В последние годы грибы находят все большее применение в самых разных областях деятельности человека. Однако, на данный момент хорошо изучены свойства только небольшого количества известных видов. В связи с этим необходимо как детальное изучение биологии используемых человеком видов, так и поиск новых полезных свойств других грибов. Несмотря на то, что ферменты грибов давно уже широко используются в промышленности, постоянно обнаруживаются новые свойства известных ферментов, а так же выделяются новые продуценты. (Archer, Peberdy, 1997). Грибы рода Trichoderma в настоящее время находят, пожалуй, наиболее разнообразное применение в промышленности и сельском хозяйстве.
Изучение видов Trichoderma представляет большой практический и теоретический интерес в связи с их использованием в деятельности человека. Широкое применение этих грибов требует детального изучения их экологических особенностей, видового разнообразия, биотопического распределения, конкурентных взаимоотношений и географического распространения.
Грибы этого рода широко распространены в природе и встречаются на многих субстратах, но чаще в почве и на мертвой древесине. Они играют ключевую роль в сообществе микроорганизмов (Салина, 1981; Smith, 1995; Великанов, 1997) и применяются во многих областях человеческой деятельности. Виды этого рода используются для получения целлюлозолитических и некоторых других ферментов, для биологического контроля болезней растений и биологической очистке почвы (Samuels, 1996).
В последние годы систематика этого таксона вызывает много споров, вызванных как пересмотром концепции рода, так и описанием большого числа новых видов. Параллельно с морфологическим подходом, в последнее время активно развиваются различные макромолекулярные методы систематики этого рода, которые позволяют доказать связь анаморфы с телеоморфой и дают новый подход к системе этого рода. На данный момент описано около 200 видов Нуросгеа, и около половины из них имеет анаморфу относящуюся к роду Trichoderma. (Samuels, 1996; Rossman, Samuels, 1999). Из этого можно предположить, что существует, по крайней мере, 100 естественных видов Trichoderma, но возможно их еще больше, поскольку клоны потерявшие способность к половому размножению могут эволюционировать самостоятельно (Горленко, 1979; Samuels, 1996; Дьяков, 1993, 1999).
Представление о таксономии этого рода не соответствует все более расширяющемуся количеству сторон использования видов Trichoderma человеком. Успешная работа биотехнологов, фитопатологов и медицинского персонала с видами этого рода невозможна без их точной идентификации (Samuels, 1996; Esposito, Dasilva, 1998). Классификация грибов используемых для биоконтроля и биотехнологии очень важна в практическом отношении. Но создание приемлемой системы для рода Trichoderma затруднено неясностью морфологических признаков и не всегда известной связью с телеоморфой. Накопление макромолекулярных данных помогает в решении этих проблем, но пока еще остается много неясных вопросов (Samson, 1995).
В результате современных исследований многие из агрегатов видов, описанных Rifai (1969), разбиты на отдельные виды и на данный момент известно 29 видов рода Trichoderma. Но определение их довольно сложно в первую очередь из-за отсутствия единого ключа ко всему роду, а не только к отдельным его группам (Bissett, 1991 bSamuels et al., 1998; Samuels et all., 1999).
Грибы рода Trichoderma являются активными целлюлозолитиками и хитинолитиками, поэтому их используют для получения ферментов, разрушающих хитин, целлюлозу, лигнин и пектин, которые применяются в целлюлозно-бумажной, пищевой, топливной промышленности, при производстве спирта, а также в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях (Archer, Peberdy, 1997). Их также используют для производства кормового белка. Кроме того, из них получают биологически активные вещества, в том числе некоторые антибиотики и токсины (пептаиболы, циклоспорины) (Samuels, 1996; Ghisalberti, Sivasithamparam, 1991).
Способность разрушать хлорорганические вещества и различные пестициды, гербициды и инсектициды, а также полиэтилен и некоторые пластмассы открывают возможность для использования с помощью биоочистки загрязненных почв и в переработке отходов (Esposito, Dasilva, 1998).
Грибы этого рода являются удобным объектом для биохимических физиологических и генетических исследований. Физиология этого рода активно изучается на примере вида Т. reesei E.G. Simmons, который является модельным объектом для биохимических, генетических и физиологических исследований.
Кроме положительных, с точки зрения человека свойств, она имеет и несколько отрицательных. Так Trichoderma наносит сильный ущерб при коммерческом выращивании грибов, таких как шампиньоны, шии-таке и вешенка, развиваясь на субстрате или поражая плодовые тела (Castle et al., 1998; Tokimoto et al., 1998; Muthumeenakshi et al., 1998).
В ряде случаев Trichoderma может представлять опасность для здоровья неловка. Так, в недавнее время выяснилось, что она вызывает глубокие микозы у людей с подавленным иммунитетом, в основном у пациентов, перенесших пересадку органов (Munoz et al., 1997). А также может быть потенциальным аллергеном, особенно для работников лесопилок и деревообрабатывающих комбинатов (Halpin et al., 1994).
Грибы этого рода образуют одни из наиболее сильных известных грибных токсинов, таких как виридин, глиотоксин, триховиридин, дермадин, аламетицин, трихополины и могут являться причиной токсикозов почв.
Способность подавлять рост и развитие других грибов, а также паразитировать на них, поражая гифы и склероции, вместе с неспособностью поражать живые растения, используется в сельском хозяйстве для биологического контроля паразитов растений. Препараты на основе видов рода Trichoderma используются для защиты растений от широкого круга болезней, вызванных грибами, а также почвенных нематод, как в теплицах, так и в открытом грунте, а также для стимуляции роста и развития растений. Сейчас существует несколько коммерческих препаратов на основе разных видов рода Trichoderma, и активно разрабатываются новые преимущественно комплексные средства защиты растений (Сидорова, 1980; Chet, Inbar, 1994; Великанов, 1997). В нашей стране широко применяется препарат «Триходермин» на основе активных штаммов Trichoderma, получаемый путем культивирования этих грибов на различных растительных отходах, как в биологических лабораториях, так и непосредственно в хозяйствах (Федоринчик и др., 1974; Бадяй, 1984).
Химический метод защиты растений давно критикуется как небезопасный для окружающей среды. Напротив, биологический метод считается экологически чистым (Великанов, Сидорова, 1988; Baker, 1991; Lynch, Crook, 1992; Chet, Inbar, 1994). Однако интродукция в сообщество сильных неспецифических конкурентов влияет не только на паразитов растений, но и на организмы не мишени, что может привести к нарушению равновесия в биоценозе. При использовании Trichoderma для защиты растений не было исследовано ее влияние на сапротрофную почвенную биоту.
Исследования, посвященные этой теме, отсутствуют, хотя существуют указания на то, что каждый микробиологический препарат должен проходить такую же длительную проверку экологической безопасности, как и химические средства защиты растений (Филиппов, Кузнецова, 1994; Cook et al., 1996). В связи с этим одной из целей нашей работы было определить влияние интродуцированного в почву антагониста на микобиоту на примере активного штамма Trichoderma harziamim Rifai, использующегося для защиты картофеля от Rhizoctonia solani Kuhn.
Хотя работ по применению видов Trichoderma довольно много, их изученность в природе явно недостаточна. Видовой состав и распространение этого рода гифомицетов в России изучены не полно. Г. Ш. Сейкетов (1982), занимаясь этим вопросом, использовал систему, в которой Trichoderma делится только на пять видов. Другие исследователи пользовались более современной и общепринятой системой, введенной индонезийским микологом Rifai (1969), но их исследования были ограничены определенной территорией (Шарова, 1983; Салина, 1988; Курини, 1991). Кроме того, и эта система на данный момент устарела, так как сейчас описаны новые виды, большинство из которых встречаются довольно широко (Turovzi et al., 1994; Samuels et all., 1999). Нечеткая морфология этого рода и отсутствие доступных ключей затрудняет определение видов, в связи с этим их распространение в России не изучалось, что и представляет новизну данной работы.
Вместе с тем, существует путаница с названиями из-за того, что в разных работах в основном по практическому применению использовались разные таксономические системы. Это затрудняет исследования этого рода, так как не всегда ясно о каком виде идет речь (Шарова, 1981; Сидорова, 1980).
Таким образом, ОДНОЙ ЦЕЛЬЮ настоящей работы стало изучение разнообразия и распространения грибов рода Trichoderma в нашей стране с учетом новой систематической концепции. ДРУГОЙ ЦЕЛЬЮ была оценка влияния Trichoderma на сапротрофную почвенную микобиоту при ее интродукции в агроэкосистему.
Для достижения этих целей нами были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
1. Изучить видовое разнообразие рода Trichoderma на территории России, принимая во внимание описанные новых видов;
2. Проанализировать географическое распространение видов этого рода в различных географических областях;
3. Сравнить морфологию изолятов, которые были получены из разных географических регионов;
4. Оценить значение различных морфологических признаков для идентификации видов рода Trichoderma;
5. Составить ключ для определения всех описанных на данный момент видов;
6. Найти телеоморфные стадии некоторых видов рода Trichoderma в природе и посмотреть их распространениемикромицетов, не являющихся: шю равновесия в сообществе цессов. и ключей для определения всех.
7. Составить коллекцию, которая в последствии может быть использована для поиска активных штаммов для биоконтроля и продуцентов биологически активных веществ;
8. Оценить выживаемость Т. Ьагггапит в окультуренной почве опытного поля Звенигородской биостанции МГУ.
9. Определить влияние широко используемого для защиты растений вида Т. Иагг1апит на сапротрофную почвенную микобиоту.
Научная новизна результатов исследования состоит в подробном изучении распространения видов рода Тпскоёегта по территории России, обнаружении 14 видов ранее не отмеченных для России, выявлении совершенной стадии трех видов, ранее не описанных на территории России. Впервые показано, что риологические методы защиты растений могут иметь отрицательные экологически^ последствия: интродукция антагониста приводит к изменению структуры комплекса мишенью биоконтроля, что может привести к наруше: почвенных организмов, а также почвообразовательных прс ].
Практическое значение работы состоит в составлена ] описанных на данный момент видов. Так же собрана большая коллекции изолятов (726), которые могут быть использованы в практических це-ях (пять штаммов переданы в коллекцию промышленных микроорганизмов при Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов).
В основу работы положен материал, собранный в период с 1994 по 1999 годы собранный в 24 регионах России и некоторых других государств.
Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета МГУ. Полевой эксперимент проведен на Звенигородской биостанции МГУ.
Я сердечно благодарю сотрудников, студентов и аспирантов кафедры микологии и альгологии МГУ, оказавших мне неоценимую помощь в сборе, материала. Особую благодарность автор выражает Л. Л. Великанову и И. И. Сидоровой, под непосредственным руководством которых была выполнена данная работа.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаборатории сенсорных систем ИППИ РАН за предоставленную возможность обработки образцов на микроскопе и помощь в подготовке иллюстративного материала.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ (проект № 98−04−488 813).
9. Выводы.
1. В результате исследования на территории России и сопредельных государств нами было обнаружено 24 вида из рода Trichoderma. 14 из них ранее не были отмечены в России.
2. На Дальнем востоке чаще встречались виды: Т. viride, Т. harzianum, Т. virens, а также виды группы Т. hamatum aggr. sensu Rifai. В центральной части России преобладают: Т. viride, Т. citrinoviride, Т. polysporiim, виды группы Т. hamatum aggr. и Т. atroviride. В южных областях чаще выделялись Т. asperellum, Т. koningii, Т. longibrachiatum, Т. atroviride и Т. harzianum.
3. Разные виды предпочитают разные субстраты, так Т. viride вместе с телеоморфой Hypocrea rufa, а также Т. citrinoviride вместе с Я schweinitzii предпочитают древесину. Напротив виды группы Т. hamatum agrr., Т. koningii, Т. virens, Т. asperellum и Т. aureoviride чаше встречаются в почве. Т. saturnisporum также обнаружена в почве. Виды Т. atroviride, Т. polysporum и Т. longibrachiatum предпочитали почву и плодовые тела грибов, причем в почве они встречались немного чаще. А Т. harzianum обитала преимущественно на плодовых телах грибов.
4. Виды рода Trichoderma способны жить практически на любой древесине, но наибольшее количество изолятов обнаружено на древесине березы и ольхи. Древесину или кору других пород деревьев грибы этого рода заселяют реже.
5. В различных типах леса обилие грибов рода Trichoderma в почве, как правило, не связано с численностью и видовым составом этого рода на древесине. Так в различных типах ельников Тверской области Trichoderma на древесине встречается крайне редко, в то время как в почве этот род широко представлен и обилен. В осиннике и особенно ольшанике, наоборот, большее разнообразие и обилие видов представлено на древесине, чем в почве.
6. На Камчатке в вулканических слоисто-пепловых почвах частота встречаемости видов рода Trichoderma довольно высока. На участках, не измененных поствулканической и гидротермальной деятельностью, встречаются виды характерные для этой климатической зоны, а в пределах термальных площадок обитают виды характерные для более южных регионов.
7. Популяции наиболее частых и изменчивых видов: Т. viride, Т. citrinoviride и Т. koningii из географически отдаленных регионов имеют достоверные отличия в размере конидий. У Т. harzianum отличается только популяция из Томской области. Изоляты видов Т. hamatum и Т. polysporum из Тверской и Московской области достоверно не отличаются.
8. Найдены три вида рода Нуросгеа, имеющие анаморфы относящиеся к роду Trichoderma.
9. Для идентификации грибов рода Trichoderma важен комплекс всех морфологических признаков, причем наиболее устойчивыми являются характеристики конидий и строение макроконидиеносцев.
10. При искусственном внесении Т. harzianum сохранялась в почве в течение двух лет и оказывала заметное подавляющее влияние на Rhizoctonia solani. Таким образом, Т. harzianum может быть использована в качестве агента биоконтроля.
11. Интродукция Trichoderma приводит к изменению структуры комплекса почвенных микромицетов и сокращению их видового разнообразия.
8.
Заключение
.
Проделанная работа подтвердила широкое распространение видов рода Trichoderma в почве и на других субстратах во всех географических зонах России. Обнаружено большинство описанных на данный момент видов — 22 из 29. Два не идентифицированных, возможно будут описаны как новые, если дальнейшие исследования с использованием макромолекулярных методов не покажут их близость к уже описанным видам.
На исследованной территории не было встречено 7 из всех известных видов. Распространение трех из них: Т. pseudokoningii, Т. reesei и Т. konilangbra, по-видимому, ограничено австралийским регионом или тропическими областями (Samuels et al., 1998). Другие четыре, по литературным данным, встречаются крайне редко и, возможно, не были выявлены.
Т. pilluliferum, описанная как анаморфа Hypocrea pillulifera (Webster, Rifai, 1968), упоминается в работах, посвященных видовому разнообразию грибов крайне редко (Sampo et al., 1997). Возможно, была находка этого вида на Звенигородской биостанции (Великанов и др., 1999), но, к сожалению, материала подтверждающего это не сохранилось. В крупных коллекциях грибов изолятов этого гриба тоже не много. Так, например, Bissett (1991b) не смог дать свое описание этого вида, так как хранящиеся в коллекции культуры потеряли способность к спороношению, а новых находок в его распоряжении не было. Т. ghanense, Т. fasciculatum и Т. flavofitscum тоже редко упоминаются в работах по распространению грибов.
Чаще всего встречались Т. viride и Т. citrinoviride. Чуть режеТ. hamatum, Т. koningii и Т. harzianum. Еще немного реже — Т. longibrachiatum, Т. atroviride, Т. asperellum и Т. polysporum, но их все равно можно отнести к частым видам. Таким образом большая часть описанных Rifai (1969) видов, кроме трех: Т. aureoviride и Т. pilluliferum, встречаются часто. Широко распространенный вид Т. citrinoviride, описанный относительно недавно (Bissett, 1984), по-видимому, идентифицировался как Т. pseudokoningii или Т. koningii по системе Rifai, что подтверждается переопределением хранящегося в коллекции материала (Kuhls et al., 1997).
В нашей работе подтверждено указание некоторых авторов, что Т. viride, Т. hamatum aggr Т. citrinoviride и Т. polysporum, чаше встречаются в регионах с умеренным климатом, а Т. longibrachiatum в районах с более аридным. Т. harzianum, Т. virens и Т. koningii встречаются везде (Danielson, Daney, 1973; Wicklow, Whittingham,.
1978; Samuels, et al., 1998). Однако из этого правила полно исключений и, видимо, определяющее значение для распространения этих грибов имеют конкретные условия микроместообитания.
Отношение разных видов к субстрату тоже не одинаковое, так Т. viride вместе с телеоморфой Hypocrea rufa, а также Т. citrinoviride вместе с Н. schweinitzii предпочитают древесину. Напротив виды группы Т. hamatum aggr., Т. koningii, Т. virens, Т. asperellum и Т. aureoviride чаше встречаются в почве. А Т. harzianum предпочитает преимущественно плодовые тела грибов. В условиях нашей климатической зоны виды рода Trichoderma отдают предпочтение древесине лиственных пород, особенно березы и ольхи.
Удаленные географически популяции наиболее распространенных и изменчивых видов показали достоверные отличия друг от друга по среднему размеру конидий. Этот признак был выбран для сравнения, так как он наиболее устойчив и почти не зависит от условий выращивания и состояния культуры.
В центре европейской части России найдена телеоморфная стадия Т. virideHypocrea rufa, и Т. citrinoviride — Н. schweinitzii, а также не идентифицированный вид Hypocrea sp., с анаморфой относящейся к Trichoderma секции Pachybasium и близкой к Т. harzianum. Оказалось, что формирование совершенной стадии этими видами рода Trichoderma в природе, не такое уж редкое явление. Однако в культуре телеоморфная стадия была получена только для тропического вида Н. poronioidea (Rossman, 1996).
На основе собранного материала и литературных данных составлен ключ для определения видов этого рода. А также показано, что размер и форма спор и строение макроконидиеносцев наиболее значимые признаки видов рода Trichoderma, но при определении необходимо учитывать весь комплекс признаков.
При оценке влияния интродуцента, используемого для защиты растений, на сапротрофные микромицеты, не являющиеся мишенью биоконтроля, нами показано, что Т. harzianum может сохраняться в почве до двух лет и в течение этого срока оказывает заметное влияние на почвенную биоту. В этом эксперименте штамм выживал несколько дольше, чем описано в других работах (Papavizas, 1985). Возможно, это связано с тем, что виды рода Trichoderma широко распространены в почвах Подмосковья и условия для них благоприятны (Великанов и др., 1999).
