Анализ изменений осмотических свойств эритроцитов при изменении температуры

Анализ изменений осмотических свойств эритроцитов при изменении температуры

КУРСОВАЯ РАБОТА

Содержание Перечень сокращений Введение

1 Обзор литературы

1.1 Важность определения осмотической резистентности эритроцитов в диагностике заболеваний

1.2 Свойства эритроцитов, обусловливающие их осмотическую резистентность, и изменение их при окислительном стрессе.

1.3 Температура как один из важных факторов, влияющий на осмотические свойства эритроцитов, растворимость газов, сродство гемоглобина к кислороду

2 Материалы и методы

2.1 Химические вещества и буферы

2.2 Выделение эритроцитарной массы

2.3 Обработка эритроцитарной массы пероксиазотистой кислотой

2.4 Метод осмотического гемолиза

2.5 Методы обработки экспериментальных данных

2.6 Используемые компьютерные программы (Origin, Mathcad)

3 Основная часть

3.1 Осмотические свойства эритроцитов в интервале температур 5−37?С

3.2 Осмотические свойства эритроцитов в интервале температуре 50? С

3.3 Сравнительный анализ изменения осмотических свойств эритроцитов при изменении температуры и при окислительном стрессе

4 Заключение

5 Список использованных источников

Перечень сокращений Н₂О₂ -пероксид водорода О₂^.- -супероксид анион радикал

ОН — гидроскил радикал

^.NOмонооксид азота

ONOO^— -пероксинитрит-анион

HOONO — пероксиазотистая кислота

NaNO₂ — нитрит натрия

NaH₂PO₄ — дигидро фосфат натрия

Na₂HPO₄ — гидрофосфат натрия ПОЛ — перекисное окисление липидов

NO₃^- — нитрат

HNO₂ — азотистая кислота

Hb — гемологбин

Введение

Актуальность темы: Температура является фактором внешней среды, оказывающим огромное влияние на проходящие в организме физико-химические процессы. Температура тела является физиологической характеристикой организма, отражающая состояние его теплового баланса. Изменения нормальной температуры тела наблюдаются при различных заболеваниях вследствие расстройств механизмов терморегуляции. При большинстве воспалительных заболеваний температуры тела повышается. Понижение температуры тела ниже 36С — гипотермия — может наблюдаться при отравлении никотином, алкоголем, эфиром, при уремической и диабетической коме, тяжелых истощающих заболеваниях. Температура является регулятором функций белков, в том числе, ферментов, структурных и транспортных белков. В последние десятилетия были выявлены новые механизмы транспорта ионов и молекул через клеточные мембраны, открыты новые транспортеры, например, транспортеры воды — аквопорины. Нобелевская премия по химии за 2003 год была присуждена ученым П. Эгру и Р Мак-Киннону за изучение водных и ионных каналов. Функции белков также изменяются и при химической модификации их структур, например, в результате их реакций с активными формами кислорода и азота. Повышенная генерация активных форм азота и кислорода в клетке приводит к феномену, названному окислительным стрессом и наблюдаемому при различных заболеваниях. Проблема воздействия на организм человека активных форм азота в настоящее время является актуальной. Уровень поступления NO_x-соединений в организм человека в связи с расширением областей их использования и с увеличением степени загрязнения окружающей среды постоянно увеличивается (с питьевой водой, пищей, лекарствами, вдыхаемым воздухом). Изучение влияние температуры и активных форм кислорода и азота на клеточные процессы в свете новых представлений позволяет понять молекулярно-клеточные основы заболеваний человека и найти новые пути коррекции патологических состояний человека.

Цель работы: Выявить механизмы изменения параметров осмотического гемолиза при изменении температуры и при окислительном стрессе эритроцитов.

Задачи:

1. Провести анализ литературных данных о температурных зависимостях различных свойств эритроцитов.

2. Выявить и проанализировать изменения осмотических свойств эритроцитов в интервале температур 5−37С.

3. Выявить и проанализировать изменение осмотических свойств эритроцитов при 50 °C.

4. Провести сравнительный анализ изменения осмотических свойств эритроцитов при изменении температуры и при окислительном стрессе.

Практическая значимость: Изучение действия температуры на транспортные процессы в клетке позволит выявить молекулярные механизмы физиологических и патологических процессов, а как же разработать методы их восстановления на молекулярном уровне.

1. Обзор литературы

1.1 Важность определения осмотической резистентности эритроцитов в диагностике заболеваний Омотическая резистентность эритроцитов имеет большое клинико-диагностическое значение. Этот показатель используется для подтверждения диагноза болезни Минковского-Шаффара и гемолитической болезни новорожденных. Осмотическая резистентность также имеет выраженые изменения при тиреотоксикозе, бронхопневмонии, туберкулезе, малярии, лейкемии, миелосклерозе, лимфогранулематозе, циррозе печени и других. 3−5] Наследственный микросфероцитоз был впервые описан в 1900 году Минковским, а в дальнейшем более подробно — Шоффаром. В основе заболевания лежит генетический дефект белка мембраны эритроцита. Имеющаяся аномалия мембраны приводит к проникновению в эритроцит избытка ионов натрия и повышенному накоплению в нем воды, вследствие чего образуются сферические эритроциты (сфероциты). Сфероциты, в отличие от нормальных двояковогнутых эритроцитов, не обладают способностью деформироваться в узких участках кровотока, например при переходе в синусы селезенки. Это ведет к замедлению продвижения эритроцитов в синусах селезенки, отщеплению части поверхности эритроцита с образованием микросфероцитов (отсюда название болезни — микросфероцитоз) и постепенной их гибели. Разрушенные эритроциты поглощаются макрофагами селезенки. Постоянный гемолиз эритроцитов в селезенке ведет к гиперплазии клеток ее пульпы и увеличению органа. В связи с усиленным распадом эритроцитов в сыворотке повышается содержание свободного билирубина. Поступающий в повышенном количестве в кишечник билирубин выводится из организма с мочой и главным образом с калом в виде стеркобилина. Суточное выделение стеркобилина при наследственном микросфероцитозе превышает норму в 10 20 раз. Следствием повышенного выделения билирубина в желчь является плейохромин желчи и образование пигментных камней в желчном пузыре и протоках. Клиника зависит от выраженности гемолиза. В большинстве случаев первые признаки выявляются в юношеском или зрелом возрасте. У детей болезнь обнаруживается обычно при обследовании по поводу заболевания их родственников. Жалобы вне обострения заболевания могут отсутствовать. В период обострения отмечаются слабость, головокружение, повышение температуры. Одним из основных клинических симптомов является желтуха, которая долгое время может оставаться единственным признаком заболевания.

Анемия при наследственном микросфероцитозе носит нормохромный характер. В мазке крови преобладают микросфероциты, отличающиеся отсутствием характерного для нормальных эритроцитов центрального просветления. Преобладание микроцитов выявляется графически на кривой Прайс-Джонса, отражающей количественные соотношения эритроцитов различных диаметров (средний диаметр нормального эритроцита составляет 7 — 7,5 мкм). При наследственном микросфероцитозе вершина кривой Прайс-Джонса растянута и сдвинута влево в сторону микроцитов. Количество ретикулоцитов увеличено. Число лейкоцитов обычно нормально. При гемолитических кризах отмечается нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево. Количество тромбоцитов варьирует в пределах нормы. В костном мозге отмечается выраженная гиперплазия эритроидного ростка. Содержание непрямого билирубина в крови повышено умеренно и, как правило, не превышает 50 — 70 мкмоль/л. Определяется повышенное содержание уробилина в моче и стеркобилина в кале. Диагноз наследственного микросфероцитоза ставится на основании течения заболевания (чередование кризов и ремиссий), клинической картины (желтуха, спленомегалия, боли в правом подреберье, анемия), данных исследования периферической крови (нормохромная анемия, ретикулоцитоз, микросфероцитоз).

Важное значение имеет обследование родственников больных, у которых могут определяться едва уловимые признаки гемолиза или микросфероцитоз без клинических проявлений. Дополнительными диагностическими критериями может служить ряд лабораторных тестов. Характерным лабораторным признаком заболевания является снижение осмотической резистентности эритроцитов по отношению к гипотоническим растворам хлористого натрия. Начало гемолиза при наследственном микросфероцитозе соответствует 0,6 — 0,7%, а конец — 0,4% вместо 0,48 и 0,22% в норме. Снижение осмотической резистентности свидетельствует о преобладании в крови эритроцитов сферической формы — сфероцитов, которые, менее стойки к осмотическому гемолизу, чем нормальные макропланоциты. Эритроциты больных наследственным микросфероцитозом легко разрушаются после суточной инкубации дефибринированной крови в термостате при 37° С. Добавление к эритроцитам глюкозы значительно уменьшает гемолиз, в то время как АТФ не влияет на него. [6]

Осмотическая резистентность эритроцитов является одним из показателей в методе оценки отека-набухания головного мозга. Отек-набухание головного мозга (ОНГМ) — патологический процесс, возникающий при многих неблагоприятных воздействиях и проявляющийся морфофункциональными изменениями во всех органах и системах организма с преимущественным поражением ЦНС. Обычно он возникает как осложнение основного заболевания при самой разнообразной патологии. Так, послеоперационный ОНГМ у нейрохирургических больных отмечается в 95% случаев.

Эффективная медикаментозная профилактика и терапия ОНГМ — актуальная медицинская проблема. Весьма важным вопросом этой проблемы является вопрос о методах, с помощью которых оценивается эффективность проводимого лечения. Используемые сегодня в практической медицине клинические и лабораторные показатели, свидетельствующие о наличие ОНГМ, связаны в основном с исследованием головного и спинного мозга, мозгового кровообращения и ликвора. Появление компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии, раздельной импедансометрии значительно расширило возможности диагностики ОНГМ. Однако, несмотря на все успехи, достигнутые на этом пути, использование в практической медицине указанных методов с целью диагностики ОНГМ весьма затруднительно. Многие из них требуют сложной аппаратуры и не всегда доступны.

Недавно был предложен новый метод исследования динамики ОНГМ и эффективности его фармакотерапии. Метод основан на изучении водно-электролитного баланса компонентов крови.

В эксперименте на крысах были исследованы содержание фракций воды, ионов натрия и калия в эритроцитах и плазме крови, углеводно-энергетический метаболизм и осмотическая резистентность эритроцитов, гематокритная величина и некоторые показатели свертывающей системы крови при ОНГМ и при его фармакотерапии. Выявлен ряд показателей (содержание связанной и свободной воды, натрий/калиевый коэффициент, средняя клеточная хрупкость, уровень лактата), изменение которых в эритроцитах и плазме крови тесно связаны с изменениями содержания общей воды и плотности мозговой ткани. Совокупность изменений гематологических показателей и степень их выраженности легли в основу разработанного способа оценки динамики ОНГМ.

Этот метод дал возможность изучать динамику ОНГМ (прогрессирующее, непрогрессирующее течение, обратное развитие), оценивать эффективность проводимой фармакотерапии, составлять прогноз течения процесса. Этот метод доступен любой клинической лаборатории, не требует дорогостоящей аппаратуры, легко выполним. [7]

Также выявлено изменение осмотической резитентности при других заболеваниях нервной системы, например, детский церебральный паралич. Это заболевание не моделируется на животных и не воспроизводится в культуре клеток. Рядом авторов было предложено использовать клетки крови — эритроциты для изучения процессов, происходящих в организме в целом.

Было показано, что характеристика ионного транспорта в эритроцитах и нервных клетках качественно аналогична. Во время болезни в ЦНС и эритроцитах происходят параллельные изменения. В эксперименте активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ЦНС сопровождалась параллельным возрастанием концентрации продуктов ПОЛ в плазме крови. У больных со всеми формами цереброваскулярных заболеваний отмечено снижение деформируемости эритроцитов. Изменение пластичности мембран эритроцитов отражает общее повреждение биомембран организма.

Таким образом, динамика изменения осмотической резистентности под влиянием различных факторов позволяет судить не только об изменениях в эритроцитах, но и об изменениях в других органах и тканях. Большая роль в регуляции трансмембранного транспорта ионов, модификации активности интегральных и периферических белков мембраны отводится изменениям фосфолипидного состава мембран эритроцитов. Общность строения плазматических мембран различных органов и тканей позволяет думать, что процессы, происходящие в эритроцитарной мембране, отражают изменения в мембранах других органов и тканей [8]

1.2 Свойства эритроцитов, обусловливающие их осмотическую резистентность, и изменение их при окислительном стрессе Осмотические свойства эритроцитов обусловлены мембранным транспортом через эритроцитарную мембрану. Транспорт веществ (воды, ионов) осуществляется через аквопорины и ионные каналы, и зависит от особенностей эритроцита и экзогенных факторов (присутствие окислителей, температура и других).

Эритроцит — высокоспециализированная клетка, транспортирующая кислород. У человека и млекопитающих эритроциты не содержат ядра. Отсутствие ядра обеспечивает то, что эритроциты потребляют на собственные нужды кислорода в 200 раз меньше, чем ядерные представители (эритробласты, нормобласты).

Размеры эритроцита: диаметр -7.7 мкм, толшина-2.2 мкм. Объем эритроцита-76−96 фемтолитров (фетмо-1 биллиардная).

Одной из важных особенностей эритроцита является их форма двояковогнутых дисков. Двояковогнутая форма эритроцитов:

— увеличивает на 20% общую поверхность по сравнению с формой шара. Общая поверхность всех эритроцитов достигает 3800 м², что в 1500 раз превышает поверхность тела.

— способствует выполнению их одной из основных функций — переносу кислорода и углекислого газа, т.к. диффузионная поверхность увеличивается, а диффузионное расстояние уменьшается.

— увеличивает способность к обратимой деформации (пластичность)при прохождении через узкие и изогнутые капилляры. Пластичность эритроцитов снижается по мере их старения и зависит от их формы. Так, эритроциты, имеющие патологически измененную их форму (сфероциты, серповидные), обладают меньшей пластичностью.

В структуре эритроцита различают остов клетки — строму и поверхностный слой — мембрану. Толщина мембраны равна 10нм. Мембрана эритроцита состоит из 4 слоев:

— наружный — образован гликопротеидами.

— средние 2 слоя — двойной липидный слой.

— внутренний — белки.

Мембрана эритроцита обладает свойством избирательной проницаемости:

— пропускает газы, Н₂О, Н⁺, спирт.

— малопроницаема для глюкозы, мочевины, ионов.

— почти не проходит через нее большинство катионов.

— совершенно не проницаема для белков.

Химический состав эритроцита: 60%-Н₂О, 40%-сухой остаток (почти 90% его приходится на долю гемоглобина). Остальное — это липиды, углеводы, соли.

Функции эритроцитов:

— перенос кислорода гемоглобином

— перенос углекислого газа (с участием гемоглобина, карбоангидразы, ионообменника Cl^-/HCO³).

— защитная (адсорбция вредных веществ, перенос на поверхностях иммуноглобулинов, компонентов системы комплемента, иммунных комплексов, выделяют антибиотик эритрин).

— регуляция водного и солевого обмена.

— перенос питательных веществ (адсорбция и перенос аминокислот).

— креаторная, состоит в переносе макромолекул, осуществляющих в организме информационные связи.

— участвует в регуляции кислотно-основного состояния (гемоглобиновый буфер).

— участие в свертывании крови (содержат тромбопластин, освобождающийся при их разрушении; появление в крови разрушенных эритроцитов способствует гиперкоагуляции и тромбообразованию; вместе с тем, они являются носителями гепарина, являющегося антикоагулянтом).

В 1990 году в институте клинической иммунологии Сибирского отделения АН СССР выявлено неизвестное ранее явление регуляции иммунитета клетками эритроидного ряда, признанное открытием. Его сущность: эритроциты тормозят рост клеток, способных бороться с вирусами и опухолями. Они подавляют антителогенез т. е. ведут себя как клетки-супрессоры. Путем регуляции подачи кислорода в организм, и влияя, таким образом, на содержание эритроцитов, представляется возможным действовать на иммунологическую реактивность, что расширяет возможность борьбы с лейкозами, злокачественными опухолями и аутоиммунными заболеваниями.

— участвуют в регуляции эритропоэза. При разрушении эритроцитов освобождаются содержащиеся в них эритропоэтические факторы, оказывающие стимулирующее влияние на образование эритроцитов в костном мозге.

Итак, некоторые важные характеристики эритроцита:

1. способность деформироваться,

2. отсутствие ядра,

3. отсутствие рибосом,

4. отсутствие митохондрий,

5. переносит О₂ гемоглобином.

Структура биологических мембран лабильна, т. е. под воздействием ряда факторов, в том числе и таких, которые не приводят к потере нативных свойств мембраны, способны вызывать в ней структурные кооперативные переходы. Интерес к таким переходам стимулировался выдвинутым предположением о структурно-мембраном механизме регуляции жизненных процессов в клетке.

Ученые еще в середине XIX века высказывали предположения о том, что в клеточной оболочке существуют поры для просачивания воды, однако длительное время преобладало мнение, что вода просто диффундирует через клеточную мембрану.

В конце 1950;х годов было установлено, что в мембранах эритроцитов есть специальные каналы, через которые вода проходит, а ионы — нет. При этом клеточный «водопровод» обладает потрясающей пропускной способностью: до миллиарда молекул воды в секунду. Логично было предположить, что, как и в случае других веществ, например сахаров и аминокислот, транспорт воды через мембрану происходит с помощью белка. Но какой именно белок выполняет данную функцию? Этот вопрос довольно долго оставался без ответа.

Открытие аквопорина — белка, образующего водную пору, — произошло благодаря счастливой случайности. В 1987 году Питер Эгр, изучая белки-антигены эритроцитов, обнаружил мембранный белок с неизвестнойфункцией. Оказалось, что такой же белок в изобилии присутствует в почечных канальцах — тканях, которые способны прокачивать огромные количеств воды. Это и навело ученого на мысль, что найденный белок имеет отношение к транспорту воды через клеточную мембрану. П. Эгр и его коллеги смогли установить аминокислотную последовательность белка и затем клонировали участок ДНК, кодирующий синтез аквопорина.

Ученые провели несколько экспериментов, неоспоримо доказывающих ключевую роль этого белка в транспорте воды. Например, если «заставить» клетку производить аквапорин в больших количествах, она начинает интенсивно всасывать воду, набухает и буквально разрывается от избыточного внутреннего давления. 10]

Пространственная структура аквапорина напоминает цилиндрический канал, по которому движутся молекулы воды. Через него проходит только вода, но не ионы. Аминокислоты в белке расположены таким образом, что полярность создаваемого ими электростатического поля «переключается» в центре молекулы на обратную. Поэтому молекулы воды, дойдя до середины канала, переворачиваются так, что их дипольные моменты в верхней и нижней части канала направлены в противоположные стороны. Такое переориентирование предотвращает просачивание через канал ионов. Аквапорин не пропускает даже ионы гидроксония Н₃О⁺ (то есть гидратированные протоны), от концентрации которых зависит кислотность среды.

Открытый П. Эгром белок — первый, но не единственный из семейства аквапоринов, К настоящему времени известно около 200 разновидностей белков водных каналов у растений и животных, в том числе и у человека. Благодаря аквапоринам клетки не только регулируют свой объем и внутреннее давление, но и выполняют такие важные функции, как всасывание воды в почках животных и корешках растений.

Создав белковые поры, пропускающие сквозь клеточную мембрану чистую воду, природа позаботилась и о том, чтобы обеспечить каналы для переноса компонентов растворенных в воде солей, прежде всего ионов натрия и калия. Транспорт этих заряженных частиц позволяет клетке генерировать и передавать электрические сигналы.

Еще в 1890 году Вильгельм Оствальд, нобелевский лауреат 1909 года, показал, что электрические токи в живых тканях могут быть вызваны ионами, которые перемещаются через клеточную мембрану. Основные принципы работы ионных каналов и роль ионов в работе нервной системы установлены в 1950— 1960;е годы. В 1963 году за открытия в этой области британским исследователям Алану Ходжкину и Эндрта Хаксли присудили Нобелевскую премию, но молекулярные механизмы ионного транспорта оставались неясными до последнего времени.

Ученых особенно интересовало устройство канала, который пропускал ионы калия, однако почему-то не давал пройти чуть меньшим по размеру ионам натрия. Высказывалось предположение, что белок, образующий канал, содержит фильтр из нескольких атомов кислорода, которые имитируют оболочку из молекул воды, окружающую ион калия в нормальном состоянии. Чтобы внести в этот вопрос окончательную ясность, требовались данные рентгеноструктурного анализа, но получить их оказалось не просто — для этого требовалось вырастить из белка кристалл. Первым, кто сумел достичь результата, стал Родерик Мак-Киннон. В 1998 году он представил трехмерную структуру калиевого ионного канала бактериальной мембраны. Это позволило изучить работу ионного фильтра во всех деталях. Оказалось, что расстояния между атомами кислорода и ионом калия внутри канала в точности соответствуют расстояниям между калием и кислородом воды в растворе. Именно поэтому калий беспрепятственно проходит через канал, а натрий остается в водном растворе.

Изучение мембранных каналов, как водных, так и ионных, имеет не только теоретическое значение. Открытия нобелевских лауреатов 2003 года способствуют пониманию причин заболеваний почек, сердца, мышечной и нервной систем.

В центре водного канала, образованного белком аквапорином, сосредоточен положительный, заряд. Поэтому положительно заряженные ионы, например ион гидроксония, через канал пройти не могут.

Рис. 1 Схема аквопорина Этот ионный канал пропускает ионы калия, но не натрия. Вне клеточной мембраны (А) ионы калия и натрия находятся в окружении молекул воды (показаны на рисунке красным цветом). Внутри фильтра (В) атомы кислорода образуют структуру, которая имитирует водную оболочку иона калия. Меньший по размеру ион натрия не соответствует структуре фильтра и не может пройти через канал.

Рис. 2. Тетрамерная структура водного канала Окислительный стресс является результатом метаболических реакций, в которых используется кислород, и определяется как нарушение состояния равновесия оксислительно-востановительных систем клеток. Это определение окислительного стресса подразумевает, что клетки характеризуются неповрежденными оксислительно-востановительными системами, которые непрерывно производят и обезвреживают окислители в течение нормального аэробного метаболизма. Когда протекают дополнительные окислительные процессы, системы окисления превалируют над системами восстановления, инициируя ПОЛ, окисление белков, углеводов, нуклеиновых кислот, в конечном счете, ведя к смерти клетки в результате сильного окислительного стресса. Умеренный, хронический окислительный стресс может изменять системы восстановления клетки, увеличивая или уменьшая активность ферментов, включенных в эти системы, и исчерпывая клеточные резервы антиокислительных соединений типа глутатиона и витамина E. 11]

Окислительный стресс — признак нормальной аэробной жизни эритроцита, которая, однако, сбалансирована мощными ферментативными и неферментативными антиокислительными системами защиты (то есть каротиноидами, витаминами E и C, флавонидами, GSH-пероксидазой, супероксид дисмутазой, каталазой) .

Развитие многих болезней человека связано с образованием активных форм азота, которые могут вызывать окислительный стресс клетки. 17]

Рис. 3 Схема образования активных форм азота Осмотические свойства эритроцитов при окислительном стрессе, вызванном пероксиазотистой кислотой в растворе NaCl изменяются: при увеличении концентрации пероксиазотистой кислоты происходит изменение формы кривой гемолиза. С увеличением концентрации пероксиазотистой кислоты увеличивается ширина области гемолиза и кривая сдвигается к области изотонических концентраций (табл.1)[19].

Таблица 1. Изменение характеристик кривой осмотического гемолиза в Na-фосфатном буфере и в растворе NaCl при окислительном стрессе, вызванном пероксиазотистой кислотой

1.3 Температура как один из важных факторов, влияющий на: осмотические свойства эритроцитов, растворимость газов, сродство гемоглобина к кислороду Температура является неотъемлемым фактором внешней среды, постоянно действующим на клеточные мембраны и оказывающим огромное влияние на проходящие в них физико-химические процессы.

Температура тела — одна из важнейших характеристик нормального функционирования организма. В организме человека условно выделяют две температурные зоны — оболочку и ядро. Оболочку составляют поверхностно расположенные структуры (кожа и подкожная клетчатка), ядро-кровь, внутренние органы. Температура оболочки ниже температуры ядра и не одинакова в разных участках тела, что связано с различием их кровоснабжения, толщиной подкожной клетчатки и т. д. В частности самая высокая температура кожи в подмышечной ямке (т.н. аксилярная температура), самая низкая — кистей и стоп (24−28С при комнатной температуре).Температура внутренних органов зависит от интенсивности протекающих в них окислительно-восстановительных процессов, наиболее высокая температура в печени (39С), несколько ниже температура желудка, почек и других органов. 1]

Обычная физиологическая деятельность сопровождается колебаниями их температуры в пределах долей градуса. Во время интенсивной мышечной работы температура тела повышается на 1−2С, а сокращающихся мышц почти на 7С. Температура кожи зависит от температуры окружающего воздуха, его влажности, скорости движения, характера одежды, чистоты и влажности самой кожи и т. д. При крайне неблагоприятных внешних условиях возникает охлаждение организма или перегревание. Известны физиологические колебания температуры в течение дня: разница между утренней и вечерней температурой тела обычно не превышает 0,6С. В пожилом и старческом возрасте температура тала может быть несколько ниже, чем у людей среднего возраста. У здорового человека может наблюдаться постоянное повышение или понижение температуры тела (приблизительно на 0,5С по отношению к средней), а также так называемая функциональная асимметрия температуры тела, при которой отмечается различная температура в правой и левой подмышечных областях.

Изучение зависимости структурного состояния биологических мембран от температуры в значительной мере стимулировалось тем фактом, что многие клеточные функции, непосредственно или опосредованно связанные с мембранами, проявляют аномалии в температурных зависимостях. Анализ экспериментальных данных показывает, что наиболее вероятной причиной этих аномалий являются структурные изменения в белковом и липидном компонентах мембранных систем, причем если переход возникает в белках, то обычно на кривых Арениуса регистрируются изломы, если же в липидах то могут наблюдаються как изломы, так и разрывы. 4]

Одними из первых структурные изменения в биологических мембранах под воздействием температуры обнаружили Бенедетти и Эммелот: судя по электроно-микроскопическим даным, мембраны печени крысы при 2 и 37? С обладали различной надмолекулярной организацией.

Особенно хорошо к настоящему времени термотропные переходы изучены в мембранах бактерий. Методом калориметрии убедительно показано, что при умеренных температурах (до 40С) изменения этих мембран обусловлены плавлением липидов, в то время как при более высоких температурах — денатурацией белков. Липидные переходы в бактериальных мембранах выражены достаточно сильно, что объясняется отсутствием в них холестерина, способного подавлять эти переходы. Для мембран других клеток, в состав которых входит холестерин, термотропные переходы, происходящие в липидах, менее выражены, и на их фоне при умеренных температурах могут появляться также белковые переходы.

Эритроцитарные мембраны выделяются среди других высоким содержанием холестерина. Именно этой их особенностью можно объяснить тот факт, что в ранних калориметрических исследованиях не было обнаружено термотропных переходов и мембрана было отнесена к структурно нелабиальным. Только после значительного удаления холестерина липиды эритроцитарных мембран человека проявляли слабую широкую полосу термопоглощения с максимумом около 37С.

Исследования, проведенные другими методами, однако, показали, что структура эритроцитарных мембран весьма чувствительна к температурному воздействию. Количество термотропных переходов, зарегистрированных к настоящему времени как по структурным, так и по функциональным показателям, настолько велико, что для определенных температурных интервалов остается неясным. Характеризуют изменения этих показателей один широкий переход или ряд различных восококоооперативных переходов.

Область температур ниже 25С.

Приведенные многочисленные данные свидетельствуют о том, что в области 17—20°С в эритроцитарной мембране происходит переход, который проявляется в изменении состояния белкового компонента. Результаты, полученные при исследовании других мембран, показывают, что чаще всего изменения в мембранных белках при умеренных температурах происходят вследствие структурных переходов в окружающих их липидах. Доказательством того, что структурный переход мембраны инициируется в липидной фазе, обычно является обнаружение изменений при данных температурах в выделенных из мембран липидах.

Таким образом, совокупность экспериментальных данных свидетельствует в пользу того, что структурный переход эритроцитарных мембран при 17—20°С инициируется в бесхолестериновых липидных областях. Поскольку при этом затрагивается целый ряд функций, связанных с белками, то такие области, скорее всего, включают в себя пограничные липиды полифункциональных белковых систем, по-видимому, внутримембранных частиц.

Область температур 25−46С В этих областях наблюдаются структурные перестройки эритроцитарной мембраны, индуцируемые в ее липидной фазе. При температуре гемолиза в эритроцитарной мембране существуют области фазоразделенных липидов, по границам которых образуются «гемолитические» щели. Действие температуры обусловлено плавлением липидов в различных областях эритроцитарной мембраны. В эритроцитарной мембране в физиологической области температур наблюдаются два температурно-индуцикованных структурных перехода (при 28−36 и 42−46°С). Возможно также, что в этой области температур могут происходить переходы, инициируемые в белковых компонентах мембраны.

В области температур выше 46С в мембранах происходят переходы, имеющие необратимый характер, что связано с потерей ряда функциональных свойств клеток. Структурные перестройки в мембранах эритроцитов при повышенных температурах сопровождаются изменением формы и деформируемости эритроцитов. При нагревании клеток от 43 до 54С наблюдается образование сфероцитов; а в области температур от 55 до 77С на их поверхности образуются зазубренности, и происходит разрушение эритроцитов.

Деформируемость эритроцитов, измеренная по их фильтруемости после инкубации клеток в течение 20 минут при повышенных температурах, начинает постепенно уменьшаться при 45с и резко исчезает в области 49−50с. Эта полная потеря деформируемости соответствует переходу диск-сфера, наблюдаемому под микроскопом. Переход, наблюдаемый в мембране при 42−50С, обусловлен изменением структуры входящего в ее состав спектрина. Также известно, что термоустойчивость спектрина в изолированных мембранах и в целых эритроцитах различна: переход, обусловленный денатурационными изменениями спектрина, происходит в изолированной мембране в области 46с, в то время как в эритроцитах в области 50С. Совпадение же температур, при которых нарушается структура спектрина в составе целых эритроцитов и наблюдаются морфологические изменения клеток, дает основание считать, что между этими процессами существует причинно-следственная связь, причем инициатором структурных перестроек в мембране является спектрин.

Учитывая основную функцию эритроцитов — перенос газов, следует отметить влияние температуры на растворимость кислорода и на сродство гемоглобина к кислороду.

Известно, что растворимость газов в воде уменьшается с повышением температуры. Так, в воде, насыщенной воздухом при 38с, 30с и 20С количество растворенного кислорода равно: 6.8, 7.36, 9.17мг/л. При этом парциальное давление кислорода составляет 148, 152 и 155 мм.рт.ст., т. е. в данном диапазоне концентрация кислорода изменяется на 35% при почти неизменном его давлении.

Величены коэффициента диффузии кислорода при изменениях температуры могут выть вычислены исходя из измемнений вязкости воды по законы СтоксаЭнштейна где: Т — температура (абсолютная); — вязкость воды в Пуазах.

Рис. 4 Зависимость содержания кислорода в воде и коэффициента диффузии от температуры Сродство гемоглобина к кислороду также является фактором, зависящим от температуры

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Химические вещества. Буферные растворы В работе использовали NaNO₂, NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, («Реахим», Россия, ч.д.а.). Остальные реактивы (х. ч.) были производства России и Беларуси. Растворы NaNO₂ и H₂O₂ готовили непосредственно перед опытом.

2.2 Выделение эритроцитарной массы Эритроцитарную массу получали из банка Гомельской областной станции переливания крови. Эритроциты трижды отмывали и ресуспендировали в фосфатном буфере. Гематокрит суспензий — 20−40%.

2.3 Обработка эритроцитарной массы пероксиазотистой кислотой Пероксиазотистую кислоту получали в реакции NaNO₂ с H₂O₂ при эквимолярных концентрациях (0.025 мMоль — 10 мMоль) непосредственно в закисленных суспензиях эритроцитов (pH 6.3).

2.4 Метод осмотического гемолиза Мембраны клетки — полупроницаемые барьеры, и имеют осмотические градиенты, установленные между внутриклеточными и внеклеточными жидкостями, которые могут заставить воду течь в и из клетки. Величина осмотического давления зависит от разности концентраций ионов на каждой стороне мембраны. Внутриклеточная среда эритроцитов содержит соли, глюкозу, белки и гемоглобин. 0.9% водный раствор NaCl является изотоническим. Когда клетки крови находятся в такой среде, внутриклеточные и внеклеточные концентрации веществ находятся в осмотическом равновесии, и нет никакого притока или оттока воды.

Метод осмотического гемолиза, основан на том, что осмотическая хрупкость (или восприимчивость к гемолизу) эритроцитов не однородна, и число клеток, которые гемолизируются зависит от степени гипотоничности внеклеточной среды [14,17].

Оценка степени гемолиза эритроцитов в гипотонических растворах проводилась турбидиметрическим методом на длине волны 680 нм. Турбидиметрией называют метод, основанный на изменении интенсивности светового потока, прошедшего через рассеивающую среду (например суспензию клеток). В общем случае, интенсивность прошедшего светового потока зависит от светорассеяния и светопоглощения. При турбидиметрических исследованиях поглощение по возможности исключают соответствующим выбором длины волны падающего света. Турбидиметрия суспензий основана на использовании некоторых закономерностей рассеяния света. С позиции теории светорассеяния животные клетки относятся к крупным частицам (дифракционный параметр больше 10). В области достаточно малых концентраций рассеивающих частиц коэффициент турбодиметрического ослабления r прямо пропорционален числу частиц N .

r= a^.N

Физический смысл коэффициента пропорциональности (а — сечение ослабления) — коэффициент ослабления одиночной частицы, а=К (s)^.3.14^.R²

где, К (s)-коэффициент светорассеяния, являющийся сложной функцией относительного показателя преломления, размеров и формы частицы, длины волны падающего света. Таким образом, в основе турбдиметрии клеточных суспензий лежит уравнение:

r=K (s)^.3.14^.R^2.N,

позволяющее определять фотометрически концентрацию частиц в суспензии, относительные изменения концентрации, а, в ряде случаев и другие параметры клеток усредненный радиус, изменения формы и т. п.

100% гемолизу соответствует оптическая плотность гемолизата в дистиллированной воде. 0% гемолизу соответствует оптическая плотность суспензии эритроцитов в изотоническом растворе. Данный метод удобен при изучении осмотического лизиса эритроцитов с окисленным гемоглобином.

Методика исследования:

1. Взять семь пробирок по 4,0 мл с процентным содержанием NaCl: 0,9%, 0,6%, 0,56%, 0,545%, 0,53%, 0,50% и 0,4%.

2. Образец крови 10 мкл добавить в каждую пробирку, перемешать, чтобы получить гомогенную смесь клеток крови (рис 6).

3. После 20 минут темостатирования при температуре опыта, измерить оптическую плотность на 680 нм относительно воды. См. Рис. 6−8.

2.5 Методы обработки экспериментальных данных Параметры гемолиза.

Для оценки изменений кривых гемолиза после обработки эритроцитов пероксиазотистой кислотой и при изменении температуры нами были введены два параметра: процентом содержания NaCl и растворе при 50% гемолизе (b50%), и шириной зоны гемолиза (b)

Параметры гемолиза оценивали по кривой гемолиза с использованием уравнения Больцмана Где y-процент гемолизированных эритроцитов, А1-начальное значение y (А1=1), А2- конечное значение y (А2=0), b50%-значение процента NaCl в растворе при 50% гемолизе, b ширина области гемолиза.

Статистическая обработка экспериментальных данных Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась по стандартным методикам программы Exel (n=38, p=0.95).

2.6 Используемые компьютерные программы В подготовке данной работы использовались программы Origin, Mathcad, Exel, .Word.

осмотический эритроцит температура

3.Основная часть

3.1 Осмотические свойства эритроцитов в интервале температур 5−37?С Зависимость процентного содержания гемолизированных клеток в суспензии эритроцитов от концентрации NaСl в растворе имеет S-образный вид (рис.9). При уменьшении температуры суспензии эритроцитов с 37⁰С до 5⁰С наблюдалось увеличение параметра b50%. Форма кривых гемолиза практически не изменялась (параметр b изменялся незначительно) (таблица 2).

Как показывает обзор литературных данных, конформационная подвижность макромолекул в мембране зависит от температуры. С уменьшением температуры среды конформационная подвижность макромолекул в мембране уменьшается. Вследствие этого изменяются транспортные процессы через эритроцитарную мембрану, эритроцит становится более чувствительным к осмотическому стрессу. Это проявляется в увеличении параметра b50%.

Таким образом, при низких температурах эритроциты становятся более хрупкими, что обусловлено снижением подвижности молекул в мембране.

Рис. 9. Зависимость относительной концентрации гемолизированных эритроцитов от относительной концентрации NaCl в водном растворе (кривая гемолиза) при температурах ниже физиологических Таблица 2. Зависимость параметров гемолиза от температуры

3.2 Осмотические свойства эритроцитов при температуре 50? С При температуре 50С происходит денатурация спектрина, белка цитоскелета клетки. Денатурация спектрина инициирует структурные перестройки в мембране, вследствие чего нарушается транспорт веществ через мембрану. По нашим данным параметр b50% смещается в сторону изотонических концентраций, а параметр b увеличивается (таблица 3). Ширина зоны гемолиза характеризует степень кооперативности процесса гемолиза. Изменение степени кооперативности процесса гемолиза свидетельствует о нарушении интеграции транспортных процессов через эритроцитарную мембрану.

Таблица 3. Зависимость параметров гемолиза от температуры

3.3 Сравнительный анализ изменения осмотических свойств эритроцитов при изменении температуры и при окислительном стрессе Модифицирование молекул при окислительном стрессе вызывает уменьшение их молекулярной подвижности. Wrobel A. с соавторами наблюдали уменьшение текучести в гидрофобном ядре бислоя мембраны эритроцитов после их обработки пероксинитрит-анионом (рН 7.4). Подвижность молекул уменьшается также при уменьшении температуры. В наших опытах параметр b50% увеличивался при уменьшении температуры в диапазоне температур 5 — 50 ⁰С (Табл. 4). Известно, что при уменьшении температуры в этом диапазоне вязкость эритроцитарных мембран увеличивается.

Действие пероксиазотистой кислоты (концентрация реагентов — 5 мМ) и при одновременном увеличении температуры суспензии с 16 до 37 ⁰С практически компенсирует изменения параметра b50% этими факторами по отдельности. Следовательно, уменьшение осмотической стойкости эритроцитов (увеличение b50%) при обработке эритроцитов пероксиазотистой кислотой в высоких концентрациях связано с уменьшением подвижности молекул мембран эритроцитов.

Параметр b увеличивается при денатурации спектрина (при инкубации суспензии эритроцитов при 50 ⁰С в течение 10 минут), белка цитоскелета эритроцита, выполняющего функцию интегральной взаимосвязи некоторых транспортеров эритроцитарной мембраны, таких как белок полосы 3. Параметр b является чувствительным к низким концентрациям пероксиазотистой кислоты. Известно, что пероксинитрит в низких концентрациях модифицирует некоторые ферменты, ответственные за уровень фосфорилирования белков в эритроците [18], что оказывает специфическое влияние на транспорт воды и ионов через эритроцитарную мембрану. Одновременное действие пероксиазотистой кислоты и температуры (50⁰С), при которой происходит денатурация спектрина, вызывает практически полную потерю характерных для эритроцита осмотических свойств.

Таблица 4. Зависимость параметров гемолиза от температуры

Заключение

1. Выявлено уменьшение осмотической стойкости эритроцитов в суспензии (увеличение параметра b_50%) при уменьшении температуры с физиологической до 5С. При этом форма кривой гемолиза не меняется.

2. Денатурация спектрина при инкубации суспензии эритроцитов при 50С в течение 10−15 минут, вызывает увеличение параметра b, что свидетельствует о нарушении интеграции транспортных процессов через эритроцитарную мембрану.

3. Сравнительный анализ изменений параметров гемолиза при изменении температуры и при окислительном стрессе позволил сделать вывод о том, что активные формы азота и кислорода, образующиеся в системе NaNO₂ и H₂O₂ в закисленных растворах, являются регуляторами осмотических свойств эритроцитов благодаря уменьшению подвижности мембранных молекул, а также благодаря снижению уровня кооперативности процессов транспорта воды и ионов в эритроцитах.

1. Краткая медицинская энциклопедия. Т.2 / Под редакцией А. Н. Покровского.- М.: «Премьера», 1999. 1200 с.

2. Гиперпродукция оксида азота в патофизиологии кровеносных сосудов // Ж.-К. Стокле, Б. Мюлле, Р. Андрианцитохайна, А. Клещев // Биохимия.- 1998. Т. 63, № 7. С. 976−983.

3. Red cell membrane transport in health and disease / Eds. Ingolf Bernhart, J Clive Ellory.- Stringer, 2003. 748 p.

4. Черницкий Е. А., Воробей А. В. Структура и функции эритроцитарных мембран.- Мн.: Наука и техника.- 1981, 216 с.

5. Тоддоов И. Клинико-лабораторные исследования в педиатрии.- М.: Мир.- 1968. 1064 с.

6. Наследственные анемии.// www.cadioline.ru

7. Новиков В. Е. Оценка развития отёка-набухания головного мозга и эффективности его фармакотерапии по гематологическим показателям // www.smolensc.ru/user/sgma/mmorph/n-1-h+l/17/htm

8. Васильева Е. М., Баканов М. И., Гордеева Г. Ф.,. Поддубная А. Е, Шор Т. А Фосфолипидный состав эритроцитов при неврологических нарушениях у детей; влияние сопутствующей патологии // www.surgeon.spb.ru/sno/pirogov/vest/05_pediatria.pat

9. Киеня А. И Физиология жидких сред организма человека.- Гомель.- 2001. 60 с.

10.Аквопорины // http//mglinets/narod/ru/gen/aquoporon.htm.

11. James A. Thomas / Lectures on oxidative stress for students of Iowa state university, Department of Biochemistry and Biophysics.

12.Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом.- М.: Наука.- 1973. 221 с.

13 Газовый обмен и транспорт газов //www.cadioline.ru

14. Nitric oxide diffusion in membranes determined by fluorescence quenching / A. Denicola, J. M. Souza, R. Radi, E. Lissi // Arch. Biochem. Biophys.- 1996. Vol. 328, № 1. P. 208−212.

15. Wrobell A., Ukaszynska B., Kedzeirska I. The effect of peroxynitrite and some antioxidants on the rate of osmotic hemolysis of bovine erythrocytes // Cellular and molecular biology letter.- 2003. № 8. P. 455−460.

16. Starodubtseva M. N., Cherenkevich S. N., Semenkova G. N. Chemiluminescence of acidified solution of sodium nitrite and hydrogen peroxide In: Chemiluminescence at the turn of the millennium: An indispensable tool in modern chemistry, biochemistry and medicine, Schweda-Werbedruck GmbH, Druckerei & Verlag, Dresden, 2001, — P. 76−81.

17. Osmotic hemolysis //www. Medicine.mcgill.ca/physio/vlabioline/bloodlab.

18. Mallozzi, C., Di Stasi, A. M., Minetti, M. // FASEB J. 1997. V. 11. P. 1281−1290.

19. Божок Т. Н. Оценка состояния окислительно-восстановительной системы эритроцитов человека при воздействии активных форм азота.- Курсовая работа, 4 курс.- Гм., 2003 .- 29 c.

20. Божок Т. Н, Стародубцева М. Н. Температурно-концентрационная аналогия изменения осмотических свойств эритроцитов при окислительном стрессе и низких температурах. // «Христианство и медицина» Материалы II Белорусско-Американской научно практической конференци врачей и 14-й научной сессии Гомеоьского государственного медицинского университета, посвященных 18-летию Чернобыльской катастрофы.