Энергообеспечение и биоэнергетические характеристики митохондрий печени миноги (Lampetra fluviatilis) и лягушки (Rana temporaria) в периоды метаболической депрессии и активности

Актуальность проблемы.

Метаболическая депрессия является неотъемлемой частью жизненных циклов многих животных и встречается у большинства видов беспозвоночных и всех классов позвоночных. Это явление характеризуется подавлением базальной метаболической скорости на 50 — 100% и длится до тех пор, пока организм в состоянии противостоять стрессам окружающей среды. Современные методы молекулярной биологии широко используются для выяснения механизмов регуляции метаболической депрессии. Но до настоящего времени ни молекулярные механизмы, ни процессы, связанные с контролем гипометаболизма, до конца не изучены, и фундаментальное явление метаболической депрессии остается как с биохимической, так и с физиологической точек зрения слабо освещенным. Тем не менее, за последнее десятилетие в исследовании этого феномена сделан определенный прогресс, результаты которого будут полезны для дальнейшего осмысления поставленной проблемы.

Анализ существующих фактов позволяет заключить, что центром регуляции интенсивности биоэнергетических процессов в клетке, прежде всего, следует считать митохондрии. Долгое время полагали, что основной функцией митохондрий является синтез АТФ. Поэтому наибольшее внимание было уделено регуляции сопряженного с синтезом АТФ дыхания митохондрий (Bohnensack et al., 1982; Erecinska and Wilson, 1982; Balaban, 1990). Меньшее значение придавали процессу, при котором потребление кислорода не сопряжено с синтезом АТФ. Этот процесс связан с утечкой протонов через специфические белки (АТФ/АДФ — антипортер, аспартат/глутаматный переносчик, белки-разобщители семейства UCP) внутренней мембраны митохондрий (Skulachev, 1998аStuart et al., 2001). Самым поразительным физиологическим свойством протонной утечки является участие в защите от повреждающего действия активных форм кислорода, образующихся в митохондриях (Skulachev, 1998аKowaltowski et al., 2001). В митохондриях пойкилотермных животных скорость протонной утечки обнаруживает сезонную динамику (St-Pierre et al., 2000аBishop et al., 2002; Boutilier and St-Pierre, 2002). Кроме того, в конце 90-х годов стало ясно, что митохондрии играют ключевую роль в развитии и регуляции апоптоза и некроза в клетке (Skulachev, 1998b- 2000, 2002, Kim et al., 2003aKim et al., 2003b), открывая на мембранах неспецифическую пору (mitochondrial permeability transition pore), проницаемую для широкого спектра органических и неорганических веществ. Однако, выбор пути гибели клетки определяется ее энергосостоянием, то есть, эффективностью работы системы окислительного фосфорилирования и соотношением АТФ/АДФ. d В последнее время появилось множество доказательств, что любая патология, связанная с энергетической депрессией, сопровождается, прежде всего, изменениями свойств митохондрий. Низкие концентрации адениновых нуклеотидов, повышенная проницаемость внутренней мембраны, супрессия активности электрон-транспортной цепи и системы окислительного фосфорилирования способствуют развитию многих заболеваний у высших животных, в том числе человека. Но парадоксален и примечателен тот факт, что для низших позвоночных животных эти изменения оказываются вполне приемлемыми и даже полезными в определенные фазы их жизненного цикла. Это подтверждает предположение JI. A Орбели о том, что в экстремальных условиях и при патологии высшие позвоночные, в том числе и человек, используют для выживания эволюционно более древние механизмы, изучению которых и посвящена данная работа.

Объектами наших исследований были минога речная {Lampetra fluviatilis) и лягушка травяная (Rana temporaria). Минога — представитель класса Круглоротых, наиболее древнее из ныне живущих позвоночных животных, обладает своеобразным жизненным циклом. После активного морского периода, в течение которого миноги питаются, паразитируя на * разнообразных костистых рыбах, начинается анадромная преднерестовая миграция, которая заканчивается выметом половых продуктов и смертью. Миноги моноцикличны. Мигранты, пришедшие в реку осенью, проводят в ней всю зиму, не питаясь. Известно, что в гепатоцитах в этот период наблюдается обратимая метаболическая супрессия (Savina and Gamper, 1998). Однако, молекулярные механизмы этого явления на уровне митохондрий детально не изучены.

В отличие от миног представители класса Амфибий размножаются многократно. Метаболическая депрессия у лягушек наблюдается в период гибернации и связана, главным образом, с гипотермией и гипоксией, ф Для изучения особенностей энергообеспечения митохондрий указанных пойкилотермных животных в работе были проанализированы сезонные изменения в содержании основных энергетических субстратов в плазме крови.

Ряд энергетических характеристик митохондрий печени пойкилотермных позвоночных мы сопоставили с аналогичными характеристиками митохондрий печени гомойотермного позвоночного — мыши (линия ASN).

Цели и задачи.

Целью работы было.

Изучение особенностей энергетического метаболизма пойкилотермных позвоночных на примере миноги речной и лягушки травяной в периоды метаболической депрессии и активности.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать в плазме крови миног и лягушек содержание основных метаболических субстратов: глюкозы, липидов и свободных аминокислот.

2. Оценить биоэнергетические параметры митохондрий печени: скорости дыхания и фосфорилирования, содержание адениновх нуклеотидов в митохондриях и в самой ткани.

3. Исследовать участие белков — переносчиков анионов внутренней митохондриальной мембраны (АТФ/АДФ — и аспартат/глутаматного антипортеров) в процессе разобщения дыхания и фосфорилирования.

4. Исследовать проницаемость мембран митохондрий в солевой и в неионизированной средах инкубации.

5. Изучить действие индукторов (Са, Pj, лаурат) и ингибиторов поры.

Л I.

CsA, ЭГТА, ДТТ, Mg, АДФ, БСА, гепарин) на проницаемость мембран митохондрий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В период метаболической депрессии содержание глюкозы и липидов в плазме крови миног и лягушек существенно снижаетсяколичество свободных аминокислот в плазме миног увеличивается, а в плазме лягушек — уменьшается.

2. Биоэнергетические параметры митохондрий печени миног и лягушек обнаруживают сезонную изменчивость. Скорости дыхания и фосфорилирования супрессированы в состоянии гипометаболизма и восстанавливаются при выходе из этого состояния.

3. Содержание АТФ в митохондриях и в ткани печени миног и лягушек снижается в период метаболической депрессии и увеличивается в состоянии метаболической активности.

4. В митохондриях пойкилотермных животных «утечка» протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану обусловлена участием АТФ/АДФ — и аспартат/глутаматного антипортеров.

5. Изолированные митохондрии печени миног высокопроницаемы для ионов в солевых средах в период метаболической депрессии вследствие открытия неселективной поры, чувствительной к действию ингибиторов: CsA, ЭГТА, Mg2 АДФ, БСА, гепарин.

6. В неионизированной изоосмотичной среде инкубации индукция поры в митохондриях печени возможна в присутствии Са, Pj и лаурата. Действие лаурата, как индуктора, зависит от энергосостояния митохондрий. При низкой энергизации митохондрий лаурат снижает пороиндуцирующее действие Са21″ и Pj. В высокоэнергизованных митохондриях лаурат усиливает действие Са и Р-.

Научная новизна.

1. Проведен сезонный анализ содержания в плазме крови миног и лягушек глюкозы, липидов и свободных аминокислот.

2. Продемонстрирована сезонная динамика биоэнергетических параметров митохондрий печени у исследованных видов животных.

3. Исследовано содержание адениновых нуклеотидов в печени лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

4. Установлено участие АТФ/АДФ — антипортера и аспартат/глутаматного переносчика в разобщении окислительного фосфорилирования в митохондриях печени миног и лягушек.

5. Исследована мембранная проницаемость митохондрий печени миног и лягушек в периоды метаболической депрессии и активности.

Таким образом, изучены некоторые новые молекулярные механизмы, лежащие в основе метаболической депрессии гепатоцитов пойкилотермных позвоночных.

Теоретическая и практическая значимость.

Работа имеет, прежде всего, фундаментальное значение для эволюционной биохимии и биоэнергетики. Полученные данные дополняют сведения о функционировании и регуляции энергетического метаболизма у эктотермных животных. Кроме этого установлена важная роль митохондрий в развитии феномена обратимой метаболической депрессии. Результаты исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции энергетики митохондрий, а также в прикладных целях. Обнаруженная нами на пойкилотермных животных митохондриальная дисфункция, проявляющаяся в снижении синтеза АТФ, в снижении эффективности системы субстратного окисления, супрессии электрон-транспортной цепи, индукции неспецифической проницаемости мембран митохондрий, является патологичной для млекопитающих. Поэтому исследование молекулярных механизмов метаболической депрессии у пойкилотермных позвоночных животных в дальнейшем может помочь в разработке новых терапевтических подходов в лечении заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией.

Апробация работы.

Результаты исследования докладывались на Третьем Съезде Биохимического Общества в г. Санкт-Петербург, 2002; Всероссийском симпозиуме «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем» в г. Иваново, 2002; Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» в г. Пущино, 2003; Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы в г. Москва, 2004; IX зимней школе «Биоинформатика: от молекулярных механизмов к функциональным системам» на зоологической станции Твярминне, Финляндия, 2005. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 статей, одна из которых в рецензируемом журнале, и 8 тезисов, четыре из которых опубликованы в иностранных изданиях. Структура диссертации.

Диссертация состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материал и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы, Список литературы (277 источников). Работа иллюстрирована 21 таблицей и 25 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В данном разделе обобщаются современные представления об особенностях биоэнергетики пойкилотермных животных в периоды гипометаболизма. Обзор начинается с описания жизненных циклов исследуемых объектов и подробного анализа структуры внутриклеточного энергетического метаболизма. Приведенные сведения отражают важную роль митохондрий в развитии метаболической депрессии. В связи с этим, особое внимание уделено рассмотрению наиболее актуальных на сегодняшний день вопросов, касающихся механизмов и роли свободного окисления, а также неспецифической проницаемости митохондрий.

Проблемы, связанные с энергообеспечением миног и лягушек будут рассмотрены в разделе «Результаты» и «Обсуждение».

1. в период метаболической депрессии энергетические траты и развитие гонад у миног и лягушек осуществляются исключительно за счет мобилизации эндогенных субстратов, о чем свидетельствует многократное снижение уровня глюкозы и липидов в плазме крови, а также преобладат1е протеолитических процессов в тканях над биосинтетическими.2. В период мтаболической депрессии в митохондриях печени миног и лягушек наблюдается обратимая супрессия энергетического метаболизма. Она проявляется в снижении скоростей дыхания в различных метаболических состояниях и снижении содержания АТФ в митохондриях и ткани печени,.

3. Скорости дыхания митохондрий печени пойкилотермных животных в период гипометаболизма существенно ниже, чем у млекопитающих. Однако в активном состоянии митохондрии печени миног и лягушек в присутствии НАД — зависимых субстратов обнаруживают скорости потребления кислорода, свойственные митохондриям печени мышей.4. В разобщешш окислительного фосфорилирования в лп1тохондриях печени миног и лягушек, также как в митохондриях мышей принимают участие АТФ/АДФ — антипортер и аспартат/глутаматный переносчик. Разобщающая активность этих белков подавляется карбоксиатрактилатом и глутаматом.5. Высокоамплитудное набухание изолированных митохондрий печени миног в среде нитрата аммония в период метаболической депрессии обусловлено индукцией неселективной поры, чувствительной к действию ингибиторов: CsA, ЭГТА, Mg^', АДФ, БСА, гепарин.6. В неионизированной изоосмотичной среде инкубации митохондрии печени миног не набухают, что свидетельствует о существовании поры в низкопроводящем состоянии.7. В неиопизированпой изоосмотичпой среде инкубации при энергизации митохондрий сукцинатом пора индуцируется Са, Ри лауратом. Эффект лаурата па набухание митохондрий миног может быть двояким в зависимости от их энергосостояния. Зимой в низкоэнергизованных митохондриях лаурат снижает индуцирующее действие Са и Pj, весной, наоборот, — усиливает действие эффекторов.8. Проявления митохондриальной дисфункции в печени миног в период метаболической депрессии (снижение скорости дыхания и фосфорилирования, снижение мембранного потенциала, уменьшение концентрации АТФ, повышение проницаемости митохондриальных.

мембран) сопоставимы с таковым у млекопитающих, в том числе и у человека, при патофизиологических процессах (нейродегенеративные заболевания, ишемия/реперфузия, старение).