Физико-химическое исследование процессов комплексообразования и окислительной деструкции индолил-3-уксусной кислоты

Индолил-3-уксусная кислота (ИУК) является известным и широко распространенным в природе соединением. Ее важность определяется прежде всего тем, что ИУК представляет со-Рп бой основной член ряда ауксинов — фитогор-монов, оказывающих многообразное регуля-торное действие на рост и развитие растений (Полевой, 1982; Marumo, 1986; Cooke et al., 2002; Vogler & Kuhlemeier, 2003) и активно участвующих в растительно-микробных взаимодействиях.

ИУК.

Краткие исторические сведения об ауксинах.

Начало исследованиям стимуляторов растений было положено во второй половине XIX века Чарльзом Дарвином и рядом ботаников при изучении закономерностей роста колеоптиля овса. Проводя экспериментальные наблюдения, Ч. Дарвин с сыном (Дж. Дарвином) пришли к выводу, что «. когда проростки освещаются сбоку, какой-то фактор передается от верхушки вниз по колеоптилю, заставляя его изгибаться» (Darwin & Darwin, 1880- цитируется по изданиям: Дарвин, 1941; Weyers & Paterson, 2001). При этом было отмечено, что данная реакция растения (движение растущего колеоптиля — и в целом изгиб растения — в сторону источника света), известная под названием «фототропизм», инициируется фактором, передающимся от верхушки колеоптиля к клеткам, находящимся на теневой стороне растения, которые под его воздействием удлиняютсяпри удалении же верхушки колеоптиля реакция на свет отсутствует.

Различные исследователи первой половины XX в., среди которых были ботаники П. Бойсен-Йенсен (Boysen-Jensen, 1913) и А. Пааль (Paal, 1919), показали, что вышеупомянутый фактор имеет химическую природу, ¦ действие которого может передаваться через проницаемую перегородку.

Так, Бойсен-Йенсен отмечал, что введение непроницаемой для водного раствора мембраны (тонкой пластины, изготовленной из слюды), отделяющей верхушку колеоптиля от расположенных ниже тканей, предотвращало фототропную реакцию растения.

Первое успешное выделение этого химического фактора было осуществлено в 1926 г. голландским ученым — физиологом растений Ф. Вентом (F. Went), продолжившим работу Бойсен-Йенсена (см., например, Salisbury & Ross, 1978). В своих экспериментах Ф. Вент «экстрагировал» предполагаемое действующее вещество в агаровые кубики, помещая на них срезанные верхушки колеоптиля, и впоследствии наблюдал развитие «фототроп-ной» реакции (изгиб) колеоптиля с обрезанной верхушкой при его длительном контакте с такими агаровыми кубиками. Это было не только первое выделение ростового гормона, но и разработка соответствующей тому времени методики, позволившей Ф. Венту провести в определенном смысле «количественное» определение этого гормона (биотест, основанный на измерении угла изгиба колеоптиля).

Ростовому гормону, образующемуся в верхушке колеоптиля, Ф. Вентом было дано название «ауксин» (от греческого сги^тци] - увеличение, рост). Однако лабораторная техника того времени не давала возможности выделить данное ростовое вещество в чистом виде из-за крайне низкой его концентрации в тканях. Впервые кристаллический ауксин был получен из мочи человека, и только в 1934 г. было показано, что это соединение представляет собой индолил-3-уксусную кислоту. Тем не менее, первое сообщение об определенной идентификации ИУК как ауксина в растительной ткани датируется лишь 1942;м годом (Haagan-Smit etaL, 1942; цитируется по: Weyers & Paterson, 2001).

Распространенность ауксинов в природе.

К настоящему времени известно, что индолил-3-уксусная кислота очень широко распространена в растительном мире и является, как отмечалось выше, основным фитогормоном ряда ауксинов, синтезируемых высшими растениями (Cook et al., 2002) — концентрации ауксинов в растиА тельных клетках достигают 10 — 10″ моль/л. Следует отметить, что группа ауксинов включает в себя весьма разнообразные химические соединения, большинство из которых содержит ароматическую систему и полярную боковую цепь, чаще всего несущую карбоксильную группумногие природные и синтетические ауксины являются индольными производными (Marumo, 1986; Armstrong et al., 2002).

Достоверно установлено также, что йндолил-3-уксусная кислота синтезируется многими микроорганизмами (Costacurta & Vanderleyden, 1995), которые могут выделять ее в окружающую среду в заметных количествах, превышающих 10~5 М (Frankenberger & Arshad, 1995; Thuler et al., 2003) и в отдельных случаях достигающих Ю~3 М (Mordukhova et al., 2000) — особенно широко эта способность распространена среди почвенных бактерий (Patten & Glick, 1996). Роль данного процесса в обмене веществ самих бактерий, синтезирующих фитогормоны даже в отсутствие растений, пока не выясненапоказано лишь участие ауксинов в регуляции экспрессии генов у бактерий (Кацы, 1997, 2003). Хорошо известно, тем не менее, что биосинтез и выделение фитогормонов, включая ауксины, в окружающую среду некоторыми почвенными микроорганизмами является одним из наиболее существенных компонентов их ассоциативного взаимодействия с высшими растениями (Prikryl et al., 1985; Glick, 1995; Frankenberger & Arshad, 1995; Lambrecht et al., 2000). Формирование и функционирование подобного ассоциативного симбиоза — чрезвычайно сложное, многогранное и еще во многом не понятое явление — активно исследуется уже более четверти века в связи с перспективностью его использования в сельском хозяйстве для улучшения плодородия почв и увеличения урожайности культурных растений (Patriquin et al., 1983; Dobereiner & Pedrosa, 1987; Kirchhof et al., 1997; Steenhoudt & Vanderleyden, 2000; Lodewyckx et al., 2002).

Роль ионов металлов в процессах с участием ауксинов.

Биосинтез и выделение микроорганизмами в почву индолил-3-уксусной кислоты и родственных соединений, обладающих заметной реакционной способностью, может сопровождаться разнообразными химическими процессами с участием компонентов окружающей среды, в том числе ионов металлов.

Одним из самых распространенных металлов, играющим, к тому же, в процессах жизнедеятельности практически любых клеток важную многоплановую роль, является железо (Sigel & Sigel, 1998). Превращения соединений железа в природе чрезвычайно разнообразны и лежат в основе многих химических и биохимических процессов, осуществляющихся как в живой клетке, так и вне ее (Konhauser, 1997; Pierre & Fontecave, 1999; Williams & Frausto da Silva, 2000; Williams, 2001) — в том числе в почве, где железо (в основном в виде частиц железосодержащих минералов) обычно присутствует в избытке (Konhauser, 1997). Разнообразию процессов с участием ионов железа способствует его поливалентностьосновными степенями окисления железа, встречающимися в его соединениях, наиболее распространенных в природе, являются +2 и +3. В ряде случаев, тем не менее, образуются также соединения с более высокими степенями окисления железа (+4 и даже +5), в основном в биокомплексах железа с порфи-ринами и в составе некоторых ферментов (Sigel & Sigel, 1998; Pierre & Fontecave, 1999).

Интерес исследователей к взаимодействию ауксинов с ионами металлов возник, по-видимому, около полувека назад, когда было замечено, что некоторые хелатообразующие соединения обладают ауксиновой активностью. Как следствие, было высказано предположение о том, что активность уже известных к тому времени ауксинов связана с их хелатирующим действием (см., например, статью Коэна и др. в журнале «Nature» (Cohen et al., 1958) и цитируемые в ней работы 1956 года). Сравнение результатов по комплексообразованию ионов меди (Н) с ИУК и а-нафтилуксусной кислотой (также обладающей ауксиновой активностью) в 50%-ных водно-этанольных растворах, выбранных для увеличения растворимости органических кислот, показало образование комплексов с близкими константами устойчивости (Cohen et al., 1958).

Как следует из рассуждений Коэна и соавторов, поскольку комплек-сообразование меди (И) с ацетат-ионами выражено слабо, а объяснение возможности усиления связывания меди (И) с ИУК посредством индольно-го атома азота (речь, очевидно, шла о возможности замещения протона при гетероатоме пиррольного цикла) не объясняло аналогичной устойчивости комплекса с а-нафтилуксусной кислотой, в которой вовсе отсутствует «замещаемый атом водорода» в кольце, ими было высказано предположение о том, что «в качестве второй координирующей группы может выступать все ароматическое кольцо» (к тому времени уже были известны комплексы металлов с ароматическими соединениями). Данное предположение, однако, являлось чисто умозрительным и не подтверждалось никакими измерениями. Следует заметить, что это предположение в отношении комплекса с медью (И) впоследствии не подтвердилось: как следует из литературных данных, полученных с помощью ряда инструментальных методов, некоторые изученные индолил-3-алкановые кислоты, включая.

2 f.

ИУК, образуют с двухвалентными металлами (и в том числе с Си) обычные карбоксилатные комплексы (Cariati et al., 1983).

Интересно, что в той же самой ранней работе (Cohen et al., 1958) было замечено, что «некоторые другие предварительные эксперименты с индо-лил-3-уксусной кислотой показывают ее сильную хелатирующую активность с ионами железа (Ш) и значительно меньшую — с ионами кобаль-та (И)» — при этом подобной активности не наблюдалось с ионами кальция и магния. Однако для подтверждения данных утверждений, в частности, в отношении железа (Ш), вновь ни одного факта или результата измерений авторами не приводилось.

В последовавшей вскоре работе (Recaldin & Heath, 1958), также опубликованной в журнале «Nature», была сделана попытка выяснить возможность комплексообразования железа (Ш) с ИУК в 50%-ном водно-этаноль-ном растворе. Было обнаружено, что в присутствии 0,004 М FeCb и 0,1 М ИУК «постепенно развивается интенсивное окрашивание», и указывалось на увеличение поглощения в видимой области (в особенности между 450 и 600 нм) со временехм, достигавшее максимума в течение ~2 ч. Было также обнаружено, что в темноте при температуре 20 °C в том же водно-этаноль-ном растворе в присутствии 0,004 М FeCh и 0,002 М ИУК при перемешивании в течение 3 ч происходило почти полное (84%-89%) разрушение ИУК с эквивалентным выделением СО2 и поглощением кислорода с образованием окрашенного продукта окисления (при этом в аналогичных условиях в присутствии в растворе 0,004 М Си (ЫОз)2 вместо FeCl3 изменений газового состава не наблюдалось, а через 4,5 ч было отмечено всего лишь 10%-ное снижение содержания ИУК).

Из вышеописанных простейших экспериментов авторы (Recaldin & Heath, 1958) могли сделать лишь вывод об индуцировании окислительного декарбоксшшрования ИУК в присутствии железа (Ш) с эквивалентным поглощением кислорода в растворе вода — 50% этанол. Ни органические продукты окисления ИУК, ни состояние железа в данных водно-этаноль-ных растворах не анализировалисьне исследовались также процессы в ^ водных средах, представляющие более общий интерес.

В более поздних работах акцент при исследовании ауксинов и их окислительной деградации практически полностью переместился на исключительно сложные ферментативные процессы (Нттап & Lang, 1965; КоЬауаБЫ ег а1, 1984; Ни & Огу1шг51-, 1997; см. также литературный обзор), и многие вопросы относительно химической природы процессов комплек-сообразования и окислительной деструкции ИУК и других ауксинов в отсутствие ферментов практически остались открытыми.

Начатые в последние годы в ИБФРМ РАН исследования с применением современных инструментальных методов показали возможность протекания неферментативных (химических) окислительно-восстановительных процессов в присутствии железа (Ш) с участием ИУК и некоторых ее метаболически и структурно родственных соединений также в водных растворах в условиях, соответствующих или близких к физиологическим, что может иметь определенное экологическое значение (Камнев, 1998; Катпеу я/., 1999, 2000).

Следует отметить, что литературные сведения по комплексообразова-нию индолил-3-уксусной кислоты и других производных индола с металлами чрезвычайно ограниченны и фрагментарны. В настоящей работе ф проведено исследование, направленное на выяснение особенностей взаимодействия ИУК, некоторых других производных индола (индолил-3-алкановых кислот) и метаболически и структурно родственных соединений (использованных для более четкого выявления влияния различий в структуре на химические свойства и поведение) с ионами железа (Ш), в том числе с образованием комплексов. Кроме этого, были выделены и исследованы продукты неферментативной (химической) окислительной деструкции ИУК, образующиеся в водных средах в присутствии железа (Ш).

Экспериментальные данные получены с помощью ряда современных инструментальных физико-химических методов, включающих электронную (ЦУ-У1б), колебательную (ИК и КР) и ядерно-резонансную спектроскопию (ЯГР, !Н ЯМР), хромато-масс-спектрометрию, а также препаративную колоночную хроматографию и элементный микроанализ. и.

Актуальность темы

.

В связи с широкой распространенностью индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и других ауксинов индольной природы в растениях (Cooke et al.,.

2002), удивительно многообразной физиологической активностью ауксинов (Leyser, 2001, 2001аBecker & Hedrich, 2002; Vogler & Kuhlemeier,.

2003), а также их биосинтезом многими почвенными микроорганизмами с выделением в окружающую среду (Frankenberger & Arshad, 1995; Со-stacurta & Vanderleyden, 1995; Patten & Glick, 1996) их значение в природе трудно переоценить. В частности, для ассоциированных с растениями почвенных бактерий, которые могут оказывать существенное стимулирующее влияние на рост и развитие растения-хозяина, способность продуцировать и выделять ИУК во внешнюю среду считается одним из важнейших составляющих эффективного растительно-бактериального симбиоза, в котором молекулам ИУК, помимо фиторегулирующего действия, отводится роль «взаимно сигнальной молекулы» («reciprocal signalling molecule» — Lambrecht et al., 2000). Очевидно, что любой химический процесс с участием данной «сигнальной молекулы», например, в ризосфере почв, может косвенно оказывать влияние и на ассоциативные взамодейст-вия в системе растение — микроорганизмы, а также, непосредственно влияя на внеклеточный фитогормональный пул, — сказываться на интенсивности роста и развития растений.

Актуальность исследования процессов взаимодействия ИУК с ионами металлов и, в частности, железа, являющегося одним из наиболее распространенных и биологически важных микроэлементов (Sigel & Sigel, 1998), определяется как химическими особенностями данных процессов, так и исключительно важной ролью, которую они играют в разнообразных биологических системах. Так, химическое взаимодействие ИУК (наряду с некоторыми другими структурно родственными соединениями) в слабокислых водных средах с железом (Ш) может приводить к его восстановлению до более биологически доступного железа (Н), что имеет определенное экологическое значение для кислых почв (Камнев, 1998; Kamnev et al., 1999), занимающих, как известно, до трети всех возделываемых территорий (Von Uexkull & Mutert, 1995). С другой стороны, в аэробных условиях в присутствии Fe" 1 была обнаружена возможность протекания процессов, способствующих химической окислительной деградации ауксина (Kamnev & Kuzmann, 1997а) — в отличие от его ферментативной окислительной деструкции (Gazaryan et al., 1996, 1999; Gazaryan & Lagrimini, 1996, 1998; Savitsky et al, 1999).

Для биологических систем следует, во-первых, отметить способность ИУК существенно увеличивать скорость переноса катионов металлов через модельные фосфолипидные мембраны (Jones et al., 1992) и модулировать ионный транспорт в растительных клетках (Becker & Hedrich, 2002). Во-вторых, комплексы ряда лантаноидов (Ln3+) с ИУК состава LnL3−3H20 (где Lиндолил-3-ацетат) в концентрациях порядка 10″ ° М и ниже, по литературным данным (Wenmian et al., 1998), показывали значительно более высокую ауксиновую активность, чем свободная ИУК или хлориды соответствующих металлов, что указывает на синергизм их действия в комплексах. В-третьих, взаимодействие ауксина с ионом металла в ауксинсвя-зывающем центре белка АВР1 (auxin-binding protein 1), который, по современным представлениям, является одним из наиболее вероятных рецепторов ауксина в растениях (Timpte, 2001; Woo et al., 2002), представляет собой один из основных этапов в процессах молекулярного распознавания, рецепции ауксина и, возможно, передачи сигнала, хмеханизмы которых во многом не ясны до сих пор (Scherer, 2002; Vogler & Kuhlemeier, 2003). Наконец, при ферментативной окислительной деструкции ИУК в качестве начальной стадии показано образование тройного комплекса пе-роксидаза-ИУК-кислород с последующим переходом ферри-формы ферS мента {Fe3+} вферро-форму {Fe" *} (Gazaryan et al., 1996). Существенно также, что у растительных пероксидаз имеются непосредственно прилегающие к гемовому комплексу определенные области аминокислотных последовательностей, структурно аналогичные соответствующим областям, имеющимся во всех известных ауксинсвязывающих белках (ABPsсм. выше), которые отсутствуют в пероксидазах нерастительного происхождения (Savitsky et al., 1999). Данные области как в случае ABPs, так и в случае растительных пероксидаз, очевидно, отвечают за структурно специфичное связывание ИУК.

Что касается окислительно-восстановительных процессов с участием ауксина, в первую очередь следует отметить их определяющую роль в регулировании концентрации этого фитогормона в растениях, осуществляемую с помощью ферментов — растительных пероксидаз (помимо чисто химических превращений, которые могут играть определенную роль в почве), что упоминалось выше. Кроме этого, в последние годы активно исследуются антии прооксидантные свойства производных индола, включая ИУК (СЬуап е? а1, 1999; КагЬоушк ег а1. у 2001, 2001а), и возможность образования цитотоксичных продуктов при их ферментативном окислении (РоИсеБ ег а1., 1999, 2002; РоИсеБ & ?/агс!тап, 2001) как новые направления, перспективные для противоопухолевой терапии и других областей медицины.

Таким образом, важность выяснения химизма комплексообразования ИУК и родственных соединений и их хихмическиого окисления в водных средах, а также недостаток литературных данных в этой области обусловили выбор цели и задач данного исследования.

Цель и задачи исследования

Основные цели данной работы:

• идентификация и определение структурных особенностей продуктов взаимодействия ИУК и ряда ее структурных аналогов и метаболически родственных соединений с ионами железа (Ш), включая комплек-сообразование;

• выделение и идентификация продуктов неферментативной (химической) окислительной деструкции ИУК в присутствии железа (Ш) с помощью ряда современных инструментальных физико-химических методов.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Сравнительное исследование окислительно-восстановительных процессов, протекающих в водных растворах ИУК и ряда ее структурных аналогов (индолил-3-алкановые кислоты) в аэробных условиях в присутствии железа (Ш) методом спектроскопии ЯГР.

2. Исследование комплексных соединений, образующихся в железо (Ш)-содержащих водных растворах ИУК и ее структурных аналоговвыделение и идентификация комплексов.

3. Исследование структуры и некоторых физико-химических свойств выделенных комплексов в твердом виде и в неводных растворах методами электронной (иУ-УЪ), колебательной (ИК, КР) и ядернорезонансной спектроскопии (ЯГР, ЯМР 'Н).

4. Выделение и идентификация продуктов окисления ИУК, образующихся в водных средах в присутствии железа (Ш), с помощью методов препаративной колоночной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии, ИК и 'Н ЯМР-сиектроскопии.

Научная новизна.

Впервые проведено сравнительное исследование редокс-превращений ^ в водных средах с участием ряда индолил-З-алкановых кислот (ИУК,.

ИПК, ИМК) в присутствии железа (Ш). Методом спектроскопии ЯГР показано, что указанные индольные производные в аэробных условиях постепенно восстанавливают железо (Ш), при этом железо (П) накапливается в растворе в форме аквокомплексов.

Выделены новые соединения — комплексы железа (Ш) с ИУК и ИМКохарактеризован их состав и структура. Впервые на основании совокупности данных независимых методов показано, что в координации атома железа в случае ИУК участвует, помимо хмонодентатно координированных депротонированных карбоксильных групп, также ароматическая система лигандов. В комплексе с ИМК, представляющем собой димер, напротив, карбоксильные группы координированы бидентатно, а атомы железа соединены мостиковыми связями посредством дополнительно координированных гидроксо-групп.

Впервые показано, что выделенные и охарактеризованные продукты химического окисления ИУК в водном слабокислом растворе в аэробных условиях в присутствии железа (Ш) — 2-оксиндол-З-уксусная кислота и 3-метил-2-оксиндол — соответствуют описанным в литературе продуктам ферментативного и электрохимического окисления ИУК в нейтральных /|| средах. Выделено новое соединение — комплекс железа (Ш) с 2-оксиндол.

3-уксусной кислотойохарактеризован его состав и структура, аналогичная комплексу с ИУК.

Показано, что дальнейшее окисление в данных условиях протекает с раскрытием пирролин-2-онового фрагмента и приводит к образованию о-нитробензойной кислоты, идентифицированной после экстракции из реа-ционной смеси методом хромато-масс-спектрометрии.

Научно-практическая значимость.

Полученные данные о процессах, протекающих с участием индоль-ных производных в водных средах в условиях, соответствующих физиологическим, расширяют существующие представления о возможных химических превращениях фитогормонов ряда ауксинов, выделямых многими почвенными микроорганизмами и играющих существенную роль в их ассоциативных взаимодействиях с растениями, важных в практическом отношении. В частности, новые сведения о редокс-процессах, протекающих в водных средах с участием ауксинов индольного ряда в присутствии ионов железа (Ш), могут быть использованы для прогнозирования соответствующих превращений в достаточно распространенных слабокислых почвах, что представляет определенную экологическую важность.

Полученные сведения об особенностях поведения ИУК в ряду ее структурных аналогов и влиянии катиона металла на электронную структуру 7Г-электронной системы ароматического фрагмента молекулы ИУК при координации представляют интерес для объяснения ее уникального физиологического поведения и химических свойств (реакционной способности), что можетбыть использовано для направленного регулирования процессов с участием ИУК (оптимизация условий функционирования растительно-микробных симбиозовактивизация процессов в корневой системе растенийфиторемедиация и др.).

Положения и результаты, выносимые на защиту.

1. Результаты исследования окислительно-восстановительных процессов, протекающих в водных растворах ИУК и ряда ее структурных аналогов (индолил-3-алкановых кислот) в аэробных условиях методом спектроскопии ЯГРрасчетные параметры спектров и сравнительный анализ данных.

2. Результаты сравнительного исследования состава и структуры комплексов индолил-3-уксусной и индолил-3-масляной кислоты с железом (Ш) в твердой фазе и в растворах с привлечением ряда современных инструментальных методов.

3. Состав продуктов, образующихся в процессе химической неферментативной) окислительной деструкции индолил-3-уксусной кислоты в водных растворах в аэробных условиях в присутствии ионов железа (Ш). Результаты исследования состава и структуры комплекса железа (Ш) с продуктом окисления ИУК.

Проведение исследований.

Данная работа являлась частью исследований, проводимых в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН в лаборатории биохимии в рамках темы «Изучение молекулярно-генетических механизмов узнавания, контакта и обмена «метаболитами азоспирилл и культурных злаков» (научный руководитель — доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор В. В. Игнатов, № гос. регистрации 1 860 024 516), а также (с 2002 г.) в лаборатории биохимии растительно-бактериальных симбиозов в рамках темы «Особенности биохимии эн-дофитных и ассоциативных симбионтов рода Azospirillum» (научный руководитель-доктор биологических наук Л. П. Антонюк, № гос. регистрации 1 200 012 855).

Исследования автора, проводившиеся в рамках совместной работы с отделом ядерной химии Университета им. JI. Этвеша (г. Будапешт, Венгрия), в том числе в период научной стажировки, выполнялись в соответствии с распоряжением Президиума РАН № 10 107−173 от 05 марта 2002 г., а также Протоколом и Тематическим планом (п. 27) по Соглашению о научном сотрудничестве между РАН и Венгерской АН на 2002;2004 гг. по теме «Взаимодействие ионов металлов с метаболитами бактерий и растений» (руководители проекта: от ИБФРМ РАН — доктор химических наук A.A. Камнев, от Университета им. Л. Этвеша — академик Венгерской АН, профессор А. Вертеш). Часть исследований выполнена в период краткосрочных научных стажировок (в 2001 и 2002 гг.) в рамках творческого сотрудничества в лаборатории ядерно-химических методов химического факультета Московского госуниверситета им. М. В. Ломоносова (зав, лабораторией доктор химических наук, профессор Ю.Д. Перфильев).

Конкурсная поддержка работы.

Описанные в данной работе исследования составляли часть совместных международных проектов, поддержанных грантами в рамках научных программ INTAS (проект 96−1015- в части работы, выполнявшейся в 2000 г.) и NATO (проект LST.CLG.977 664, 2001;2003 гг.) — поддержаны краткосрочной стипендией ЮНЕСКО (UNESCO-ROSTE 875.677.2, Ref. No. 33- 2002 г.) в области биотехнологии, а также грантом № 205 Комиссии РАН по работе с молодежью (6-й Конкурс-экспертиза проектов, 2000;2003 гг.).

Апробация работы.

Материалы исследований, изложенных в диссертации, были представлены и обсуждались на следующих научных совещаниях и съездах: XXV European Congress on [Molecular Spectroscopy (Coimbra, Portugal, August 27 — September 1, 2000) — IX Всероссийская научная конференция «Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов» (Саратов, 26−29 сентября 2000 г.) — 111 Всероссийская конференция молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 3−5 сентября 2001 г.) — Юбилейная научная конференция молодых ученых «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2426 октября 2001 г.) — Первая региональная конференция молодых ученых.

Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Cath ратов, 26−27 марта 2002 г.) — 7 International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (St.-Petersburg, Russia, 5−9 May 2002) — XVIII International Conference on Raman Spectroscopy (Budapest, Hungary, 25−30 August 2002) — 8th International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine (Budapest, Hungary, 18−23 May 2004), а также на отчетной научной конференции ИБФРМ РАН (22 апреля 2004 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 работ в международных и российских научных изданиях, включая 8 статей, из которых 3- в международных журналах и 5- в отечественных и международных сборниках трудов, а также 5 тезисов докладов в сборниках работ международных и российских научных конференций.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов исследований и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов, списка публикаций автора по теме диссертации, благодарностей, списка цитированной литературы из 200 источников (в том числе 162 в зарубежных изданиях) и приложения, содержащего 5 схем, относящихся к литературному обзору, а также 22 рисунков и 6 таблиц, иллюстрирующих полученные результаты.

ВЫВОДЫ.

1. Методом спектроскопии ЯГР показано, что в водных растворах при значениях рН~5 и ниже в аэробных условиях в нитратсодержащих растворах железо (Ш) постепенно восстанавливается при взаимодействии с ИУК и ее структурными аналогами — индолил-3-алкановыми кислотами, при этом железо (П) накапливается со временем в виде аквокомплексов.

2. Впервые выделен и детально охарактеризован с привлечением ряда современных физико-химических методов анализа комплекс индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) с железом (Ш), Показано, что координация с металлом осуществляется, помимо атома кислорода карбоксильной группы ИУК, также с участием тс-электронной системы ароматического фрагмента лигандов. Высокая растворимость комплекса в неводных растворителях (ацетон, этанол) определяется структурой комплекса и соответствует молекулярному растворению с сохранением координации.

3. Впервые выделен и охарактеризован с привлечением современных физико-химических методов анализа комплекс индолил-3-масляой кислоты с железом (Ш). Установлено, что данный комплекс существенно отличается по составу от комплекса с ИУК — в частности, представляет собой димер, содержащий две координированные с атомами железа мостиковые ОН-группы, с биденгатной координацией карбоксилатных групп.

4. В результате систематического изучения химического окисления ИУК в слабокислых водных растворах в присутствии железа (Ш) было установлено, что первым этапом данного процесса является окисление двойной связи пиррольного цикла ИУК с образованием 2-оксиндол-З-уксусной кислоты, образующей комплексное соединение с ионами железа (Ш), аналогичное по структуре комплексу ИУК.

5. Показано, что еще одним продуктом протекающего в данной системе окислительного декарбоксилирования ИУК является З-метил-2-оксиндол. Таким образом, впервые показана идентичность данных продуктов химического окисления ИУК и описанных в литературе продуктов ферментативного и электрохимического окисления ИУК. Обнаружено также, что дальнейшее окисление с раскрытием пирролин-2-онового фрагмента приводит к образованию о-нитробензойной кислоты, идентифицированной после экстракции из реационной смеси методом хромато-масс-спектрометрии.

Список публикаций автора по теме диссертации.

Статьи.

1. Щелочков А. Г., Камнев А. А. Спектроскопическое исследование координации индолил-3-уксусной кислоты с железом (Ш) // Новые достижения в химии карбонильных и гетероциклических соединений / Под ред. А. П. Кривенько. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2000. — С. 258−260.

2. Kamnev A.A., Shchelochkov A.G., Perfiliev Yu.D., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Spectroscopic investigation of indole-3-acetic acid interaction with iron (Iil) // J. iVlol. Struct. — 2001. — V. 563−564. — P. 565−572.

3. Kamnev A.A., Shchelochkov A.G., Tarantilis P.A., Polissiou M.G., Perfiliev Yu.D. Complexation of indole-3-acetic acid with iron (lll): influence of coordination on the^-electronic system of the ligand // Monatsh. Chem. — 2001. -V. 132, No. 6.-P. 675−681.

4. Щелочков А. Г. Физико-химические подходы в исследовании особенностей комплексообразования индол и л-3-уксусной кислоты (ауксина) и метаболически родственных соединений с ионами железа // Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков. Материалы юбилейной науч. конф. молодых ученых, Уфа, 24−26 окт. 2001 г. — Т. 1. — Уфа: Изд-во Башкир, ун-та, 2001. — С. 161 -163.

5. Shchelochkov A.G., Kamnev А.А., Tarantilis Р.А., Polissiou M.G. Spectroscopic study of iron (III) complexes with some indole derivatives // In: L. Khassanova, Ph. Collery, I. Maymard, Z, Khassanova, J.-C.Etienne (Eds.). Metal Ions in Biology and Medicine, Vol. 7. JohnLibbey Eurotext, Paris, 2002. — P. 37−40.

6. Kamnev A.A., Shchelochkov A.G., Tarantilis P.A., Polissiou M.G. Fourier transform Raman spectroscopic study of indole-3-acetic acid and its Fe (IlI) complex in acetone solutions // In: J. Mink, Gy. Jalsovszky, G. Keresztury (Eds.). Proc. XVIII Int. Conf. on Raman Spectroscopy, 25−30 Aug. 2002, Budapest, Hungary. J. Wiley & Sons, Ltd., Chichester, 2002. — P. 873−874.

7. Kamnev A.A., Kovacs K., Shchelochkov A.G., Kuzmann E., Vertes A. Interaction of natural and synthetic auxins with iron (III) in aqueous solutions: complexation and redox transformations // In: M.A. Cser et al. (Eds.). Metal Ions in Biology and Medicine, Vol. 8. John Libbey Eurotext, Paris, 2004. — P. 51−54.

8. Kovacs К., Kamnev A.A., Shchelochkov A.G., Kuzmann E., Medzihradszky-Schweiger H., Mink J., Vertes A. Mossbauer spectroscopic evidence for iron (III) complexation and reduction in acidic aqueous solutions of indole-3-butyric acid//J. Radioanal. Nucl. Chem. -2004.-V. 262, No. 1. — P. 151−156.

Тезисы докладов.

1. A.A.Kamnev, A.G.Shchelochkov, Yu.D.Perfiliev. Vibrational, !HNMRand Mossbauer spectroscopic characterization of indole-3-acetic acid complexa-tion with iron // XXV Eur. Congress on Molecular Spectroscopy, Coimbra, Portugal, Aug. 27 — Sept. 1, 2000. Book of Abstracts. — P. 209.

2. Щелочков А. Г. Физико-химическая характеристика координации антра-ниловой кислоты с железом (Ш) // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии. Тез. докл. III Всеросс. конф. молодых ученых, Саратов, 3—5 сент. 2001 г. — С. 70.

3. Щелочков А. Г. Использование ядерно-резонансных методов для изучения структурных особенностей биокомплексов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой. Матер. Первой регион, конф. мол. ученых, Саратов, 26−27 марта 2002 г. Саратов: Изд. Сарат. ун-та, 2002.-С. 60−61.

4. Shchelochkov A.G., Kamnev А.А. Vibrational and NMR spectroscopic studies of iron complexes with some indole derivatives // 7th Int. Symp. on Metal Ions in Biology and Medicine, St.-Petersburg, Russia, 5−9 May 2002. Abstracts / Микроэлементы в медицине. — 2002. — Т. 3, № 2. — С. 9−10.

5. Kamnev A.A., Kovacs К., Shchelochkov A.G., Kuzmann Е., Vertes A. Interaction of natural and synthetic auxins with iron (III) in aqueous solutions: complexation and redox transformations // 8lh Int. Symp. on Metal Ions in Biology and Medicine, Budapest, Hungary, 18−23 May 2004. Book of Abstracts. — P.34.

Благодарноеin.

Автор приносит глубокую благодарность за постоянную поддержку, внимание, ценные советы, консультации и помощь в проведении расчетов и экспериментальных измерений, в оформлении результатов работы и просто за доверие, доброту, отзывчивость, а также за взаимопонимание своему научному руководителю — в.н.с. лаборатории биохимии растительно-бактериальных симбиозов (ЛБРБС) ИБФРМРАН д.х.н. A.A. Камневу.

Автор благодарит также сотрудников ЛБРБС ИБФРМ РАН, и в первую очередь зав. лабораторией д.б.н. Л. П. Антонюк, за ценные обсуждения, доброжелательность и поддержку.

Отдельную признательность хочется выразить заведующей кафедрой органической и биоорганической химии СГУ им. Н. Г. Чернышевского (Саратов), профессору, д.х.н. А. П. Кривенько за ценные научные консультации и всевозможную помощь при подготовке данной работы.

Также хочется выразить благодарность за многолетнее сотрудничество, помощь в проведении расчетов, ценные методические рекомендации доценту кафедры органической и биоорганической химии СГУ им. Н. Г. Чернышевского к.х.н. А. Г. Голикову, аспиранту кафедры общей и неорганической химии СГУ им. Н. Г. Чернышевского П.Г. Никонорову.

Автор признателен эксперту ЭКЦ ГУ ГУВД Саратовской области ст. лейтенанту милиции Д. В. Кайргалиеву за предоставление возможности проводить экспериментальные измерения в его лаборатории.

Чувство особой признательности за искреннее внимание и гостеприимство хочется выразить коллегам из других городов, так или иначе принимавшим участие в экспериментальной работе и/или обсуждениях — профессору, д.х.н. Ю. Д. Перфильеву, заведующему лабораторией ядерно-химических методов МГУ им. М. В. Ломоносова (Москва), и доценту, к.х.н. Л. А. Куликовусотрудникам отдела ядерной химии Университета им. Л. Di веша (Будапешт, Венгрия) — академику Венгерской АН, профессору А. Вертешу и профессору Э. Кузманну, которому автор признателен в том числе за восхитительную культурную программу, организованную в выходные дни в течение рабочего визита в Будапешт в 2002 г. Автор благодарен также К. Ковач, студентке химического факультета Университета им. Л. Этвеша, за участие в экспериментальных исследованиях железосодержащих растворов методом спектроскопии ЯГР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Как отмечалось во введении и литературном обзоре, вопросам химических превращений фитогормонов (ауксинов) индольного ряда — в отличие от ферментативных, подробно изучавшихся в течение последних лет, -уделялось мало внимания. Тем не менее, эти превращения имеют существенное значение не только для химии индольных производных, но и в целом для реальных биологических, экологических и биогеохимических систем (ассоциативные растительно-микробные взаимодействия в ризосферепроцессы, протекающие в почве с участием ионов металлов), что определяется широко распространенной способностью почвенных микроорганизмов синтезировать и выделять ауксины в окружающую среду. В связи с этим задачами настоящей работы предусматривалось выяснение ряда физико-химических и структурных аспектов комплексообразования ауксина и его химической (неферментативной) окислительной деструкции в присутствии соединений одного из самых распространенных в природе и биологически важных металлов — железа в форме Ре111.

В процессе работы впервые был выделен и детально исследован комплекс индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) с железом (Ш). С помощью элементного микроанализа охарактеризован его состав (РеЬз, где Ь — индолил-3-ацетат) — показаны особенности координационной структуры, подтвержденные совокупностью данных ряда независимых современных физико-химических методов (ДТА/ТГ, электронная и колебательная спектроскопия, спектроскопия ЯМР *Н и ЯГР). В частности, на основании анализа полученных экспериментальных результатов с привлечением литературных данных найдено, что координация железа (Ш) с ИУК осуществляется как с атомом кислорода карбоксильной группы, так и с сопряженной системой тс-элек тронов пиррольного фрагмента.

Полученные в настоящей работе данные об образовании^{-комплекса} ИУК свидетельствуют о существенном влиянии катиона железа (Ш) на структуру, а также на распределение плотности тс-электронной системы ароматического фрагмента молекулы ИУК при координации. Ошетим, что подобною типа координация, затрагивающая электронную структуру более активного в химическом отношении пиррольного фрагмента, может влиять как на химические свойства ИУК и ее реакционную способность, так и на биохимические превращения, например, при ферментативной окислительной деструкции с образованием тройного комплекса перокси-даза-ИУК-кислород с ключевой стадией, включающей переход формы фермента {Fe3+} в форму {Fe21″ } (Gazaryan et al, 1996), а также на ее физиологическое поведение: ИУК-зависимый трансмембранный ионный транспорт (Jones et al., 1992; Becker & Hedrich, 2002), ауксиновую активность (Wenmian et al., 1998) и пр. Следует также отметить, что предполагаемая конформация лиганда в полученном комплексе, включающая расположение карбоксильной группы иод углом к плоскости индольного фрагмента, полностью отвечает конформации молекулы ауксина в ее комплексе с ауксинсвязывающим белком растений, содержащим в «активном центре» ион металла (White & Napier, 2001; Woo et al., 2002; Antolic et al, 2003) — комплексе, образование которого «включает» множественные физиологические отклики растения, индуцируемые ауксином.

Несмотря на то, что «центральную» роль в данной работе играла именно ИУК и продукты ее химических превращений, интересные в сравнительном плане результаты получены для структурных аналогов ИУКИПК и ИМК. Наряду с определенной аналогией в редокс-превращениях этих кислот в присутствии железа (Ш) в слабокислых растворах, приводящих к накоплению железа (И) в виде аквокомплексов, в структуре выделенных и охарактеризованных комплексов ИУК и ИМК показаны существенные различия, связанные с изменением координационных «возможностей» молекулы в целом при увеличении длины боковой цепи. В частности, показано образование биядерного комплекса железа (Ш) с ИМК с учае стием дополнительно координированных гидроксо-групппри этом координация карбоксильной группы ИМК, в отличие от ИУК в комплексе с Fe111, соотвегсгвует ее бидентатной координации в обычных карбоксилат-ных комплексах. Таким образом, длина боковой цепи в ИУК является оптимальной не только для проявления ее уникальных физиологических свойств, но и для образования комплекса хелатоподобной структуры.