мкг,
— рифампицин около 6 и 3 мкг,
— пиразинамид около 16 и 10 мкг. Пробы наносились полоской 10 мм таким образом, чтобы расстояние от места нанесения до левого или правого края пластины, а также между пятнами составляло не менее 15 мм. Подобным образом на пластину 10×10 см наносили одновременно 3 испытуемых раствора. Сушку проб осуществляли с помощью нагревательного устройства для сушки пластин УСП-1 (ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар) при температуре 60° С.
Использовали стеклянную хроматографическую камеру размером 150×120×80 мм. Насыщение камеры парами подвижной фазы (ПФ) проводили в течение 20−30 мин.
В качестве подвижной фазы использовали смесь: раствор аммиака 25% - ацетон — метанолэтилацетат (1:1:1:7).
Пробег фронта растворителя составлял 8 см. После хроматографирования пластину высушивали в сушильном шкафу при температуре 110° С в течение 5 минут.
После высушивания хроматографическую пластину помещали на 4−5 мин в камеру с парами йода (только для таблеток с этамбутолом), а затем немедленно проявляли в УФ-свете облучателя хроматографического УФС 254/365 (ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар) при 254 нм.
Исследовано влияние ПФ различного состава и полярности на подвижность изучаемых лекарственных веществ и селективность хроматографической системы. Полярность ПФ ориентировочно оценивали по диэлектрической проницаемости входящих в ее состав растворителей. Для этого рассчитывали среднее взвешенное значение диэлектрической проницаемости фазы с учетом содержания каждого растворителя.
Были изучены ПФ содержащие следующие растворители в различных соотношениях (в порядке увеличения полярности): тетрахлорметан, диэтиловый эфир, хлороформ, этилацетат, ледяная уксусная кислота, изоамиловый спирт, бутанол, изопропиловый спирт, пропанол, ацетон, этанол, метанол, ацетонитрил, вода, раствор аммиака 25%, формамид (рис. 7).
Рис. 7. ТСХ комбинированного ПТП, содержащего этамбутол, рифампицин, изониазид и пиразинамид в ПФ раствор аммиака 25% - ацетон — метанол — этилацетат (1:1:1:7). Рядом с пятнами указаны значения Rf.
При увеличении содержания в ПФ высокополярных компонентов (раствор аммиака 25%, формамид) резко повышается подвижность изучаемых веществ, но снижается селективность хроматографической системы, и все пятна на хроматограмме имеют значения Rf более 0,8, в том числе оказываются на уровне фронта растворителя. При использовании в ПФ тетрахлорметана пятна имеют значения Rf менее 0,2, либо остаются на линии старта.
Показано, что для снижения эффекта размывания пятен испытуемых веществ следует включать в состав ПФ раствор аммиака 25%. Установлено, что оптимальное содержание раствора аммиака 25% в ПФ для комбинированных ПТП составляет 10%.
Для увеличения селективности хроматографической системы необходимо использовать метанол. Оптимальное содержание метанола в ПФ составило 10%. ПФ также должна включать в себя другие растворители, которые хорошо смешиваются с раствором аммиака 25% и метанолом и имеют сильно различающихся между собой значениями диэлектрической проницаемости. Последнее обстоятельство позволяет, меняя их соотношение, регулировать полярность ПФ, а, следовательно, выбирать оптимальную подвижность изучаемых лекарственных веществ. В качестве таких растворителей после ряда исследований были выбраны этилацетат и ацетон (значение диэлектрической проницаемости, соответственно, около 6 и 20).
Таким образом, было установлено, что оптимальные подвижность и разделение пятен этамбутола, рифампицина, изониазида и пиразинамида наблюдаются в ПФ с промежуточной полярностью (значение диэлектрической проницаемости смеси составляет около 17) следующего состава: раствор аммиака 25% - ацетонметанол — этилацетат (1:1:1:7). При этом значения Rf находятся в пределах 0,2−0,8, что является оптимальным [1].
Для детектирования всех пятен использовали комбинирование обработки парами йода и облучения УФ-светом с длиной волны 254 нм. Пятна рифампицина вследствие его естественной окраски видны на хроматограмме без какой-либо предварительной обработки при естественном освещении. Пятна изониазида и пиразинамида проявляются только при облучении светом УФ-лампы при длине волны 254 нм. А для проявления пятен этамбутола требуется обработка парами йода.
После обработки парами йода в УФ-свете на хроматограмме видны пятна всех изучаемых со-единений. Пятна этамбутола надежно проявляются при нанесении на пластинку 10 мкг действующего вещества, а пятна изониазида — 3 мкг. При этом для имеющихся дозировок комбинированных ПТП нагрузка рифампицина составляет 3−6 мкг, пиразинамида — 10−19 мкг, что позволяет также четко видеть соответствующие пятна и, в то же время, не перегружает хроматографическую пластину. На рис. 7 представлена схема соответствующей хроматограммы.
Заключение
Таким образом, в данной работе рассмотрены 2 метода выявления фальсифицированных лекарственных средств УФ-спектроскопия и тонкослойная хроматография, показано, что эти оба метода в достаточной мере избирательны и экспессны.
Фальсификат — это лекарственное средство, произведенное незаконно. Любое умышленное отклонение от нормы — тоже фальсификат. И если препарат произведен на том заводе, который изначально не может гарантировать качество лекарства, то этот производитель не может нести перед потребителем и всю ответственность за безопасность, эффективность и качество препарата. Следовательно, производит фальсификат.
Понятно, каждый производитель заинтересован, чтобы репутация его продукции не пострадала от прецедентов с фальсификатом. Очевидно, что чем больше цепочка посредников при поставке лекарственных средств, тем больше возможность появления на рынке фальсифицированной или некачественной продукции.
Действующая в настоящее время система сертификации лекарственных средств является, по существу, единственной преградой для ввоза в Россию и попадания в аптечную сеть некачественной продукции.
Список литературы
Золотов Ю. Основы аналитической химии. В 2 книгах. Книга 2. Методы химического анализа. Серия: Классический университетский учебник. — М.: Высшая школа, 2014. — 504 с.
Харитонов Ю. Аналитическая химия. Аналитика. В 2 книгах. Книга 1. Общие теоретические основы. Качественный анализ.
— М.: Высшая школа, 2010. — 616 с.
Харитонов Ю., Григорьева В. Аналитическая химия. Практикум. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. — 296 с.
Зенкевич И., Карцова Л., Москвин Л., Родинков О., Якимова Н. Аналитическая химия. В 3 томах. Том 2. Методы разделения веществ и гибридные методы анализа. Серия: Высшее профессиональное образование. — М.: Академия, 2008. — 304 с.
Хаханина Т., Никитина Н. Аналитическая химия. Учебное пособие. — М.: Юрайт, 2014. — 278 с.
Васильев В., Кочергина Л., Орлова Т. Аналитическая химия. Сборник вопросов, упражнений и задач. Серия: Высшее образование. — М.: ДРОФА, 2006. — 320 с.
Ищенко А. Аналитическая химия. — М.: Академия, 2013. — 320 с.
г
д
а
б
в
г
Ен — основное (нормальное)
энергетическое состояние
Ев — возбуждённое
энергетическое состояние
2 подуровни
1 основного уровня
Ев0 (Ев1 (Ев2
Рис. 3 Спектры поглощения (1)
и флюоресценции (2)
Рис. 4. Зависимость интенсивности испускания от концентрации вещества
