Комплексные пробиотические бактерии для лечения кишечных заболеваний

Содержание Аннотация Нормативные ссылки Определения Обозначения и сокращения Введение

1. Научно-исследовательская часть

1.1 Аналитический обзор

1.1.1 Исторические аспекты происхождения нового класса бактериальных препаратов — пробиотиков

1.1.2 Позиционирование термина «пробиотик» с точки зрения биотехнологии

1.1.3 Микробный состав пробиотических препаратов

1.1.4 Требования, предъявляемые микроорганизмам-продуцентам биологически-активных веществ

1.1.5 Влияние микроорганизмов, входящих в состав пробиотика, на желудочно-кишечный тракт животного

1.1.6 Систематика пробиотических препаратов, направленных на нормализацию кишечной микрофлоры

1.1.7 Применение пробиотиков как биологически активных добавок

1.1.8 Видовая характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bacillus

1.2 Постановка задачи исследования

1.3 Экспериментальная часть

1.3.1. Методики проведения экспериментов

1.4 Выводы и предложения для технологической части

2. Технологическая часть

2.1 Характеристика сырья, вспомогательных материалов, и их подготовка

2.2 Выбор штамма микроорганизмов

2.3 Разработка технологического режима и схема производства

2.4 Выбор основного и вспомогательного оборудования

2.5 Характеристика готовой продукции

2.6 Технологические расчеты Заключение Список использованных источников

Аннотация Пробиотик, дисбактериоз кишечника, пищеварительный тракт, Lactobacterium, Lactobacillus plantarum, Bacillus, Bacillus subtilis, антагонистическая активность, адгезия, питательная среда, желудочно-кишечный тракт, биомасса, культивирование, культуральная жидкость, штамм, ферментер Целью данной работы является изучение микробиологических свойств комплексных пробиотических бактерий для лечения кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Первый раздел дипломной работы (научно-исследовательская часть) содержит аналитический обзор с анализом патентных данных, постановку задачи исследования и экспериментальную часть, а также выводы и предложения для технологической части.

Во втором разделе (технологической части) описывается характеристика сырья, вспомогательных материалов, готового продукта, основного и вспомогательного оборудования, технологического режима и схемы производства, также приведены технологические расчёты.

Третий раздел посвящен безопасности жизнедеятельности, рассмотрены правила безопасности работы в лаборатории, решения по лабораторной санитарии и эстетике.

В четвёртом разделе (охрана окружающей среды) приводится общая характеристика производственного процесса, как источника загрязнения окружающей среды, и расчёт эколого-экономического ущерба.

В пятом разделе (экономика) проведена оценка экономической эффективности проведенных исследований.

Шестой раздел посвящен разработке бизнес-плана, содержание которого свидетельствует о том, что при функционировании предприятия по производству биопрепарата затраты окупятся через полтора года.

В заключении приводятся основные результаты и выводы по данной работе.

Нормативные ссылки В настоящей дипломной работе использованы следующие нормативные документы:

СТ РК 1.5 — 2004 Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов.

СТ РК 1.14 — 2004 ГСС РК Стандарт организации. Виды и порядок разработки.

СТ РК 1.12 — 2000 Документы нормативные текстовые.

ГОСО РК 3.08.327 — 2006 Государственный общеобязательный стандарт образования РК. Образование высшее, профессиональное. Основные положения.

ГОСТ 2.105 — 95 ЕСКД Общие требования к текстовым документам.

ГОСТ 2.106 — 96 ЕСКД Текстовые документы.

ГОСТ 2.109 — 73 ЕСКД Основные требования к чертежам.

ГОСТ 21.1101 — 97 СПДС Основные требования к проектной и рабочей документации.

СТ ЮКГУ 4.02−2010 Общие требования к построению, изложению и оформлению документации СМК.

СМК ЮКГУ ПР 7.03−2012 Управление учебно — методическими процессами.

СМК ЮКГУ ПР 4.01 — 2012 Управление документацией.

СМК ЮКГУ ПР 7.04 — 2012 Учебные занятия. Общие требования к организации, содержанию и проведению занятий.

Определения Пробиотик — биологически активный препарат микробного происхождения.

Дисбактериоз кишечника — это клинико — лабораторный синдром, возникающий при целом ряде заболеваний и клинических ситуаций, который характеризуется изменением качественного и количественного состава нормофлоры определенного биотопа, с последующими метаболическими и иммунными нарушениями, ассоциированными у части больных с избыточным бактериальным ростом в тонкой кишке и разнообразными клиническими симптомами.

Пищеварительный тракт — открытая система, посредством которой осуществляется контакт макроорганизма с внешней средой и присутствующими в ней микробами.

Lactobacterium — группа анаэробных бактерий, сбраживающих углеводы с образованием главным образом молочной кислоты. Все молочнокислые бактерии неспороносные, неподвижны, грамположительны. Имеются шаровидные молочнокислые бактерии, клетки которых образуют цепочки, например Streptococcus lactis, и палочковидные, например Lactobacillus.

Lactobacillus plantarum — широко распространенный вид грамположительных анаэробных неспорообразующих молочнокислых бактерий.

Bacillus — обширный род грамположительных палочковидных бактерий, образующих внутриклеточные споры. Большинство бацилл — почвенные сапрофиты.

Bacillus subtilis — вид грамположительных спорообразующих аэробных бактерий, представителей рода бациллы (Bacillus). Bacillus subtilis — один из наиболее хорошо изученных микроорганизмов.

Антагонистическая активность — способность одного вида микроба подавлять развитие или задерживать рост других микробов.

Адгезия — способность клеток слипаться друг с другом и с различными субстратами, которая обусловлена специфическими белками, связанными с плазматической мембраной; эти белки часто пронизывают мембрану и присоединяются к цитоскелету.

Питательная среда — вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макрои микроорганизмов.

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) — система органов, перерабатывающих пищу, извлекающих из нее питательные вещества, всасывающих питательные вещества в кровь, выводящих из организма непереваренные остатки.

Биомасса — общая масса микроорганизмов, приходящаяся на единицу поверхности или объема.

Культивирование — процесс выращивания микроорганизмов в особых аппаратах — ферментерах.

Культура микроорганизмов — клетки микроорганизмов, выращенные на жидкой или на твердой питательной среде.

Культуральная жидкость — 2-х фазная система, где твердая фаза это биомасса, а жидкая фаза — вода с растворенными веществами.

Ферментер — аппарат для культивирования микроорганизмов.

Штамм — чистая культура определенного вида микроорганизмов, у которого изучены морфологические и физиологические особенности. Производственные штаммы микроорганизмов, применяются для микробиологического синтеза.

Обозначения и сокращения БТ — биотехнология

КЖ — культуральная жидкость с/х — сельское хозяйство Биол. — биологический В.Б. — выход биомассы

Lac. Plantarum — Lactobacillus plantarum

B.subtilis — Bacillus subtilis

E.coli — Escherichia coli

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт Микробиол. — микробиологический Орган. — органический Технол. — технологический Физиол. — физиологический М.О. — микроорганизмы М — удельная скорость роста

Y — экономический коэффициент

?х — прирост биомассы

S — изменение концентрации субстрата КОЕ — колониеобразуюшая единица Ткал — календарный фонд Тном — номинальный фонд Ргод — годовая производительность Кзап — коэффициент запаса

Vкж — объем культуральной жидкости

Vф-ра — объем ферментера

Введение

Актуальность темы работы. В Казахстане одними из наиболее распространенных заболеваний животных являются кишечные, вызываемые такими возбудителями, как колибактерии, сальмонеллы, а при определенных условиях и энтеробактер, цитробактер, дрожжеподобные грибы.

Сложность лечения инфекционных заболеваний заключается в возникновении у патогенных микроорганизмов полирезистентности к антибиотикам. Кроме того, сами антибиотики часто оказывают побочное воздействие на организм человека и вызывают дисбактериоз кишечника, отягчающий течение основного заболевания. Это обусловливает необходимость поиска новых подходов к решению данной проблемы.

Одним из путей борьбы с инфекционными заболеваниями может быть использование с лечебной и профилактической целью молочнокислых бактерий и их метаболитов. Эти микроорганизмы являются симбионтами желудочно-кишечного тракта, безвредны для человека и животных. Лечебное действие они оказывают благодаря антимикробной активности, активации иммунной системы, главным образом неспецифического звена иммунитета, и нормализации кишечной микрофлоры.

Обширное число имеющихся на рынке пробиотиков для ветеринарии и медицины свидетельствует о том, что проблеме их разработки уделяется достаточное внимание. В своем развитии препараты пробиотики прошли несколько этапов — от препаратов первого поколения, содержащих отдельные живые клетки бактерий нормальной микрофлоры человека или животных вместе со средой их выращивания (бифидумбактерин, лактобактерин), до препаратов нового поколения, так называемых мультипробиотиков — многокомпонентных средств, обладающих новыми лечебными свойствами и действующих более активно, чем препараты первой генерации. По сути, они представляют комплексы, в которых предлагаются различные сочетания пробиотических культур с пребиотиками (вещества, которые перевариваются в кишечнике человека и способствуют росту и метаболической активности представителей нормофлоры), ферментами, иммуномодуляторами, витаминами и другими биологически активными добавками.

Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе молочнокислых бактерий для лечения сельскохозяйственных животных Южно-Казахстанской области. Создание пробиотиков и их широкое применение являются сегодня стратегическим направлением в борьбе со многими инфекционными желудочно-кишечного тракта лежит нарушение баланса кишечной микрофлоры. Для лечения и профилактики инфекций желудочно-кишечного тракта, использовали микроорганизмы-продуценты молочной кислоты, являющиеся представителями нормальной микрофлоры кишечника.

Научная новизна работы. Теоретически и экспериментально обоснованы и выбраны культуры штаммов Lactobacterium plantarum FK 20 и Bacillus subtilis F7 для включения в состав комплексного пробиотического препарата. Изучены антагонистические свойства штаммов с точки зрения их приживаемости в условиях желудочно — кишечного тракта животных. Определены оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наибольший выход биомассы.

Практическая значимость. Данные по характеристике микробиологических свойств комплексных пробиотических бактерий, по отбору биологически активных штаммов микроорганизмов Lactobacterium plantarum FK 20 и Bacillus subtilis F7, технология их культивирования в жидких питательных средах с различными ростовыми добавками могут быть использованы для профилактики и лечения желудочно — кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных Южно — Казахстанской области.

Оценка современного состояния решаемой научной проблемы.

В последнее время наблюдается тенденция к расширению использования бактериальных препаратов — пробиотиков, для коррекции микроэкологического равновесия кишечника сельскохозяйственных животных, в целях профилактики возникновения дисбактериоза и увеличения сопротивляемости организма к неблагоприятным факторам внешней среды. Это обстоятельство, в свою очередь, привело к развитию исследований, направленных на расширение номенклатуры и совершенствованию лекарственных форм этих препаратов. При создании новых и усовершенствовании уже выпускающихся лечебных препаратов встают вопросы по совершенствованию технологии и повышения качества препаратов, требующих более глубокого современного осмысления и решения. По существу долговременное введение пробиотика — весьма активного биологического агента, представляет собой прямое вмешательство в экосистему человека и животных. В связи с этим, необходимы дальнейшие исследования по изучению свойств штаммов, используемых для создания пробиотиков, отработке технологических режимов производства, в частности разработке эффективных и экономичных питательных сред.

Таким образом, качество пробиотического препарата и эффективность биотехнологии их производства зависит в первую очередь от успешного выбора питательной среды культивирования продуцента.

В вышеуказанных данных особенно актуальной является разработка комплексных биопрепаратов направленного действия, эффективных в борьбе с инфекционными заболеваниями, благодаря использованию пробиотических микроорганизмов.

Цель работы: исследование микробиологических свойств комплексных пробиотических бактерий для лечения кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Основными задачами в соответствии с целью данной работы являлись:

— освоить методику выделения чистой культуры микроорганизмов;

— изучить, подобрать и приготовить питательные среды для культивирования;

— отобрать наиболее пригодные по биологическим свойствам штаммы Lactobacterium и Bacillus для получения пробиотика;

— подобрать условия культивирования, обеспечивающие наибольший выход биомассы;

— разработать технологическую схему получения комплексного пробиотического препарата для лечения желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных.

Объектами исследований служили молочнокислые бактерии рода Lactobacterium plantarum и бактерии рода Bacillus subtilis.

Теоретическая, методологическая основа работы.

Основой для начала исследования служили теоретические и практические данные о способности ряда микроорганизмов продуцировать пробиотические препараты. Именно Lactobacterium plantarum и Bacillus subtilis наиболее широко используются для восстановления нормальной микрофлоры. На основе таких микроорганизмов были созданы микробиологические препараты комплексного действия для животноводства. Их применение для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний телят показало высокую эффективность [4−5].

В работе были использованы современные биохимические, микробиологические, методы исследования:

— определение антимикробной активности методом диффузии в агар, определение резистентности микроорганизмов к антибиотикам — методом стандартных дисков, пропитанных антибиотиками;

— определение численности микроорганизмов проводили путем ряда последовательных разведений, культивирование микроорганизмов на различных по составу питательных средах;

— электронно-микроскопические исследования, выделение и разделение антибиотических комплексов колоночной и тонкослойной хроматографией.

Все практические работы по исследованию проводились на кафедре «Биотехнология» Химико — технологического факультета Южно-Казахстанского Государственного университета им. М. Ауэзова в микробиологической лаборатории 122 корпуса А.

Практическая база написания дипломной работы.

Практическая база оснащена современным оборудованием и приспособлена для проведения исследовательских работ. Основная часть дипломной работы проведена в микробиологической лаборатории кафедры «Биотехнология» ЮКГУ им. М.Ауезова.

Апробация и публикации результатов.

Основные положения и отдельные этапы дипломной работы докладывались:

— на пленарном и секционном заседаниях 17-ой студенческой научной конференции по естественным, техническим, социально-гуманитарным наукам: «Казахстанский путь — 2050: Единая цель, единые интересы, единое будущее», Южно-Казахстанского Государственного университета им. М. Ауэзова, проходившее с 8 по 10 апреля 2014 г. За выступление получен диплом I категории;

— на конкурсе инновационных идей и проектов, организатором которого выступило ТОО «Шымкент инновация». Конкурс проходил на базе Южно-Казахстанского государственного университета им. М. Ауэзова 19 декабря 2013 г. За выступление было получено благодарственное письмо;

— на первой международной научной конференции студентов и молодых ученых под названием «Будущее развития биологии, медицины и фармации», проходившей на базе Южно-Казахстанской Государственной фармацевтической академии 10−11 декабря 2013 г. За выступление получен сертификат участника конференции;

— на 17-ой студенческой научной конференции, посвященной 70-летию ЮжноКазахстанского государственного университета им. м.Ауэзова. За выступление получен диплом за I место.

Публикации результатов работы:

— в трудах 17-ой студенческой научной конференции по естественным, техническим, социально-гуманитарным наукам: «Казахстанский путь — 2050: Единая цель, единые интересы, единое будущее», Южно-Казахстанского Государственного университета им. М. Ауэзова, том I, стр. 59−60;

— в Республиканском научном журнале «Вестник», том III, стр. 86−89.

Положения, выносимые на защиту дипломной работы:

— результаты эксперимента;

— технологическая схема производства пробиотического препарата;

— оценка экономической эффективности проведенных исследований.

Структура и объем работы. Данная дипломная работа состоит из 99 листов формата А4, из которых: научно-исследовательская часть — 39 листов, технологическая часть — 10 листов, безопасность жизнедеятельности — 9 листов, охрана окружающей среды — 5 листов, экономика — 6 листов, бизнес-план — 14 листов. Библиографический список включает 62 наименования.

1. Научно-исследовательская часть

1.1 Аналитический обзор

1.1.1 Исторические аспекты происхождения нового класса бактериальных препаратов — пробиотиков Наше время можно назвать «наступающей эпохой пробиотиков». Они становятся самыми многообещающими продуктами, с которыми мировая наука связывает новые возможности в сохранении здоровья и продлении жизни животных в XXI веке и в будущем.

Пробиотики — естественная альтернатива синтетическим химическим веществам и загрязнению природы.

Кишечник — это самый важный для иммунной функции орган: приблизительно 60% иммунных клеток организма находятся в его слизистой оболочке.

По прогнозам специалистов, в ближайшие 20 лет доля пробиотиков и продуктов так называемого функционального питания, куда включены живые микроорганизмы, достигнет 30% на продуктовом рынке (сегоднявсего 3%).

Развитие идеи И. И. Мечникова по целенаправленному изменению состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта путем введения культур молочно-кислых бактерий в качестве антагонистов гнилостных микробов оформилось в направление и привело к созданию нового класса бактериальных препаратов — пробиотиков.

В 1974 г. Р. В. Паркер назвал пробиотиками микробные препараты (микроорганизмы или их компоненты), регулирующие микрофлору кишечника. В дальнейшем на основе живых бифидои лактобактерий были созданы различные препаративные формы (лактобактерин, бифидумбактерин, ацидофилин, колибактерин и др.), которые до настоящего времени широко используются для восстановления нормальной микрофлоры и лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Бифидобактерии, бациллы и лактобактерии предупреждают развитие дисбактериоза. В процессе их жизнедеятельности образуются витамины В1, В2 и К, а также молочная и уксусная кислоты. Кислая среда способствует лучшему всасыванию жиров, витаминов, железа и кальция, задерживает размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

В настоящее время многие ученые рассматривают совокупность микроорганизмов как микробную экосистему. Нормальная микробная экосистема благоприятна для организма животного. Потенциально патогенные микробы могут присутствовать в экосистеме, но экологический баланс такой, что они остаются в количестве, безопасном для организма.

Кишечной микрофлоре принадлежит важная роль в нормальной кишечной перистальтике, а также, а расщеплении и всасывании продуктов обмена липидов, белков и углеводов.

Состав микробной флоры желудочно-кишечного тракта зависит от питания, условий и качества жизни (психологического климата). Достаточно сменить питание и условия жизни, и сразу же меняется состав микроорганизмов.

Нарушение нормального состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта, обеднение ее полезными бактериями снижает защитные функции, естественную сопротивляемость, приводит к возникновению различных заболеваний и отрицательно сказывается на пищеварении и обмене веществ у животного.

Важнейшая роль в восстановлении нормального микробиоценоза кишечника принадлежит бактерийным препаратам на основе живых микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры, — пробиотикам. В настоящее время появилось новое понятие — биотерапевтические агенты (БТА), представляющие собой препараты микроорганизмов на основе штаммов лактобифидобактерий. Бифидумбактерин, лактобактерин, кисло-молочный бифидумбактерин относятся к категории БТА.

Очень перспективно применение пробиотиков, изготовленных на основе различных штаммов сенной палочки, содержащих споры этих бактерий. Эти препараты подавляют рост и размножение сальмонелл, шигелл, микробов рода протея, стафилококков, грибов рода кандида, кампилобактера и энтеропатогенных кишечных палочек. Сходным действием обладает энтерол (лечебные дрожжи), обладающий антагонистическим действием к клостридиям, некоторым грибам, шигеллам, эширихиям, псевдомонадам. Параллельно проводятся коррекция моторной функции кишечника, противовоспалительная терапия, стимулирование реактивности организма.

Пробиотики являются эффективными лечебно-профилактическими средствами. Их применяют для нормализации экологических систем животного. Эти препараты имеют ряд преимуществ по сравнению с антимикробными средствами других групп. Они физиологичны, имеют выраженную антимикробную активность в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, оказывают иммуностимулирующее и пртивовоспалительное действие, осуществляют коррекцию моторной функции кишечника. К ним в меньшей степени формируются устойчивые штаммы микроорганизмов. Пробиотические препараты весьма эффективны для обеспечения постоянства микробиологических экосистем.

Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков, классифицируют на 4 группы:

— аэробы — спорообразующие бактерии рода Bacillus;

— анаэробы — спорообразующие бактерии рода Сlostridium;

— бактерии, продуцирующие молочную кислоту (Bifidobacrerium, Lactobacillus, Enterococcus, неспорообразующие);

— дрожжи — используются в качестве сырья при изготовлении пробиотиков.

Большинство специалистов отмечают, что постоянное присутствие в кишечнике адгезированных на его стенке резидентных микроорганизмов предотвращает размножение патогенов, их внедрение в энтероциты и прохождение через кишечную стенку. Кишечные бактерии защищают хозяина от патогенов, а также формируют переднюю линию слизистой защиты.

В результате сложных биохимических процессов, протекающих в ЖКТ, микроорганизмы, усваивая поступающие питательные вещества, размножаются, растут и быстро увеличивают свою биомассу. Отмирая, они перевариваются и усваиваются организмом, являясь источником белка.

Полезное действие пробиотиков и пробиотических продуктов известно с начала ХХ в., когда И. И. Мечниковым была создана простокваша с живыми ацидофильными бактериями. В 1918 г. Nissle предложил использовать препарат из кишечной палочки для лечения расстройств пищеварительной системы. В нашей стране пробиотики, содержащие эшерихии, стали употребляться с середины прошлого века. Затем, в 70-х гг. были сконструированы и внедрены в практику отечественные бифидумбактерин и лактобактерин, нашедшие широкое применение для коррекции дисбактериоза кишечника. Дальнейшее направление получило расширение ассортимента пробиотических штаммов, входящих в биопрепараты. Новые биотехнологии, позволяющие создать препараты активного действия, внедрены с конца 20-го начала 21-го вв. Традиционно пробиотики используются для подавления патогенной, условнопатогенной и восстановления нормальной микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах. Но, как показали исследования последних лет, действие пробиотиков не ограничивается коррекцией микрофлоры, их клиническая эффективность основана также на иммуномодулирующих функциях и участии в обмене веществ. Выявленные точки приложения пробиотиков позволяют расширить показания к их назначению и конструировать препараты с заданными свойствами.

1.1.2 Позиционирование термина «пробиотик» с точки зрения биотехнологии Пробиотики в современном понимании — это бактерийные препараты из живых микробных культур, предназначенные для коррекции микрофлоры животных и лечения ряда заболеваний. Термин «пробиотик», обозначающий живые микроорганизмы — представители нормальной микрофлоры, которые выживают при прохождении через желудочно-кишечный тракт животного и оказывая на него благоприятное воздействие.

Пробиотики — это живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном пути введения положительный эффект через регуляцию микрофлоры кишечника животных.

Пробиотик — это стимулятор роста для животных.

Споры пробиотика вместе с кормом попадают в пищевод, затем преодолевают жизнеспособными кислую среду желудка и, попадая в щелочную среду тонкого кишечника, прорастают в вегетативные клетки выделяя при этом большое количество пищеварительных ферментов, чем способствуют более полному расщеплению и перевариванию корма.

Рациональная терапия и профилактика инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии должны базироваться на знаниях микробной этиологии любого организма.

Сформировавшиеся дисбактериозы кишечника трудно поддаются лечению и для полного выздоровления требуется длительное время. Учитывая, что число факторов, способствующих развитию заболеваний, сопровождающихся дисбактериозами у людей и животных велико и спектр их возрастает, разработка эффективных методов профилактики и лечения дисбактериозов кишечника различной этиологии является одной из важных проблем медицины и ветеринарии.

Для эффективного лечения желудочно-кишечных болезней животных необходимо проведение терапии, направленной на поддержание и сохранение, формирование или коррекцию видового и численного состава резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

В настоящее время наиболее распространенными и приемлемыми средствами поддержания микроэкологии человека на оптимальном уровне и ее коррекции считаются пробиотики. Подобная терапия сопровождается, как правило, позитивными сдвигами в системе неспецифической защиты организма и приводит к повышению сопротивляемости организма к воздействию неблагоприятных факторов.

Идея коррекционого воздействия на внутреннюю среду организма животных путем целенаправленного изменения состава симбиотической микрофлоры принадлежит основоположнику отечественной микробиологии И. И. Мечникову. Предложенный им метод энтерального введения живых культур молочнокислых бактерий в качестве антагонистов гнилостных микробов явился началом современных, исследований в области бактериотерапии и профилактики различных патологических состояний, патогенетически связанных с нарушением состава нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

О пользе для здоровья пробиотиков свидетельствуют наличие устойчивого рынка разнообразных продуктов, содержащих живые бактерии, а также многочисленные публикации, подтверждающие с научной точки зрения механизмы пробиозиса — выгодного содружества животных организмов с определенными группами микроорганизмов. Хотя большинство бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, являются представителями семейств Lactobacillus и Bifidobacterium, все чаще в таком качестве стали использоваться и спорообразующие бактерии, в особенности из рода Bacillus.

Сегодня в мире широко распространено профилактическое и терапевтическое применение пробиотиков. Пробиотики — живые микроорганизмы, которые при применении их в адекватных количествах оказывают благотворное влияние на здоровье макроорганизма путем изменения свойств нормальной микрофлоры.

Лактобактерии являются факультативными анаэробами, тоесть могут переносить небольшое количество кислорода внешней среды, но лучше растут без него, а бифидобактерии — облигатными анаэробами, тоесть вообще не переносят кислород.

На защитную функцию лактобацилл и их роль в формировании защитных сил организма впервые указал русский ученый И. И. Мечников, который является основоположником идеи использования кисломолочных продуктов, содержащих лактобациллы, для нормализации процессов, протекающих в кишечнике при участии микроорганизмов. Препараты, содержащие лактобактерии, успешно используются в качестве эффективного и безопасного средства для профилактики и лечения множества заболеваний.

Пробиотики относятся к группе медицинских иммунобиологических препаратов на основе живых бактерий, антагонистически активных в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов — возбудителей острых кишечных инфекций и токсикоинфекций. Пробиотики в свою очередь тоже подразделяются на группы. На рисунке 1 показаны четыре группы пробиотических препаратов.

Применение пробиотиков является примером заместительной терапии. Этим и обусловлено наличие целой группы препаратов пробиотиков, отличающихся не только формой, медико-биологическими характеристиками, но и, главным образом, видом включенных в препарат представителей нормальной микрофлоры. Считается целесообразным использование пробиотических препаратов из нескольких родов (видов) и штаммов бактерий, введение в препарат компонентов, повышающих резистентность организма или обладающих иммуномодулирующим действием.

В отличие от антибиотиков и химиопрепаратов пробиотики не оказывают негативного влияния на представителей нормомикрофлоры желудочно-кишечного тракта и слизистых оболочек человека и животных, а, наоборот, при дисбиотических изменениях способствует ее качественному и количественному восстановлению до нормальных значений. В составе препаратов пробиотиков, помимо бактерий обладающих антагонистической активностью, содержатся также различные биологически активные вещества, являющиеся продуктами их метаболизма. В числе таких метаболитов могут быть: бактериоцины, антибиотики, аминокислоты, ферменты, пептиды и полипептиды, полисахариды, витамины и нуклеотиды.

Разнообразие микроэкологических нарушений нормальной микрофлоры, обуславливающих дисбактериоз, требует для их коррекции различные по составу пробиотики. Пробиотики разделяют на следующие группы препаратов:

— препараты, содержащие живые микроорганизмы;

— препараты, содержащие структурные компоненты микроорганизмовпредставителей нормальной микрофлоры или их метаболиты;

— препараты микробного или иного происхождения, стимулирующие рост и активность микроорганизмов представителей нормальной микрофлоры;

— препараты, содержащие комплекс живых микроорганизмов, их структурных компонентов и метаболитов в различных сочетаниях и соединений, стимулирующих рост представителей нормальной микрофлоры.

Рисунок 1. Группы пробиотических препаратов Совершенствование существующих пробиотиков, расширение спектра их номенклатуры и использование в качестве эффективных лечебных препаратов в комплексной терапии инфекционных заболеваний является важной и актуальной задачей современной медицины.

В настоящее время совершенствование этих препаратов осуществляется по следующим направлениям: поиск новых высокоактивных штаммов бифидои лактобактерий; разработка пробиотиков на основе ассоциированных микробных культур; использование аутои донорских штаммов индигенных микроорганизмов для конструирования новых препаратов, получение антибиотикорезистентных штаммов и создание на их основе бакпрепаратов для предупреждения развития химиотерапевтического дисбактериоза, оптимизация технологических процессов производства, разработка эффективных и экономичных питательных сред и лекарственных форм препаратов.

Механизм действия бактериальных препаратов обусловлен способностью микроорганизмов, входящих в их состав, выживать в кислой среде, эффективно прикреплятся к эпителиоцитам слизистой стенки кишечника и колонизировать ее, продуцировать антимикробные вещества, вызывать стимуляцию иммунной системы, подавлять рост и размножение патогенных микробов и восстанавливать нормальную микрофлору кишечника. Таким образом, пробиотические препараты оказывают влияние на такие процессы, как коррекция микрофлоры, стабилизация проницаемости кишечника, рост патогенных бактерий и их конкуренцию, элиминация, усиление иммунных реакций организма и метаболической активности микрофлоры.

Противопоказания для назначения бактериальных препаратов, как правило, отсутствуют, однако в ряде случаев их применение требует осторожности. Такие препараты содержат среду высушивания, которая может вызывать аллергические реакции. В настоящее время, как в Казахстане, так и за рубежом при конструировании пробиотиков используют два принципа выбора микроорганизмов-антагонистов. По мнению большинства специалистов, при разработке пробиотиков основополагающим принципом является создание таких препаратов на основе микроорганизмов — представителей нормальной микрофлоры человека; бифидо-, коли-, лактобактерий, бактериоидов и т. д. Эти микроорганизмы колонизируют слизистую кишечника. Значение данных микроорганизмов бесспорно, что признается всеми исследователями. Некоторые авторы утверждают, что пробиотики должны изготавливаться только на основе микроорганизмов из числа представителей резидентной (эндогенной) нормофлоры, для чего необходимы подбор природных или селекция высокоактивных штаммов. Наиболее известными микроорганизмами, которые используют в качестве основы данных препаратов, являются лактобациллы.

1.1.3 Микробный состав пробиотических препаратов Наиболее часто для изготовления пробиотиков на основе живых микроорганизмов используют следующие виды микроорганизмов: Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, B. bifidum, B. breve, Lactobacillus acidophilus, L. lactis, Streptococcus lactis и др. Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков, делятся на четыре группы: аэробы — спорообразующие бактерии рода Bacillus; анаэробы — спорообразующие бактерии рода Clostridium; бактерии, продуцирующие молочную кислоту (Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, неспорообразующие; дрожжи — используются в качестве сырья при изготовлении пробиотиков.

Streptococcus lactis — молочный стрептококк. Форма клеток в молоке — овальные кокки величиной от 0,5 до 1 мк, соединенные попарно или в виде коротких цепочек. Хорошо окрашиваются по Грамму, неподвижны, спор не образуют. На плотных питательных средах образуют колонии мелкие, круглые, светлые. Оптимальная температура развития 25−30 оС, максимальная 40 оС, минимальная 10 оС и иногда несколько ниже. При внесении культуры петлей в 10 мл молока и при оптимальной температуре активные штаммы свертывают молоко за 10−12 часов, образуя плотный ровный сгусток. Через 18 часов кислотность сгустка достигает 80−90 Т, а через 5−7 дней 100−125 Т. Восстанавливают и свертывают лакмусовое молоко, не образуют ацетоина, растут при 39 оС и при наличии 4% NaCl образуют значительное количество кислоты, разлагают аргинин с выделением аммиака; не развиваются в среде, в которой содержится 6,5% NaCl и в щелочной среде.

Род Lactobacillus — клетки палочковидные, обычно правильной формы. Палочки длинные, но иногда почти кокковидные, обычно в коротких цепочках. Грамположительные, спор не образуют; в редких случаях подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Факультативные анаэробы, иногда микроаэрофилы; слабо растут на воздухе, лучше при пониженном содержании кислорода; некоторые при выделении анаэробы. Рост обычно стимулируется с добавлением 5% CO 2. Колонии на агаризованных средах диаметром 2−5 мм, выпуклые, с цельным краем, непрозрачные, непигментированные. Хемоорганотрофы, нуждаются в богатых сложных средах. Метаболизм бродильного типа, сахарокластический. Нитрат не восстанавливают, желатину не разжижают, каталазоотрицательные, цитохромов не содержат. Оптимальная температура для роста 30−40 оС. Широко распространены в окружающей среде, особенно часто встречаются в пищевых продуктах животного и растительного происхождения; входят в нормальную микрофлору пищеварительного тракта у птиц и млекопитающих.

Lactobacillus acidophilus — ацидофильная палочка. Форма клеток в молоке — длинные и короткие палочки, от 3 до 40 мк, толщиной 1 — 1,5 мк, красятся по Граму, наблюдаются метахроматические зерна при окрашивании препаратов метиленовым синим, на плотных питательных средах образуют колонии: поверхностные — более или менее крупные (диаметром 1,5 — 3 мм), светлые, локонообразные; глубинные — в виде паучков. Оптимальная температура развития 37 — 38 оС, максимальная 60 — 62 оС, минимальная около 20 оС. При внесении в пробирку с молоком сквашивание при оптимальной температуре наступает через 10 — 12 часов. Предельная кислотность в молоке 180 — 300 Т. В молоке образуют DL молочную кислоту. Основным отличительным свойством ацидофильных бактерий является их антибиотическая активность. Ацидофильные бактерии способны подавлять развитие ряда микроорганизмов, в том числе бактерий группы кишечной палочки, дизентерийной, паратифозной и других. Устойчивы к неблагоприятным воздействиям внешней среды щелочной реакции (рН 8), наличию в среде фенола, солей желчи (20%), NaCl (2%). Ацидофильные бактерии (ацидофилус, ацидофилии) — «дружественные» бактерии, способствующие перевариванию белков и тем самым замедляющие рост патогенных микроорганизмов за счет образования в результате этого процесса молочной кислоты, перекиси водорода, ферментов, витаминов группы В и антибактериальных веществ [20−24].

Lactobacillus acidophilus — это тип бактерий, обычно находящихся в здоровом пищеварительном тракте. Она помогает устанавливать баланс дружественных бактерий, которые помогают пищеварению, защищает от инфекций и обеспечивает надлежащее разложение отходов. Здоровый пищеварительный тракт — это также улучшенное поглощение организмом питательных веществ. Преимущества этого штамма бактерий в том, что они «спят» пока не попадут в малый желудок; они обладают также достаточной силой, чтобы выжить, проходя через весь желудок. Также этот штамм бактерий способен нейтрализовать токсины, вырабатываемые недружественными бактериями и разлагающейся пищей.

Для обеспечения высокого качества пробиотиков соответствующая высокая технология их производства, упаковки и хранения. Например, Lactobacillus acidophilus легко повреждается в результате лиофилизации, воздушной сушки или конвекционного холодного хранения. Нарушение температурного режима при упаковке и хранении могут резко снизить качество продукта.

Препаративные формы из живых бактерий широко используются для восстановления нормальной микрофлоры. Эти препараты физиологичны и экологически безвредны. Кроме антогонистической активности они обладают витаминообразующими, ферментативными иммунизированными свойствами. Доказана прямая зависимость антагонистической активности и уровня кислотообразования, которая присуща только пробиотическим штаммам лактобацилл, а также контрантагонистическая резистентность бифидобактерий (обратного антогонизма) в смешанных культурах. Показано, что антагонистическая активность бифидобактерий повышается в процессе их совместного культивирования с шигеллами. Обнаружено, сто тиосодержащие органические соединения способны замедлять окислительные процессы в частности, унитиол способны пролонгировать сохранность бифидобактерий.

Молочнокислые бактерии, широко распространенные в природе, становятся важным компонентом кишечной микрофлоры молодых теплокровных животных вскоре после их появления на свет. Уместно предположить, что лечение пробиотиками может быть чрезвычайно полезным для животных в стрессовых ситуациях, как альтернатива профилактике стресса низкими дозами антибиотиков.

1.1.4 Требования, предъявляемые микроорганизмам-продуцентам биологически-активных веществ Согласно требованиям Продовольственной и сельскохозяйственной организации при ООН (Food and Agriculture organization of the United NationsFAO) и ВОЗ (2002г) микроорганизмы, входящие в состав пробиотика, должны обладать следующими свойствами:

— быть непатогенными и нетоксичными;

— выживать в кишечнике;

— сохранять стабильность состава и жизнедеятельность в течение всего срока хранения;

— состоять из живых клеток, которые обладают высокой адгезивной и антагонистической способностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам;

— не должны угнетать нормальную микрофлору кишечника;

— иметь генетический паспорт и доказательство генетическое стабильности (быть чувствительными или иметь природную резистентность к антибиотикам).

Для микроорганизмов, используемых при производстве пробиотиков, установлены определенные правила: они должны быть изолированы из организма тех видов животных, для которых они и будут предназначены; они должны обладать полезным воздействием на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями; при длительном использовании они не должны вызывать побочные эффекты; они должны обладать колонизационным потенциалом, то есть сохраняться в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного действия; они должны обладать стабильными характеристиками как в клиническом, так и в технологическом плане; они должны обладать высокой скоростью роста и размножения в условиях, близких таковым в кишечном тракте, при их культивировании in vitro для накопления биомассы следует создавать условия, максимально приближающие таковым микроокружения просвета кишечника.

При отборе производственных штаммов следует отдавать преимущество умеренным кислотобразователям в расчете на продукцию отобранными штаммами истинных антибиотикосхожих субстанций. При этом необходимо обязательно учитывать генетические особенности этих штаммов. Конструирование поликомпонентных пробиотиков следует проводить с учетом природного синергизма видов, путем оценки накопления биомассы отдельными культурами при совместном их выращивании. При разработке лекарственных форм препаратов требуется учитывать принципы биоформации протективного или ингибирующего действия вспомогательных веществ.

Дефицит лакто — и бифидофлоры, как правило отмечается при кишечных инфекциях бактерийной и вирусной этиологии. Установлена ассоциативная связь между заболеваемостью сальмонеллезом, колибактериозом, аскаридозом и дефицитом нормальной кишечной микрофлоры и выявлено влияние состава микрофлоры кишечника на клиническое проявление и, тяжесть течения, глубину поражения и исход заболевания.

1.1.5 Влияние микроорганизмов, входящих в состав пробиотика, на желудочно-кишечный тракт животного Микроорганизмы, используемые для применения в качестве лекарственных препаратов и биологически активных добавок оказывают свое действие на организм через различные медиаторы, которые представляют собой либо компоненты микробной клетки, либо продукты метаболической активности пробиотических штаммов или нормальной микрофлоры кишечника. Эти медиаторы, достигая места своего приложения в нервной, гормональной, иммунной или иных тканях, органах и системах организма хозяина, прямо или опосредованно взаимодействуют в них с соответствующими рецепторами, структурами или ферментами, следствием чего являются благоприятные для макроорганизма изменения в его биохимических, поведенческих реакциях или физиологических функциях. Таким образом, «дружественные» живые микроорганизмы, используемые для изготовления пробиотиков можно рассматривать, как небольшие фабрики, производящие множество разнообразных биологически активных соединений — медиаторов, участвующих в восстановлении и поддержании здоровья и снижающих риск возникновения заболеваний.

Наиболее важными для слизистой кишечника специфическими функциями пробиотических микроорганизмов являются продукция ими в процессе своей жизнедеятельности питательных субстратов и аминокислот типа аргинина, а также таких микронутриентов, как витамины, антиоксиданты, амины и другие соединения, имеющих значимость не только для пищеварительного тракта, но и для всего организма.

Дружественные для организма хозяина бактерии препятствуют усиленному росту потенциально — патогенных микроорганизмов, предотвращают их транслокацию и стимулируют иммунные механизмы защиты, прежде всего лимфоидную ткань, связанную с пищеварительным трактом. Кроме того, они элиминируют и детоксицируют токсины, а также те субстанции, которые, присутствуя в просвете кишки, не являются необходимыми для последней. Одним из примеров последней функции может служить способность лактобацилл образовывать в толстой кишке стероиды из холестерина. Пробиотические микроорганизмы участвуют в регуляции таких кишечных функций как утилизация муцина, абсорбция питательных субстратов различной природы, перистальтика, кроваток в кишечных и иных сосудах и другие.

1.1.6 Систематика пробиотических препаратов, направленных на нормализацию кишечной микрофлоры Пробиотики могут разделяться не только по комплектности препарата, но и по родовому составу входящих в них бактерий. Выделены бифидосодержащие пробиотики (бифидумбактерин сухой и бифидумбактерин в порошке, бифилиз, бифиформ, бификол, бифидумбактерин форте, пробифор), лактосодержащие пробиотики (лактобактерин, аципол, ацилакт, линекс, биобактон, гастрофарм), колисодержащие пробиотики (колибактерин, бификол, биофлор), пробиотики из родов бацилл, аэрококков и дрожжеподобных грибов сахаромицет (бактисубтил, бактиспорин, споробактерин, биоспорин, энтерол). Энтерококки содержат только импортные пробиотики линекс и бифиформ или отечественные биологически активные добавки, не имеющие статуса препарата. Большинство пробиотиков, за исключением линекса, энтерола, биофлора и бифиформа, производится в России.

Согласно принятой в 1996 г. классификации, препараты, нормализующие кишечную микрофлору разделяются на 4 поколения.

Таблица 1 — Классификация пробиотических препаратов

Все большую популярность приобретает другой класс препаратов для регуляции кишечной микрофлоры, получивший название пребиотики. Пребиотики — это препараты или биологически активные добавки немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм через селективную стимуляцию роста или метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника. В эту группу входят препараты, относящиеся к различным фармакотерапевтической группы, но обладающие общим свойством: возможностью стимулировать рост нормальной микрофлоры кишечника. Наиболее популярными из них являются дюфалак, хилакфорте, лактулоза, лизоцим, пантотеновая кислота, препараты инулина и др. В схемах пробиотической коррекции пребиотики используются, обычно, в качестве дополнительного лечения.

1.1.7 Применение пробиотиков как биологически активных добавок Пробиотические препараты как БАД восстанавливают микробиоценоз и пристеночное пищеварение при инфекционных заболеваниях. Можно использовать одновременно с антибиотиками, если пробиотики влючают устойчивые к антибиотикам штаммы (например, лактобифадол). Если штаммы, входящие в препарат, не устойчивы к антибиотикам, то его применяют после антибиотикотерапии для восстановления нормальной микрофлоры. Антагонизм к патогенной флоре проявляется в разной степени у разных препаратов за счет продукции органических кислот, перекисей, низкомолекулярных пептидов. При легких формах диареи иногда достаточно применение пробиотика на фоне ограничения диеты без антибиотиков. Но в промышленном животноводстве и птицеводстве для профилактики распространения инфекции, на наш взгляд, необходима комбинация эффективного антибиотика и пробиотика.

Нормализуют пищеварение при дисбактериозах различной природы, после кормовых отравлений, использования фармакологических препаратов (антибиотиков, антгельминтиков, кокцидиостатиков и др.). Способствуют повышению иммунитета, не устойчивы к высокой температуре, микроорганизмы погибают при гранулировании кормов.

Пробиотики являются неотъемлемым компонентом при организации фармакологического обеспечения в условиях промышленного животноводства и птицеводства. Действие патогенетических факторов быстро приводит к функциональным срывам со стороны различных систем и органов; в условиях крупномасштабного производства с высокой концентрацией поголовья на ограниченных территориях создается необходимость многочисленных вакцинаций, что приводит к высокой антигенной нагрузке; вакцинальный и технологический стрессы резко снижают резистентность, способствуют персистенции условно-патогенной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте и других биотопах (легкие, мочеполовые пути, кожный покров); многие живые аттенуированные вакцины (особенно из так называемых горячих штаммов) приводят к прямой колонизации клеток кишечника, респираторной и других систем и к поствакцинальным сдвигам в микрофлоре соответствующих областей; резкое возрастание фармакологической нагрузки на животных и птицу. Вопреки сложившимся стереотипам нарушать микробиоценоз могут не только антибиотики, антгельминтики и кокцидиостатики, но и избыточно назначаемые несбалансированные кормовые добавки; существенное ухудшение экологической ситуации. Корма, воздух, вода могут быть дополнительными источниками токсических веществ, пестицидов, которые нарушают слизистую оболочку различных полостей и прямо влияют на микробиоценоз; широкое распространение кормовых микотоксикозов.

Таким образом, действует комплекс факторов, которые нарушают естественные защитные свойства нормальной пристеночной микрофлоры. Питаясь гранулированными, часто обработанными термически кормами, животные в замкнутых помещениях полностью лишены контакта с естественными донорами нормальных микроорганизмов, доступными в природе (почва, насекомые, растения). В связи с циклическими дезинфекциями, бессистемным и длительным использованием антибиотиков, особенно широкого спектра действия, в окружающей среде происходит селекция резистентной к антибиотикам микрофлоры. На наш взгляд, часто создается ситуация, которую мы можем сравнить с так называемой стационарной «госпитальной инфекцией» в медицине. Возникли ассоциированные инфекции, которые могут протекать как остро, так и латентно, атипично без высокой смертности.

Естественно, нельзя отказаться от вакцинаций, дезинфекций, применения антибиотиков, антгельминтиков, кокцидиостатиков при соответствующих показаниях. Но восстановить нормальную микрофлору после их применения необходимо. Если слизистая пищеварительного тракта нарушена, эффективное производство невозможно, так как пищевые компоненты корма просто не усваиваются.

При выборе пробиотика целесообразно учитывать его фармакологические свойства. При необходимости нормализовать примембранное пищеварение, не следует использовать препараты на основе дрожжей. Сильные антагонисты на основе В. subtilis будут эффективны только при отдельных инфекциях. Нельзя полностью отказаться от антибиотиков, так как возможна реальная угроза распространения инфекции на все поголовье с резким снижением производственных показателей. Препараты, включающие лактои бифидобактерии, могут быть неэффективны, если производятся на основе медицинских или фармакологически неактивных в кишечнике животных и птицы штаммов микроорганизмов.

Препараты из живых бактерий получили широкое распространение во многих странах, и сфера их применения постоянно расширяется. При столь широком использовании бактерийных биопрепаратов мнения исследователей о степени их эффективности при различных формах заболеваний и самом механизме действия весьма разноречивы. Этим, отчасти, можно объяснить значительное многообразие состава и форм препаратов данного типа, предлагаемых практической медицине и ветеринарии. Примечательно, что в каждой из стран, применяющих препараты из бактерий — представителей нормальной микрофлоры, последние различаются по видовому составу и свойствам культур, набору входящих в них штаммов и формам выпуска.

Главное назначение пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов с пробиотическими свойствами — это поддержание хорошего состояния здоровья у людей различных возвратных групп. В биотехнологических процессах производство продуктов с пробиотическими свойствами микроорганизмы выполняют следующие функции: изменят физико-химические показатели исходного сырья, осуществляют биохимические превращения исходных компонентов в соединения, обуславливающие органолептические показатели кисломолочных продуктов. Пробиотическое действие продуктов и препаратов обусловлено свойствами применяемых микроорганизмов, в частности бифидобактерий, лактобацилл и других молочнокислых бактерий. Таким образом, определяющим этапом в биотехнологии таких продуктов являются принципы подбора штаммов микроорганизмов для кисломолочных продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами.

пробиотический бактерия лечение кишечный

1.1.8 Видовая характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bacillus

Лактобациллы — род грамположительных факультативно-анаэробных бактерий. Один из важнейших в группе молочнокислых бактерий, большинство членов которой превращают лактозу и другие углеводы в молочную кислоту.

Рисунок 2. Функции пробиотических препаратов В большинстве случаев они непатогенны, многие виды выполняют положительную роль в питании животных. На рисунке 2 показаны функции пробиотических препаратов. У животных они постоянно присутствуют в кишечнике, во влагалище, где являются симбионтами и составляют значительную часть микрофлоры кишечника. Многие виды принимают участие в разложении остатков растений. Они продуцируют молочную кислоту, а кислая среда препятствует росту многих патогенных бактерий и грибов.

Биологические свойства. Лечебный эффект препаратов, которые содержат лактобациллы, обусловлен антагонистическим действием лактобактерий по отношению к патогенным микроорганизмам, включая стафилококки, энтеропатогенные кишечные палочки, протеи, шигеллы, что определяет коррегирующее действие препарата при нарушениях бактериоценоза. Препараты лактобактерий улучшают обменные процессы, препятствуют формированию затяжных форм кишечных заболеваний, повышают неспецифическую резистентность организма. Лактобактерии реутери вырабатывают вещество реутерин, которое подавляет рост патогенной флоры в кишечнике и не влияет на рост собственной полезной флоры.

Штаммы молочнокислых бактерий используют в производстве медицинских препаратов — пробиотиков, предназначенных для восстановления нормальной микрофлоры кишечника и репродуктивной системы у женщин (после инфекционных заболеваний, антибиотикотерапии). Применение лактобактерий реутери у младенцев уменьшает выраженность колик, связанных с нарушениями микрофлоры в кишечнике.

Авторы поставили перед собой задачу создать комплексный пробиотический препарат для животных, позволяющий повысить эффективность его действия за счет содержания в нем адсорбента, а также расширить спектр лечебно-профилактических свойств препарата за счет включения в его состав микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам и позволяющих применять его совместно с антибиотикотерапией при тяжелых формах инфекции. Поставленная задача достигается тем, что комплексный пробиотический препарат для животных «БИФИТРИЛАК», содержащий микроорганизмы Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium bifidum, дополнительно содержит микроорганизмы Lactobacillus bulgaricus и Laсtobacillus fermentum, а также адсорбент, причем все микроорганизмы взяты в равных соотношениях с титром 0,5 · 109 жизнеспособных единиц на 1 г адсорбента, в качестве которого использован вермикулит.

Сущность изобретения заключается в расширении видового спектра микроорганизмов, применяемых в предлагаемом препарате, которые выделены из микрофлоры здоровых животных разных видов, и дополнительном введении адсорбента.

Использование такого комплекса видов микроорганизмов обеспечивает препарату высокую антагонистическую активность в отношении широкой группы болезнетворных микроорганизмов.

Авторы получили комплексный препарат-пробиотик, отличающийся тем, что в качестве консорциума лактобактерий он содержит штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus casei Сб в соотношении 4:1,0:1,0.

Бациллы — обширный род грамположительных палочковидных бактерий, образующих внутриклеточные споры. Большинство бацилл — почвенные сапрофиты. Некоторые бациллы вызывают болезни животных и человека, например сибирскую язву, токсикоинфекции (Bacillus cereus).

Бациллы являются аэробами или факультативными анаэробами, большинство представителей хемоорганогетеротрофы и растут на простых питательных средах. Некоторые виды способны к нитратредукции. Крупные и среднего размера прямые или слабоизогнутые палочки, способные к образованию устойчивых к неблагоприятным воздействиям эндоспор (экстремальным температурам, высушиванию, ионизирующим излучениям, химическим агентам), большинство видов подвижно и обладают жгутиками, расположенными перетрихиально, Bacillus anthracis образует капсулы. По методу Грама окрашиваются положительно. Недавние исследования выявили, что бактерии вида Bacillus subtilis способны к каннибализму во время споруляции путём продукции токсинов в окружающую среду и дальнейшему лизису клеток своего вида.

Авторы получили комплексный пробиотический препарат, включающий клетки пробиотических лактобактерий или бифидобактерий или их смеси и полимерную добавку, помещенные в кищечно-растворимую капсулу, отличающийся тем, что клетки пробиотических лактои бифидобактерий принадлежат к видам Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, а полимерная добавка, выполняющая функцию связующего и являющаяся полисахаридом. выбрана из группы амилопектин, крахмал восковидной кукурузы, нативный картофельный крахмал, растворимый картофельный крахмал, пшеничный крахмал, мальтодекстрин, их смеси, причем указанные компоненты входят в состав комплексного препарата в соотношении 108−10 12 клеток пробиотических лактои бифидобактерий на 0,01−1 г полимерной добавки.

Bacillus subtilis является важнейшим продуцентом амилаз и протеиназ и используется в производстве. Bacillus thuringiensis, а также синтезируемые этим видом бактерий токсины, используются в биозащите растений в качестве альтернативы синтетических инсектицидов.

Автор получил штамм бактерий В. Subtilis 12В-ДЕП в коллекции микроорганизмов, обладающий широким спектром антагонистической активности и устойчивостью к антибиотикам.

Преимуществами бацилл как хозяев для клонирования ДНК является высокая изученность генома многих видов, способность секретировать интактные белки в окружающую среду, нетребовательность большинства видов к питательной среде, высокая технологичность, а также возможность длительного хранения промышленных штаммов в виде высушенных спор. Поэтому для бацилл разработан ряд векторов, обеспечивающих перенос генетической информации и синтез необходимого продукта.

1.2 Постановка задачи исследования В настоящее время препараты и продукты, созданные с использованием молочнокислых бактерий и бацилл, рассматриваются в качестве основы функционального питания животных, и способствуют профилактике ряда заболеваний. Положительный эффект достигается путем введения живых клеток лактобактерий и бацилл непосредственно в организм животного (так называемые пробиотики), так и путем использования этих микроорганизмов в составе заквасок при получении продуктов питания в том числе на основе молока. Полноценные рационы обеспечивают нормальное течение физиологических функций организма животных и их высокую продуктивность. Недостаток хотя бы одного питательного вещества независимо от того, служит он источником или нет, отрицательно сказывается на продуктивности и состоянии здоровых коров.

Рацион можно сбалансировать не только за счет введения дефицитных компонентов, но и с помощью добавок, повышающих эффективность усвоения корма. Биологически активные препараты позволяют извлечь из него максимум питательных веществ и энергии, они нормализуют работу пищеварительной системы и таким образом помогают полностью обеспечить физиологические потребности животного при минимальных затратах на корм. К числу кормовых добавок, в наибольшей степени соответствующим особенностям пищеварительной системы жвачных животных, относятся пробиотики. Пробиотики можно скармливать животным, в качестве отдельной добавки.

Современные методы разведения скота сопряжены с колоссальным стрессом для молодых сельскохозяйственных животных. Молодое животное отлучают от матери вскоре после рождения, переводят на искусственное кормление, чтоб достичь быстрого увеличения веса за возможно более короткий срок. В это время у животных часто появляются энтериты и диарея — видимо, как результат дисбаланса кишечной микрофлоры. Этот дисбаланс возникает из-за того, что желудок не заселяется, нормальными непатогенными м.о., которые в естественных условиях разведения животных получают из материнского молока.

Поэтому более перспективным представляется поиск многофункциональных добавок, сочетающих в себе несколько механизмов воздействия на биоценозы пищеварительной системы животных.

Важной особенностью пробиотиков является способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, регулировать и стимулировать пищеваритльную систему. Поэтому разработка технологии получения пробиотиков на основе молочнокислых бактерий позволяет решить важную сельскохозяйственную задачу.

1.3 Экспериментальная часть

1.3.1. Методики проведения экспериментов Методика выделения молочнокислых бактерий Для выделения молочнокислых бактерий мы использовали обрат и фекалии теленка. Из сырого молока предварительно получали обрат, который затем автоклавировали. Посев проводили методом глубинного культивирования в предварительно подготовленных в сушильном шкафу чашках Петри. Открывая чашки Петри, разливали обрат. Микробиологическую петлю обжигали над пламенем спиртовки, затем, немного остудив, брали ею пробу фекалий теленка. Пробу предварительно подвергали разведению в дистиллированной воде, а затем делали посев на жидкую питательную среду. Далее чашки Петри помещали в термостат при температуре 37 °C. Время инкубирования — 7 суток. По истечении времени инкубации мы извлекли чашки Петри из термостата. Делали 3−4 таких посевов.

Постепенно лактобактерии, образуя молочную кислоту и получив оптимальные условия для развития, подавляют развитие гнилостных бактерий, содержащихся в фекалиях[36].

Методика приготовления препарата для микроскопирования Для приготовления препарата микробиологическую петлю обжигали над пламенем спиртовки, затем, немного остудив, брали ею культуру образовавшейся ацидофильной палочки и делали мазок на предметное стекло. Далее сушили на воздухе, фиксировали на пламени и красили метиленовым синим в течение 2−3 минут. Закрыли покровным стеклом и поместили препарат под микроскоп.

На рисунке 3 показаны этапы приготовления препарата для микроскопирования.

Рисунок 3. Приготовление препарата для микроскопирования Методика приготовления питательных сред Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 мин в 1—2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.

Этапы приготовления сред: 1) варка; 2) установление оптимальной величины рН; 3) осветление; 4) фильтрация; 5) разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

Установление рН сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рН используют потенциометр.

Разливают среды в пробирки (по 3—5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрицы и бутылки не более чем на 23 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100 °C, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно разли вают в стерильную посуду.

Разливают среды с помощью воронки, на конец которой* надета резиновая трубка с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы-пипетки и т. п.

Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и той ее приготовления.

Методика определения антагонистической активности Для определения антагонистической активности штаммов нами использован метод, основанный на способности биологически активных веществ микроорганизмов диффундировать в толщу агара и задерживать рост или убивать находящихся в зоне диффузии других микроорганизмов. В качестве тест — микробов использовали E. Сoli.

Для опыта готовили четыре чашки Петри со стерильным агаром на гидролизованном молоке (рН 7,3) и засевали их культурой штамма, антагонистические свойства которого изучаются. Температура культивирования — оптимальная для этого штамма. В первой чашке культуру выращивали 3 суток, во второй — 4 сутки, в третьей — 5 суток и в четвертой — 6 суток. К этому времени готовили четыре чашки Петри — три со стерильным МПА и одну с синтетической средой для культивирования микроорганизмов рода Baccillus.

На агар первой чашки засевали штамм E. coli, и Bacillus subtilis. Затем из чашек, где культивировался изучаемы штамм — антагонист, стерильным пробочным сверлом вырезали агаровые блоки диаметром 0,5 см и переносили на чашки с тест — микробами, располагая их колонии к агару.

После 24 ч инкубации делали выводы об антагонистической способности изучаемого штамма по диаметру зоны задержки роста тест — микроба.

Осуществляли методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде. На агаровую пластину с питательной средой микробиологической петлей наносят культуру по всему диаметру чашки Петри. Культуру инкубировали при температуре (37±1) °С в течение четырех суток. К выросшей культуре методом штриха высевали суточные тест-культуры, делая петлей полоски шириной 1 мм в направлении от штриха pocтa культуры штамма, не касаясь ее, перпендикулярно. Посевы выдерживали в термостате при температуре (37±1) °С в течение суток. Результат учитывали по величине зоны отсутствия роста тест-культур.

Методика определения чувствительности к антибиотикам Известно, что многие микроорганизмы могут адаптироваться практически к любым антибиотическим веществам, однако степень адаптации в разных случаях различная.

Для определения чувствительности микробов к антибиотикам существует ряд методов: метод последовательных разведений в жидкой питательной среде или питательном агаре, метод диффузии в агар (метод дисков, насыщенных антибиотиками) и ускоренные методы. Надежным и точным количественным методом является метод последовательных разведений антибиотиков в питательной среде в стандартных условиях опыта.

Чтобы изучить формирование колоний тест — микробов резистентных к антибиотическому веществу изучаемых штамм — антагонистов, использовали методику, предложенную Кобальским в 1961 году. В стерильные чашки Петри, поставленные наклонно, заливаем слой расплавленного питательного агара, смешанного с суспензией штамма. После застывания агара в горизонтально расположенную чашку наливали питательную среду, необходимую для развития микроба. Чашку выдерживали 48 ч для роста изучаемого штамма и диффузии в агар антибиотического вещества, выделяемого штамма. После этого поверхность агара засевали суспензией тест — микроба, чашку помещали в термостат при температуре, благоприятной для развития этого микроорганизма.

В области высокой концентрации антибиотического вещества, выделяемого изучаемым штаммом (наибольшая толщина нижнего слоя), вырастали только резистентные колонии.

Этот метод позволяет установить формирование резистентных колоний тест-микробов по отношению к антибиотическому веществу, выделяемому изучаемыми штаммами бактерий.

Устойчивость к антибиотикам изучали с помощью бумажных дисков, пропитанных различными антибиотиками.

1.3.2 Результаты эксперимента и их обсуждение Выделение молочнокислых бактерий Для выделения молочнокислых бактерий мы использовали обрат и фекалии теленка, отобранные в трех районах Южно-Казахстанской области: Енбекшинский, Сайрамский и Байдибекский. Также, учитывали возраст телят, при отборе фекальных масс. Далее по методике, указанной выше, выделяли молочнокислые бактерии и микроскопировали. На рисунке 4 показано поэтапное выделение молочнокислых бактерий из фекалиев телят.

Рисунок 4. Выделение молочнокислых бактерий Изучение морфологических и биохимических свойств штаммов микроорганизмов Анализ данных литературы показывает, что в настоящее время наиболее перспективными в качестве основы для разработки нового пробиотика могут быть штаммы бактерий рода Lactobacillus. Совокупность биологических свойств бактерий родов Lactobacillus и биологически активных веществ, продуцируемых ими, обеспечивает комплексное действие пробиотического препарата.

Для изучения и выбора активных штаммов лактобацилл исследовали культуры штаммов L. buchueri 2, L. plantarum FK20, L. ferrmentum 90T-C4, L. fermentum B-4916, L. acidophilus 1 EC, L. acidophilus B-2104, полученных из трех районов Южно-Казахстанской области.

Культурально — морфологические и физиолого-биохимические свойства выше указанных культур представлены в таблице 2.

Таблица 2 — Культурально-морфологические и физиолого-биохимиеские свойства бактерий рода Lactobacillus

Учитывая, что в состав экспериментального образца пробиотика были вкючены культуры штамма L. рlantarum FK20, приведем их исходные паспортные характеристики.

Высокой устойчивостью и ингибирующим фактором роста обладает штамм L. planlarum FK20.

Чем больше углеводов расщепляет микроорганизм, тем больше количество продуктов брожения всасывается из толстого кишечника в кровь и используется микроорганизмом. Отсутствие при этом образования газа предотвращает вспучивание.

Резюмируя результаты изучения биохимических свойств микроорганизмов, мы пришли к заключению, что L. buchneri 2 не может использоваться для изготовления пробиотика, поскольку обладает недостаточно высокой активностью кислотообразования, не развиваются в кислой среде и неустойчивы к фенолу.

L. fermentum 90Т-С4 не соответствует предъявленным требованиям, поскольку является низким кислотообразователем, неустойчив к желчи и не отличается широким спектром сахаролитических свойств.

Он обладает высокой активностью кислотообразования, устойчив к желчи и фенолу, сбраживают широкий спектр углеводов без образования газа, что необходимо для размножения в условиях желудочно — кишечного тракта.

Однако в борьбе с другими микроорганизмами (в том числе и с патогенными) за экологическую нишу недостаточно только этих качеств. Микроорганизмы пробиотического препарата могут успешно конкурировать за среду обитания, находясь не в содержимом просвете кишечника, а непосредственно фиксируясь на поверхности чувствительных к ним клеток микроорганизма.

Исходя из этого предположения, мы изучали способность микроорганизмов адгезироваться на клетках желудочно — кишечного тракта, то есть, способность распознавать чувствительные к ним клетки микроорганизма и прикрепляться к ним.

Критериями для отбора микроорганизмов, пригодных для изготовления пробиотиков, послужила активность кислотообразования и предельная кислотность сгустков, поскольку эти показатели свидетельствуют об интенсивности кислотообразования и количестве образуемой кислоты, губительно действующей на гнилостную микрофлору.

Изучаемые штаммы должны обладать высокой активностью кислотообразования. Оценку уровня кислообразования лактобактерий проводили титрометрическим методом при выращивании лактобацилл в мясо — пептоном бульоне. Результаты исследований по изучению уровня кислотообразования представлены в таблице 3.

L. fermentum B-4916 образует сгусток в молоке через 4−5 часов, однако предельная кислотность сгустка очень низкая и составляет 70°Т. Низкая кислотообразующая способность ацидофильной палочки — ценное свойство для Таблица 3 — Оценка уровня кислотообразования лактобактерий

изготовления молочных продуктов, поскольку сейчас в коллекциях представлены в основном ацидофильные палочки — сильные кислотообразователи, однако для изготовления биопрепарата — это негативный фактор.

Достаточно активным кислотообразователем является L. acidophilus B-2104, образующий сгусток в молоке через 8−12 часов.

L. plantarum FK20 свертывает молоко через 20−24 ч и 50−56 ч соответственно, кислотность сгустков не превышает 225°Т.

К микроорганизмам со средней активностью кислотообразования можно отнести L. fermentum 90T-C4, L. acidophilus B-2104, L. buchneri 2 образующие сгустки в течение 16−18 ч.

По результатам изучения морфологических и биохимических свойств высокой устойчивостью и ингибирующим фактором роста обладает штамм L. planlarum FK20. Также L. plantarum FK20 свертывает молоко через 20−24 ч и 50−56 ч соответственно, кислотность сгустков не превышает 225°Т. Анализируя полученные данные, мы определили, что наиболее полно предъявленным требованиям отвечает L. planlarum FK20.

Учитывая, что в состав экспериментального образца пробиотика были вкючены культуры штамма L. рlantarum 8Р — А3, приведем их исходные паспортные характеристики.

Бактерии штамма L. рlantarum FK20 микроскопически представляют собой грамположительные палочки, расположенные одиночно или в цепочках, размером от 1,0 до 8,4 мкм. На плотных питательных средах (MRS, капустном агаре) на 2 сутки культура образует мелкие ровные колонии белого цвета диаметром от 2 до 5 мм, выпуклые, с цельным краем, непрозрачные, без пигмента.

Оптимальные значения рН питательной среды составляют от 5,8 до 6,2. Культура устойчива при понижении кислотности среды. Оптимальная темтература роста — 37? С.

Культура штамма L. рlantarum FK20 развивается в мясопептонном бульоне с 6% содержанием хлорида натрия, ферментирует без образования газа глюкозу, рамнозу, сахарозу, галактозу, сорбит, мальтозу, лактозу и салицин. Восстанавливает лакмусовое молоко.

Штамм молочнокислых микроорганизмов, которые непосредственно использовали в исследованиях, поддерживали и сохраняли методом пересева в стерильное обезжиренное молоко каждые 10 дней. Между пересевами культуры хранили в холодильнике при +4 — +18 °С. Однако этот метод трудоемок и требует большого количества обезжиренного молока.

Более удобным методом хранения молочнокислых микроорганизмов является их хранение в пробирках с гидролизованным молоком (рН 7,2) при температуре 2−4 °С. В таких условиях все исследуемые культуры хранились в течение двух месяцев, практически не изменяя свои свойства.

Молочнокислые микроорганизмы длительное время до шести месяцев сократились следующим образом: культуру засевали уколом в полужидкий агар на гидролизованном молоке (0,75 агар). После термостатирования заливали тонким слоем стерильного вазелиного масла. Масло должно быть высокой вязкости и не содержать продуктов окисления и токсических веществ, слой масла должен на 1 см превышать края агара. Культура хранилась в холодильнике.

Опыты проводили с целью отбора по сумме признаков тех штаммов, которые могли бы размножаться в условиях желудочно — кишечного тракта и использоваться для изготовления пробиотика.

Важным критерием при отборе микроорганизмов для изготовления пробиотика является их устойчивость к различным ингибирующим веществам — натрия хлориду, желчи, действию которой они подвергаются в тонком отделе кишечника, фенолу, образующемуся в толстом отделе кишечника при гнилостном распаде белков. Биохимические свойства лактобактерий представлены в таблице 4. Как видно из таблицы 4, свойства исследуемых штаммов соответствуют биохимическим свойствам. Данные свидетельствуют о том, что в присутствии 0,4; фенола в среде не размножаются штаммы L. buchneri 2 и L. fermentum В-4916. К желчи неустойчивы — L. buchneri 2.

Для изучения и выбора активных штаммов бацилл исследовали культуры штаммов B. subtilis ТПИ-9, B. subtilis ТПИ-13, B. subtilis F7, B. licheniformis 31 полученных из музея кафедры «Биотехнология».

Культурально — морфологические и физиолого-биохимические свойства выше указанных культур представлены в таблице 5.

Таблица 4 — Биохимические свойства микроорганизмов рода Lactobacillus

Таблица 5 — Культурально-морфологические и физиолого-биохимиеские свойства бактерий рода Bacillus

Изучение антагонистических свойств штаммов L. plantarum FK20 и В. Subtilis F7

В связи с тем, что целью нашей работы являлось исследование микробиологических свойств комплексных пробиотических бактерий, для получения комплекса мы использовали штамм Вacillus Subtilis F7, полученный из музея кафедры «Биотехнология».

Высокая антагонистическая активность лактобактерий в отношении патогенных и условнопатогенных бактерий может быть вызвано не только продуцированием органических кислот, но и образованием антагонистических веществ. Во всех случаях изучаемые лактобактерии полностью подавляли рост и развития указанных тест-культур.

Защитные свойства лактобактерий во многом определяются их адгезивностью. Именно это свойство позволяет лактобактериям присутствовать в микрофлоре стенки кишечника, стать составной частью экологического барьера, блокиравать рецепторы клеток слизистых адгезинов патогенных микроорганизмов.

Успешная конкурентоспособность микроорганизмов на этапе колонизации биологических поверхностей обеспечивается не только их адгезивностью, но и выраженной антагонистической активностью.

Мы изучали анатгонистическую активность штаммов L. plantarum FK20 и В. Subtilis F7 по отношению к Е. соli.

Е. соli является представителем грамположительных бактерий. Этот микроорганизм чаще всего выделяется из кишечника животных, проявивших клинику гастроэнтерита или дисбактериоза и отстающих в росте, а также применяются в лабораторных исследованиях в случаях изыскания и изучения антибиотиков и их продуцентов.

В своих исследованиях мы не касались природы выделяемых антибиотических веществ и ограничились только качественной стороной способности исследуемых микроорганизмов подавлять развитие других видов.

На начальном этапе изучали антагонистические свойства бактерий с помощью штрихов, однако среда, пригодная для развития тест — микроба, оказалась непригодной для культивирования ацидофильной палочки и бифидобактерий.

Чтобы устранить этот недостаток, в дальнейшем использовали метод агаровых блочков.

Об антагонистической активности изучаемых микроорганизмов судили по диаметру воды задержания роста тест — микроба вокруг агаровых блочков. Метод агаровых блочков дал возможность использовать оптимальные среды и температуры культивирования для тест — микробов и микробов — антагонистов. Кроме того, благодаря этому методу, удалось проследить накопление антибиотика в процессе развития микроба — антагонист. В таблицах 5 отражены полученные результаты.

Таблица 6 — Угнетение роста тест — микробов штаммом L. plantarum FK20

Как видно из таблицы 5, выраженность антагонистической активности штамма FK20 зависит от возраста культуры и вида тест — микроба.

Наибольшее накопление антибиотического вещества происходило на шестые сутки культивирования. К его предельной концентрации в среде наиболее чувствительны Р. vulgaris и B. subtilis, зона задержки роста которых составила 20−22 мм в диаметре. Причем, уже в течение трех суток культивирования ацидофильной палочки в агаре накапливалось достаточное количество антибиотического вещества, губительно действующего на эти тест — микробы. Вокруг агарового блочка с трехдневной культурой штамм МD-1 зона задержки роста Р. vulgaris и B. subtilis составила 13−25 мм, вокруг 6-ти дневной 20−22 мм.

Менее чувствительным к антибиотическому веществу ацидофильной палочки оказался вид S. еnteritidis. Вокруг трехдневной культуры штамма МD-1 образовалась зона задержки его роста диаметром 7 мм, вокруг шестидневной — 18 мм.

Наибольшую устойчивость проявили клетки Е. соli. Трехдневная культура L. plantarum FK20 вообще не подавляла их развитие. При культивировании ацидофильной палочки в течение шести дней в агаре накапливалось достаточное количество антибиотического вещества для подавления Е. соli, однако диаметр задержки роста составлял 12 мм.

В результате установлено, что исследуемые штаммы не оказывают взаимоподавляющего действия друг на друга, поскольку вокруг агаровых блочков не было зон отсутствия роста микроорганизмов.

Таким образом, в опытах установлено, что штамм L. plantarum FK20 выделяет антибиотическое вещество или вещества, губительно действующие как на грамположительную, так и на грамотрицательную микрофлору. Результаты изучения антагонистической активности B. subtilis F7 отражены в таблице.

Таблица 7 — Угнетение роста тест — микробов штаммом B. subtilis F7

Изучение чувствительности к антибиотикам Используя методику, приведенную выше, изучали характер взаимоотношений между штаммами L. plantarum FK20 и В. subtilis F7 при их совместном культивировании на чашках Петри. Для этого использовали шестидневную агаровую культуру FK20 и пятидневную культуру F7 (момент наибольшей интенсивности продуцирования антибиотических веществ).

В результате установлено, что исследуемые штаммы не оказывают взаимоподавляющего действия друг на друга, поскольку вокруг агаровых блочков не было зон отсутствия роста микроорганизмов.

По-видимому, при культивировании в смешанной культуре происходит резкое снижение рН среды обитания за счет кислотообразования, свойственного L. plantarum. Это служит предпосылкой для развития В. subtilis, который способен расти только в кислой среде.

Известно, что многие микроорганизмы, вначале обладающие высокой чувствительностью к действию антибиотических веществ, затем сказываются устойчивыми к ним. А это крайне нежелательное явление при лечении животных антибиотиками и пробиотическими препаратами.

Для определения спектра действия антибиотиков на штамм L. plantarum FK20 и В. subtilis F7 мы использовали диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами антибиотиков. Об устойчивости судили по наличию или отсутствию зон задержки роста исследуемого штамма вокруг диска. Результаты отражены в таблице 6.

Как видно из таблицы 6, L. plantarum FK20 и В. subtilis F7 устойчив к пенициллину и его синтетическим аналогам. Оба штамма устойчивы к мономицину. L. plantarum FK20 и В. subtilis F7 устойчивы к нистатину.

Однако оба микроорганизма чувствительны к тетрациклину и антибиотикам тетрациклинного ряда, которые представляют опасность для представителей облигатной микрофлоры кишечника и способствуют развитию дисбактериальных состояний.

Кроме того, рост L. plantarum FK20 и В. subtilis F7 задерживается в присутствии левомицитина. Бифидобактерии не размножаются в присутствии нистатина.

В настоящее время с целью лечения и повышения продуктивности животных очень широко применяются антибиотики, поэтому информация о том, к каким антибиотикам чувствителен микроорганизм, который должен выполнять функции пробиотического препарата, представляется весьма полезной.

Таблица 8 — Устойчивость L. plantarum FK20 и В. subtilis F7 к различным антибиотикам

На заключительном этапе работы определяли методом серийных разделений чувствительность культуры штамма L. plantarum FK20 и В. subtilis F7 к антибиотикам. В работе использовали следующие препараты: пенициллин, ампициллин, оксациллин, тетрациклин, мономицин, гентамицин, стрептомицин, нистатин, левомицитин. В ходе эксперимента определили, что культуры штаммов устойчивы к пенициллину, ампициллину, мономицину, гентамицину, стрептомицину и нистатину.

Рисунок 6. Определение чувствительности к антибиотикам Изучение композиционного соотношения двух бактериальных культур При конструировании препарата из двух бактериальных культур необходимо правильно подобрать их композиционное соотношение.

Для оценки эффективности различных комбинаций изучаемых культур в препарате в качестве критерия использовали величину антагонистической активности, которую изучали методом отсроченного антагонизма и методом совместного культивирования с тест-культурами. В качестве тест-культур использовали S. sonnei 32, S. typhimurium 11, S. aureus 209 и C. albicans 690.

Культуру штамма В. Subtilis F7 выращивали на агаризованной среде Гаузе в течение 24 часов, культуру штамма L. plantarum FK 20 выращивали на питательной среде MRS в течение двух суток при температуре 37 °C. Состав сред представлен в таблице 7. Бактериальные культуры смывали физиологическим раствором и рассчитывали (по оптическому стандарту мутности) количество микробных клеток в 1 см-3 суспензии. Готовили ассоциации нативных микробных культур в разных количественных соотношениях для В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 соответственно (об.%): 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 80:20; 90:10. При использовании ассоциаций нативных культур (В. Subtilis F7 в концентрации 5,8*106 кл*см-3 и L. plantarum FK 20 — 10,4*106 кл*см-3) было отмечено подавление роста тест-культур во всех вариантах. Поэтому в дальнейшем исследовали образцы вариантов, разведенные в 10, 102, 103, 104 раз. При определении активности указанных вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20, разведенных в 10,102 раз в отношении тест-культур также происходило подавление их роста и развития. Оценивая образцы, разведенные в 103 раз, установили оптимальные соотношения вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 (таблицы 8,9).

Таблица 9 — Состав питательных сред Гаузе и MRS

В разведениях 104 раз отмечено подавление роста культуры штамма S. aureus 209.

В экспериментальной работе определили, что наиболее оптимальным сочетанием В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 является их соотношение 50:50 (в об.%). При такой пропорции бактерий регистрируется наиболее быстрая элиминация тест-культур.

Отсутствие роста культур S. sonnei, S. aureus было отмечено после 18 часов совместного культивирования с В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20, а культур S. typhimurium и C. albicans — после 24 часов выращивания.

При определении оптимальных комбинаций культур в препарате, кроме того, изучали их взаимное влияние на цитоадгезию в условиях смешанных популяций. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что бациллы не проявляют цитоадгезивных свойств и не подавляют цитоадгезивных свойств культуры штамма L. plantarum FK 20 (СПА был равен 4,6).

Таким образом, установлено, что оптимальным соотношением бактериальных культур В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 для получения нашего препарата является (в об.%) — 50:50 при количестве живых микробных клеток не менее 2*106кл*см-3 для В. Subtilis F7 и 5*106кл*см-3 для L. plantarum FK.

В дальнейшем определяли оптимальные условия глубинного культивирования выбранных штаммов, критерии оценки готовности нативных культур, порядка приготовления экспериментального образца препарата.

В экспериментах изучали возможность использования питательных сред для культивирования лактобактерий и бацилл. Несмотря на то, что в природе это довольно частые представители микрофлоры, их культивирование в искусственных средах сопряжено с рядом трудностей, так как они по потребностям в питательных веществах относятся к требовательным микроорганизмам и нуждаются в сложных органических соединениях азота, растyт на средах с подобранными смесями аминокислот, ферментативными гидролизатами мяса, казеина, различных сортов муки. Для удовлетворения питательных потребностей лактобацилл в отдельных видах аминокислот и витаминов в синтетические среды добавляют естественные экстракты (дрожжевой автолизат, печеночный и растительные экстракты). При правильном сбалансированном питании повышается лечебно-профилактическая ценность готовых препаратов, полученных из культур лактобацилл.

Основным показателем эффективности культивирования является определение количества жизнеспособных клеток в КЖ. Помимо этого, косвенно о готовности культуры можно судить по изменению микроскопической картины и значений рН. Перечисленные показатели являются достаточными для оценки готовности нативных культур и их целесообразно использовать для продолжительности культивирования.

Таблица 10 — Активность вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 в отношении тест-культур через 18 часов выращивания

Таблица 11 — Активность вариантов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20 в отношении тест-культур через 24 часа выращивания

В экспериментальной работе были апробированы пять полужидких питательных сред: капустная среда, среда на основе панкреатического гидролизата крови крупного рогатого скота, среда на основе молочной сыворотки и казеиново-дрожжевая среда. В таблице 10 представлены результаты культивирования культуры штамма L. plantarum FK 20 в выше указанных средах. К питательным средам добавляли 0,1% агар-агара или желатина. Прибавление этих веществ давало качественно равнозначные результаты в отношении роста и развития лактобактерий. Отметим, чтo применение агар-агара экономически более выгодно.

Выращивание проводили в статических условиях при температуре (37±1)°С. Посевная доза L. plantarum FK 20 составляла не менее 1,2*107кл*см-3.

Сравнение обобщенных данных результатов в таблице 9 показало, что наилучшие результаты были получены при использовании казеиново-дрожжевой среды и капустной среды.

При выращивании изучаемой культуры в средах на основе панкреатического гидролизата крови крупного рогатого скота и на основе молочной сыворотки концентрация клеток была невысокой.

Высокие ростовые качества казеиново-дрожжевой среды и капустной среды объясняются рациональным подбором питательных веществ.

При выращивании культуры штамма L. plantarum FK 20 в жидких питательных средах наблюдалась последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размножения бактериальных клеток.

Согласно данным, приведенным в таблице 10, при выращивании культуры на казеиновo-дрожжевой среде в интервале времени от 8 до 12 часов концентрация клеток лактобактерий достигает 1,12*1010кл*см-3, значение рН при этом составляло 4,52. Дальнейшее выращивание не целесообразно, так как происходило резкое снижение значений рН и концентрация клеток уменьшалась до 4,2 млрд. кл*см-3.

Показано, что после 8, 12 и 24 часов выращивания культуры па капустной среде в статических условиях количество клеток соответственно составляло 1,2 млрд. кл*см-3, 2,1 млрд. кл*см-3 и 7,8 млрд. кл*см-3, через 30 часов культивирования концентрация бактерий увеличилась до 10,2 млрд. кл*см-3. Значения величины рН при выращивании культуры в капустной среде в течение 30 часов изменялись от 6,28 по 4,32.

При изучении выращивания культуры L. plantarum FK 20 в жидких питательных средах в динамике определили, что в процессе культивирования лактобацилл важное значение имеет регуляция окислительно-восстановительного потенциала среды, и уровень накопления биомассы может быть повышен, коррекций величины рН и углеводного питания. Морфологические, культуральные свойства и антагонистическая активность молочнокислых бактерий, выращенных в различных питательных средах, не изменились.

Таблица 10 — Характеристика культуры штамма L. plantarum FK 20 при выращивании в жидких питательных средах в динамике

Для глубинного выращивания культуры штамма В. Subtilis F7 использовали жидкую питательную среду на основе гидролизата соевой муки с добавлением солей кальция хлорида, сульфатов магния и марганца, хлорида натрия и сульфата железа. Глюкозу и раствор кальция хлорида вносили непосредственно при посеве. Данная среда была отработана для штамма В. Subtilis F7.

Культуру выращивали в колбах на установке для выращивания бактерий при температуре (37±1)°С и 220 оборотах в минуту. Посевная доза В. Subtilis F7 составляла не менее 2,3*106кл*см-3. Определяли в динамике основные характеристики глубинных культур: концентрацию клеток и значение водородного показателя. Характеристика культуры штамма В. Subtilis F7, полученной при выращивании в жидкой питательной среде на основе гидролизата соевой муки представлена в таблице 11. Анализ данных, приведенных в таблице 11, показывает, что максимальное значение концентрации биомассы регистрировались на 24−30 часов роста культуры. Динамика роста бактерий В. Subtilis F7 характеризовалась закислением среды на 15 часов.

В дальнейшем после 21 часа выращивания культуры происходило увеличение значения величины рН, что соответствовало увеличению биомассы бактерий В. Subtilis F7 до значения 2,56 млрд. кл*см-3.

Таблица 11 — Характеристика культуры штамма В. Subtilis F7 при выращивании в жидкой среде на основе гидролизата соевой муки в динамике

Таким образом, на основании данных литературы и собственных экспериментальных исследований показано, что выращивание культуры штамма L. plantarum FK 20 в статических условиях в капустной или казеиново-дрожжевой среде обеспечивает выход биомассы, в среднем, в концентрации 10*109кл*см-3. При выращивании культуры В. Subtilis F7 в жидкой питательной среде на основе гидролизата соевой муки с использованием аэрации концентрация биомассы составляла 2,56*109кл*см-3. При выращивании культур штаммов L. plantarum FK 20 и В. Subtilis F7 глубинным способом их биологические свойства и специфическая активность не изменились.

1.4 Выводы и предложения для технологической части На основании приведенных данных следует заключить, что качество питательных сред и принятые условия глубинного выращивания антагонистически активных бактерий обеспечивают воспроизводимое получение культур микроорганизмов В. Subtilis F7 и L. plantarum FK 20, обладающих высокими биологическими свойствами.

Пробиотические препараты изготовляемые на основе молочнокислых бактерий желудочно-кишечного тракта, в отличие от химиотерапевтических средств, способствуют нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта и не вызывают вредных побочных явлений. Они могут использоваться в качестве биологических консервантов при заготовке сочных кормов, переработке плодов и овощей, в составе кормовых добавок и лечебнопрофилактических препаратов для молодняка сельскохозяйственных животных.

Таким образом, создание пробиотиков и их широкое применение являются сегодня стратегическим направлением в борьбе со многими инфекционными, а также некоторыми неинфекционными заболеваниями.

Микробные препараты (пробиотики) в животноводстве являются лечебно — профилактическими средствами в борьбе с бактериальными заболеваниями молодняка. Их применение способствует нормализации кишечной микрофлоры, улучшению пищеварения, появлению гнилостных процессов, что оказывается на повышении продуктивности животных, снижения себестоимости продукции и обеспечивает уменьшение случае заболеваний.

Пробиотики применяют для профилактики и лечения дисбактериозов различного происхождения, колибактериоза и сальмонеллеза, для повышения естественной резистентности организма, а также в качестве экологически чистых стимуляторов роста при откорме животных. Они выгодно отличаются от антибиотиков тем, что не оказывают побочного действия, не накапливаются в органах и тканях, не вызывают селекции резистентных вариантов у возбудителя кишечных заболеваний и не загрязняют окружающую среду.

В клинической практике многолетнее и широкое применение бактериальных препаратов при лечение и профилактики дисбактериозов доказало их применение и удовлетворительную эффективность.

2. Технологическая часть

2.1 Характеристика сырья, вспомогательных материалов, и их подготовка Для приготовления питательных сред необходимы следующие компоненты: соевая мука, капустный отвар, агар, пивное сусло, вода.

Соевая мука — мука, изготовленная из переработанных семян соевых бобов, шрота и жмыха.

Капустный отвар — водный раствор, полученный при варке капусты.

Агар (агар-агар) — продукт, получаемый из морских водорослей и используемый как уплотнитель сред в микробиол. и пищевой промышленности. Представляет собой желтовато-белый порошок или пластинки. Содержит около 1,5 — 4% минеральных солей, 10 — 20% воды и 70 — 80% полисахаридов, в составе к-рых выявлены Dи L-галактозы, 3,6-ангидро-галактозы, пентозы, D-глюкуроновая и пировиноградная к-ты.

Пивное сусло — водный раствор экстрактивных веществ растительного сырья или солода, предназначенный к сбраживанию.

Вода. Для технологических целей требуется питьевая вода (ГОСТ 2874−73).

Для приготовления питательных сред из водопровода или открытых водоемов после соответствующей обработки. Она должна быть биологически чистой, бесцветной, без вкуса и запаха, сухой остаток меньше 1 г/л, общая жесткость менее 7 мг экв/л, с содержанием вредных веществ менее (мг/л), свинец — 0,1, мышьяк — 0,05, железо — 1,5, цинк — 5, медь -3. Общее число м.о. в 1мл менее 100.

Для охлаждения требуется вода с возможно более низкой температурой (не выше 12°С) и отсутствием механических примесей. Вода с повышенным содержанием железа недопустима.

Для мойки оборудования и помещений вода должна быть биологически чистой.

Силиконовые пеногасители. Изготовляют на основе кремнийорганических соединений. При введении в силиконовые пеногасители органических радикалов С2Н5 или СН3 образуются этил или метилполисилоктаны, обладающие пеногосящим действием. Пеногасящая способность увеличивается с введением гидроксильных групп.

2.2 Выбор штамма микроорганизмов Для получения пробиотического препарата используют штамм бактерии Lactobacterium plantarum и Bacillus subtilis.

Lactobacterium plantarum — широко распространенный вид грамположительных анаэробных неспорообразующих молочнокислых бактерий. Вид Lactobacillus plantarum относится к роду Лактобактерии (или Лактобациллы, лат. Lactobacillus), который входит в семейство Lactobacillaceae, порядок Lactobacillales, класс Bacilli, тип Firmicutes, царство Бактерии. Lactobacillus plantarum растут при температуре от 15 до 45 °C. Оптимальной для роста температурой является 30 °C. При 45 °C рост очень мал или отсутствует вообще. Lactobacillus plantarum имеет один из самых крупных геномов в роде Lactobacillus.

Bacillus subtilis — вид грамположительных спорообразующих аэробных бактерий, представителей рода бациллы (Bacillus). Bacillus subtilis — один из наиболее хорошо изученных микроорганизмов. Название сенная палочка происходит из-за того, что ранее Bacillus subtilis изолировался исключительно из сенных отваров. Bacillus subtilis имеет вид бесцветной прямой палочки, размером примерно 0,7 мкм в толщину и 2—8 мкм в длину. Bacillus subtilis может размножаться делением и спорами. Иногда отдельные Bacillus subtilis, после поперечного деления, остаются соединенными в нити. Bacillus subtilis (сенная палочка), благодаря продуцируемым антибиотикам и способности закислять среду обитания, является антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, таких как сальмонелла, протей, стафилококки, стрептококки, дрожжевые грибки; продуцируют ферменты, удаляющие продукты гнилостного распада тканей; синтезируют аминокислоты, витамины и иммунноактивные факторы.

2.3 Разработка технологического режима и схема производства Для разработки схемы производства необходимо в первую очередь обосновать все необходимые стадии производства.

В лаборатории, из пробирки с чистой культурой пересеиваем в три пробирки с твердой питательной средой. По мере роста из трех пробирок происходит пересев в три колбы на 50 мл, уже с жидкой питательной средой, культивирование происходит на качалке. Затем биомасса переносится в колбы на 1 л и из них в бутыли на 10 л, которые аэрируются стерильным воздухом. Биомасса, содержащаяся в бутылях, являются посевным материалом.

Подготовка питательной среды. Для осуществления метаболизма, т. е роста, размножения и накопления м.о. используется питательными средами, которые должны содержать все необходимые питательные вещества. Питательные среды должны быть абсолютно стерильными для этого существует стадия стерилизации питательной среды, так как производство непрерывное, то и стерилизация должна происходить непрерывно. В стерилизационной колонне среда нагревается паром до температуры 135 — 140 °C в течение 3 -10 с. Затем выдерживаются до 1 мин. В выдерживателе и охлаждается водой в теплообменнике — холодильнике. Непрерывная стерилизация экономична во времени, обеспечивает высокое качество стерилизации, меньший расход пара, а так же возможна автоматизация.

1 — сборник; 2, 4 — дозаторы; 3 — стерилизатор пеиогасителя; 6 — висциновый фильтр для очистки воздуха от механических взвешенных примесей; 7 — турбокомпрессор для сжатия воздуха до 0,03 МПа и нагревания его до 180−240 °С; 8 — трубчатый холодильник; 9 — вла-гоотделитель; 10 — головной фильтр; 11 — кожухотрубный теплообменник для подогрева воздуха; 12, 13 — фильтры тонкой очистки воздуха; 14 — смеситель для приготовления питательной среды; 15 — нагревательная колонна; 16 — трубчатый выдерживатель;.17 — теплообменник типа «труба в трубе»; 18 — посевной аппарат; 19 — ферментатор; 20 — сборник культуральной жидкости; 21 — сепаратор-разделитель типа АСЭ-Б; 22 — сборник пасты препарата; 23 — напорный сборник; 24 — воздушный фильтр; 25 — паровой калорифер; 26 — распылительная сушилка; 27 — вентилятор; 28 -циклоны; 29 — скруббер для очистки отработавшего воздуха; 30, 38 — шнековые разделители; 31 -сборник сухого порошка; 32 — автовесы; 33 — шнековый смеситель; 34 — сборник каолина; 35 — бункер промежуточный; 36 — вибрационная мельница; 37 — смеситель препарата с наполнителем; 39 -бункер готового препарата.

Рисунок 7. Технологическая схема производства пробиотического препарата

Подготовка стерилизации воздуха. Воздух, поступающий в ферментер должен быть абсолютно стерильным. Ни один отдельный способ очистки атмосферного воздуха не является полностью эффективным, поэтому используют комплексную очистку воздуха. Забор воздуха происходит через специальные шахты высотой 8−10 м, затем воздух поступает на масляный фильтр. Далее воздух сжимается до 140−160 °С, за счет выделившийся теплоты адиабатического сжатия. В холодильнике происходит охлаждение водой воздуха, при этом из него выделяется влага, которая отделяется во влагоотделителе. Окончательная очистка происходит на головных фильтрах, которые установлены для каждого ферментера.

Процесс ферментации. Культивирование проводят в биореакторах (ферментерах). Сначала в МИН объемом 0,5 м³, затем в БИН на 0,75 м³ и основной ферментер объемом 1 м³

Затем в сборнике щелочи 1 через дозатор 2 подается раствор щелочи в ферментатор 19. Пеногаситель загружается в стерилизатор 3 и с помощью дозатора 4 подается в смеситель для приготовления питательной среды 14 и в ферментер 19. Посевной материал через инокулятор 5 поступает в посевной аппарат 18, а затем в ферментатор.

Воздух через висциловый фильтр 6 поступает в турбокомпрессор для сжатия воздуха до 0,03 МПА и нагревания его до 180 — 240 °C, затем для охлаждения в трубчатый холодильник 8 и через влагоотделитель 9 в головной фильтр 10, затем в кожухоотрубный теплообменник для подогрева. Далее воздух поступает в фильтры тонкой очистки воздуха 12, 13, а затем в посевной аппарат и в ферментатор. Соли, витамины, молочная сыворотка поступают в смеситель для приготовления питательной среды и через нагревательную колонку 15 в трубчатый выдерживатель 16, затем в теплообменник типа «труба в трубе» и далее в посевной аппарат. Из ферментатора КЖ поступает в сборник культуральной жидкости 20 и через сепаратор — разделитель типа АСЭ — Б 21 поступает в сборник пасты препарата 22. Далее паста поступает в напорный сборник 23 и затем в распылительную сушилку 26 и через вентилятор 27 в циклоны. С циклонов выходит готовый продукт, а также воздух который поступает в скруббер для очистки 29. В распылительную сушилку воздух подается через воздушный фильтр 24 паровой калорифер[46−47].

2.4 Выбор основного и вспомогательного оборудования

Ферментеры, или биореакторы, представляют собой камеры, в которых в жидкой или на твердой среде выращивают микроорганизмы. Процесс, происходящий в ферментере, называется ферментацией. Термин ферментация первоначально применялся только к анаэробным процессам, однако сейчас он используется более широко и включает все процессы, как аэробные, так и анаэробные. На рис. 12.16 изображен типичный ферментер. Это довольно сложное техническое сооружение, поэтому необходимо потратить некоторое время для изучения его устройства. Не забывайте также о проблемах, возникающих при расширении масштабов производства, которые были перечислены в предыдущем разделе. Содержимое ферментеров во время работы, как правило, тем или иным способом перемешивается. Например, при производстве белка одноклеточных прутина компанией IC1 перемешивание достигается с помощью воздуха, подаваемого с высокой скоростью со дна сосуда[48].

Для культивирования используется ферментер с пневматическим перемешиванием и аэрированием среды. Конструктивно такой ферментер внешне аналогичен ферментеру с механическим перемешиванием, но в нем отсутствуют механические перемешивающие устройства. Аэрирующим устройством является диффузор, выполняемый в виде цилиндра с раструбом у основания, вмонтированный внутри ферментера. Аэратор смонтирован по осевой линии аппарата.

Рисунок 8. Конструкция ферментера Воздух под давлением с помощью направляющих лопаток вводится в аэратор по касательной к окружной розетке, за счет чего придается вихревое движение воздушно — жидкостной эмульсии. Эмульсия непрерывно циркулирует по внутреннему замкнутому контуру через верхние кромки цилиндра, кольцевое пространство между внутренней стенкой аппарата и внешней стенкой аппарата, а затем вновь поднимается вверх через раструб. Вследствие создаваемого внутреннего циркуляционного контура происходит интенсивное перемешивание и аэрирование. С целью более эффективно отвоза физиологического типа помимо секционной многоярусной рубашки предусмотрена дополнительная поверхность охлаждения диффузора.

Данная конструкция ферментера рассчитана для работы под избыточным давлением.

Для стерилизации питательной среды используется змеевиковый теплообменник, внутрь которого подается питательная среда, во внешнюю трубу — пар.

Змеевиковый теплообменник представляет собой трубу, свернутую по определенному профилю. Чаще всего — это форма спирали (рис. 9); иногда в спираль сворачиваются 2 — 3 трубки, по которым параллельно проходит обычно горячий теплоноситель. Второй теплоноситель (чаще — нагреваемый) заполняет емкость, в которой и находится змеевик. Теплоноситель II может нагреваться либо в режиме непрерывного протока через аппарат, либо периодически. В таком погружном теплообменнике может устанавливаться перемешивающее устройство, повышающее интенсивность теплоотдачи от наружной поверхности трубки к внешнему теплоносителю. В отсутствие принудительного перемешивания наружная теплоотдача соответствует малоинтенсивной естественной гравитационной конвекции.

Рисунок 9. Змеевиковый теплообменник Для охлаждения — теплообменник типа «труба в трубе». Устройство, которого заключается в том, что по внутренней трубе подается питательная среда, во внешнюю трубу хладагент — вода.

Теплообменники типа «труба в трубе». Теплообменный элемент такого аппарата показан на рисунке 10. Отдельные элементы соединены между собой патрубками и калачами, образуя цельный аппарат необходимого размера. Эти теплообменники находят себе применение при небольших расходах теплоносителей и при высоких давлениях.

Отделение биомассы от КЖ происходит в сепараторе, который представляет собой барабан, внутри которого находится конические тарелки.

Сепаратор — аппарат, производящий разделение продукта на фракции с разными характеристиками (рис. 11).

В процессе работы любого сепаратора не происходит изменения химического состава разделяемых веществ. Качества, отличающие продукты сепарации, не обязательно должны совпадать с признаками, по которым разделяют смесь в сепараторах. В работе сепаратора принимает участие множество отдельных мелких частиц, среди которых встречаются частицы с промежуточными свойствами по отношению к необходимым признакам. Из исходной смеси после промышленных сепараций не могут получиться абсолютно чистые фракции разделяемых компонентов, только продукты с преобладающим их содержанием.

Рисунок 10. Теплообменник труба в трубе Рисунок 11. Сепаратор

2.5 Характеристика готовой продукции

Готовый препарат представляет чистую культуру микроорганизмов: Lactobacterium plantarum и Bacillus subtilis.

Может быть в виде пасты или в сухом виде с влажностью 10%, от белого до светло — серого цвета с характерными кисломолочным привкусом и запахом.

Препарат обладает следующими свойствами:

— микроорганизмы выделяют молочную кислоту, что блокирует развитие патогенной микрофлоры в кишечнике животных;

— регулирует метаболические процессы животных;

— высокая антагоническая активность по отношению к Е. Соli;

— оказывает профилактическое действие на организм животного;

— лечение диаррейных заболеваний;

— стимуляция роста молодых животных.

2.6 Технологические расчеты Исходные данные:

1. Продуцент — Lactobacterium plantarum и Bacillus subtilis.

2. Р — 250 т в год

3. Vф-ра — 63 м³, Кзап — 0,6

4. Состав среды для культивирования:

Сухое обезжиренное молоко — 50%

МgSO4*5H2O — 0.25%

MnSO4*5H2O — 0.03%

CaCl2*5H2O — 0.44%

FeSO4*7H2O — 0.001%

CuSO4 * 5H2O — 0.001%

CaCl2 -1%

Азот общий — 0,06%

Азот аминный — 0,2%

Глюкоза — 10%

Эмульсия пеногашения — 0,03%

Вода водопроводная — до 100%

5. Vпос.мат. — 10% Vпит. среды.

6. Gвозд — 50 м3/м3 час

7. фкульт — 30 часа, t — 36 0C

8. ОРВнач — 50 кг/м3, ОРВкон — 5 кг/м3.

9. Унос к.ж. из ферментёра — 10%

10.Потери на стадии сепарации — 2%

11.Потери на стадии сушки — 3%

12.Общий брак по всем стадиям — 5%

13.W-8%

Заключение

В работе были использованы современные биохимические, микробиологические, методы исследования:

— определение антимикробной активности методом диффузии в агар, определение резистентности микроорганизмов к антибиотикам — методом стандартных дисков, пропитанных антибиотиками;

— определение численности микроорганизмов проводили путем ряда последовательных разведений, культивирование микроорганизмов на различных по составу питательных средах;

— электронно-микроскопические исследования, выделение и разделение антибиотических комплексов колоночной и тонкослойной хроматографией.

Все практические работы по исследованию проводились на кафедре «Биотехнология» Химико — технологического факультета Южно-Казахстанского Государственного университета им. М. Ауэзова в микробиологической лаборатории 122 корпуса А.

Практическая база написания дипломной работы.

Практическая база оснащена современным оборудованием и приспособлена для проведения исследовательских работ. Основная часть дипломной работы проведена в микробиологической лаборатории кафедры «Биотехнология» ЮКГУ им. М.Ауезова.

Апробация и публикации результатов.

Основные положения и отдельные этапы дипломной работы докладывались:

— на пленарном и секционном заседаниях 17-ой студенческой научной конференции по естественным, техническим, социально-гуманитарным наукам: «Казахстанский путь — 2050: Единая цель, единые интересы, единое будущее», Южно-Казахстанского Государственного университета им. М. Ауэзова, проходившее с 8 по 10 апреля 2014 г. За выступление получен диплом I категории;

— на конкурсе инновационных идей и проектов, организатором которого выступило ТОО «Шымкент инновация». Конкурс проходил на базе Южно-Казахстанского государственного университета им. М. Ауэзова 19 декабря 2013 г. За выступление было получено благодарственное письмо;

— на первой международной научной конференции студентов и молодых ученых под названием «Будущее развития биологии, медицины и фармации», проходившей на базе Южно-Казахстанской Государственной фармацевтической академии 10−11 декабря 2013 г. За выступление получен сертификат участника конференции;

— на 17-ой студенческой научной конференции, посвященной 70-летию ЮжноКазахстанского государственного университета им. м.Ауэзова. За выступление получен диплом за I место.

Публикации результатов работы:

— в трудах 17-ой студенческой научной конференции по естественным, техническим, социально-гуманитарным наукам: «Казахстанский путь — 2050: Единая цель, единые интересы, единое будущее», Южно-Казахстанского Государственного университета им. М. Ауэзова, том I, стр. 59−60;

— в Республиканском научном журнале «Вестник», том III, стр. 86−89.

Список использованных источников

1 Biology-Online.org http://www.biology-online.org/dictionary/probiosis

2 Шевченко Ю. Л. Роль современных факторов во взаимодействии человека и микроорганизмов. Значение национального здравоохранения в профилактике и лечении инфекционных болезней // Журн, микробиол. — 2000. — № 6. — С.З.

3 Бойко А. В. Этнологическая структура острых кишечных инфекций, вызванных не холерными вибрионами, в дельте Волги //Журн. микробиол. — 2000. — № 1. — С. 15−17.

4 Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь декабрь 3997 года // Эпидемиология и инфекционные болезни — 1993. -№ 3. — С. 63−64.

5 Инфекционная заболеваемость в РК за январь — декабрь 1999 года // Эпидемиология и инфекционные болезни, — 2000. — № 4. — С. 55.

6 Фролочкииа Т. Н. Вспышки под надзором // Фармацевтический вестник. -2002.-№ 23,-С.22.

7 Щербаков П. Н. Профилактика и лечение при желудочно-кишечных и респираторных болезнях телят // Ветеринария -2002. -№ 3, — С. 15.

8 Субботин В. В. Влияние бифацидобактерина на кишечную микрофлору поросят // Ветеринария — 1998 — № 5, — С. 24,

9 Раицкая В. И. Новые препараты для лечения желудочно-кишечных болезней телят. //Ветеринария -2001. -№ 5. — С.4.

10 Новые пробиотические препараты ветеринарного назначения: Автореф. дисс.докт. биол. наук /Малик Н.И. — М., 2002. — 200с.

11 Джупина С. И. Факторные инфекционные болезни животных. // Ветеринария -2001. -№ 3.-С.б.

12 Тараканов Б. В., Николичева Т. А. Пробиотический потенциал Lactobacillus саsei при выращивании телят//Ветеринария — 2001 -№ 3, — С. 46.

13 Автореф. Дис. На соиск. Младзневская Ю.А.- СПГ: С.-Петербург.гос. хим.-фармац. Акад., 2005. С. 21

14 Королева О. В., Енальева Л. В., Рябцева С. В. Стратегия развития АПК технологии, экономики, переработка, управление: Материалы Международной научно-практической конференции, пос. Персионовский, 2−8 февр., 2004.пос. Персионовский (Рост. обл) 2004, С.74−75.

15 Литусов Н. В., Поберий И. А. и др // Перспективы использования эубиотика «Биоспорин» в практике здравоохранения и военномедицинской службы — Екатеринбург. — 1997.-С.6−10.

16 Курнецова О. С.- Вос.-Сиб. гос технологич. институт Улан-Удэ. 2005. -С19.

17 Шендеров Н. А., Нормальная микрофлора кишечника и некоторые вопросы микроэкологической токсикологии // Антибиотики и медицинская биотехнология. -1997.-№ 3.-С 164−170.

18 Гончарова Г. И., Дорофейчук В. Г., Смолянекая А. З., Соколова К. Я. Микробная экология кишечника в норме и при патологии // Антибиотики и химиотерапия. 1999.-34, № 6.С. 462−466.

19 Бароновский А. Ю., Кондрашина Э. А, Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. — С.б., 2000.

20 Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. — М, 1998. — 180с.

21 Коршунов В. М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника // Журн. микробиол. — 1995. -№ 3. С. 48−55.

22 Микроэкологические нарушения при экспериментально и дисбактериозен роль бактерицидных систем клеток организма хозяина: Автореф. дисс. канд. биол. наук / Патрушева Е. В. — Волгоград., 2000. — 185с.

23 Петровская В. Г., Марко О. П., Микрофлора человека в норме и патологии. — М., Медицина, 1996. — 165с.

24 Пинсгин Б. В., Коршунов В. М., Мальцев В. П. Дисбактериозы кишечника. — М. Наука, 1994. — 170с.

25 Эпидемиология и инфекционные болезни. — 1997, — № 5 — С. 7.

26 Гончарова Г. И., Семенова Л. П., Лянная A.M. и др. Бифидофлора человека, ее нормализующие и защитные функции // Антибиотики и медицинская биотехнология. — 1997.-№ 3

27 Ruchim M.A., Makino D, Volatile Fatty Acids degradation By Human Fecal Suspensions // Gastroenterol. — 1994. — Vol.86,

28 Бароновский А. Ю., Кондрашина Э. А, Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. — М: Наука, 2000. — 200с.

29 Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. — М, 1998.

30 Коршунов В. М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника // Журн. микробиол. — 1995. -№ 3. С. 48−55.

31 Патент № 2 119 796. Авторы: Дзявго Л. А.; Маслов Д. В.; Панкратова Т. М.; Ширяев С. П. -С 7−10.

32 Патент № 2 317 089. Авторы: Молокеев Алексей Владимирович, Ильина Рома Мирославовна, Яцентюк Раиса Михайловна, Молокеева Наталья Валентиновна. — С. 4−7.

33 Патент № 2 491 079. Авторы: Яруллина Дина Рашидовна, Дамшкалн Лилия Григорьевна, Михеева Регина Олеговна, Ильинская Ольга Николаевна, Лозинский Владимир Иосифович. — С. 16.

34 Патент № 2 781 909. Авторы: Яцентюк Раиса Михайловна, Ильинская Ольга Николаевна. — С.19.

35 Микроэкологические нарушения при экспериментально дисбактериозе и роль бактериоцидных систем клеток организма хозяина: Авторск. дисс. канд. биол. наук / Патрушева Е. В. — Волгоград., 2000

36 Петровская В. Г., Марко О. П, Микрофлора человека в норме и патологии. -М., Медицина, 1996. — 250с.

37 Пинсгин Б. В., Коршунов В. М., Мальцев В. П. Дисбактериозы кишечника. — М. Наука, 1994. — 230с.

38 Эпидемиология и инфекционные болезни. — 1997, — № 5 — С. 7.

39 Гончарова Г. И., Семенова Л. П., Лянная A.M. и др. Бифидофлора человека, ее нормализующие и защитные функции // Антибиотики и медицинская биотехнология. — 1997.-№ 3 — С 179.

40 Кудрявцев В. А. Сафронова Л.А., Осадчая А. И. и др. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма // Микробиол. журн. — 1999. -№ 2-С.46−55Г