Клиническая значимость оценки мутационного статуса генов тирозинкиназ и факторов транскрипции при миелопролиферативных заболеваниях

Острый миелобластный лейкоз (OMJI) — это гетерогенная группа опухолевых заболеваний, характеризующаяся неконтролируемой пролиферацией клона лейкемических клеток-предшественниц с блокированным на различных стадиях процессом миелоидной дифференцировки. Клинически это проявляется такими признаками повреждения нормального гемопоэза, как нейтропения, анемия и тромбоцитопения (Testa U. et al., 2007).

Действующая классификация Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) описывает достаточно большой пул нозологий, относящихся к OMJI (Schouten Н.С., 2007). На основании стандартного цитогенетического исследования бластных клеток были выявлены следующие основные патогномоничные транслокации: t (15−17), inv (16), t (8−21), -7, inv (3) и т. д. Все они являются клинически значимыми не только для постановки диагноза, но и для оценки степени риска развития рецидива и прогнозирования продолжительности выживаемости (Mrozek К. et al., 2008). Так первые три генетические аберрации относятся к благоприятным признакам течения заболевания, а две другие, наоборот, указывают на неблагоприятный прогноз (Arthur D.C. et al., 1989).

Однако серьезной проблемой прогнозирования течения OMJI является тот факт, что данные цитогенетические нарушения выявляются только у 40−50% взрослых пациентов и, примерно, у 25% в группе больных детей (Mrozek К. et al., 2004). Таким образом, формируется достаточно большая группа пациентов с нормальным кариотипом и так называемым средним (intermediate) риском рецидива заболевания.

В настоящее время данная проблема решается при помощи исследования мутационного и экспрессионного статуса различных генов. К ним относятся гены тирозинкиназ (FLT3), ядерных факторов (NPM1), факторов транскрипции (MLL, СЕВРА, ERG) и других (BAALC) (Reindl С. et al., 2006; Schnittger S. et al., 2002; Schoch C. et al., 2005; Verhaak R.G. et а1., 2005). Однако, если клиническая значимость генов БЬТЗ и МЬЬ уже определена, то в отношении остальньгс генов она требует более детального изучения. Кроме того, на наш взгляд недостаточно изучена клиническая значимость сочетанных поражений указанных генетических структур.

Приведенные данные указывают на актуальность заявляемой работы, в которой будет проведена комплексная молекулярно-генетическая оценка функционального состояния генов, участвующих в патогенезе острого миелобластного лейкоза без цитогенетических нарушений. На основании этого будут разработаны рекомендации по клиническому использованию данной методики для оценки течения заболевания, степени риска развития рецидива и оптимального подбора эффективной терапии.

Цель работы: Обосновать и разработать информативную систему комплексной молекулярно-генетической оценки функционального состояния генов, участвующих в патогенезе острого миелобластного лейкоза.

Задачи исследования:

1. Изучить встречаемость и диагностическую значимость мутационного повреждения генов БЬТЗ и ЫРМ1 у пациентов с острым мие л областным лейкозом.

2. Изучить значимость уровней экспрессии генов ВААЬС и СЕВРА для диагностики острого миелобластного лейкоза.

3. Изучить клиническую значимость сочетанных повреждений генов ЫРМ1, БЬТЗ, ВААЬС и СЕВРА у пациентов с острым миелобластным лейкозом.

4. Разработать диагностическую тест-систему для комплексной молекулярно-генетической оценки функционального состояния генов, участвующих в патогенезе острого миелобластного лейкоза, проанализировать эффективность данной тест-системы и внедрить ее в клиническую практику.

Научная новизна и личный вклад в науку.

Впервые на молекулярно-генетическом уровне с помощью разработанного полуколичественного метода у пациентов с острым миелобластным лейкозом до начала лечения проведена оценка уровней экспрессии генов ВААЬС и СЕВРА. Показано, что значения исследованных генетических маркеров при ОМЛ достоверно отличаются не только от значений в группе контроля (доноры), но и от значений пациентов группы сравнения (ОЛЛ). Установлено, что средний уровень экспрессии гена ВААЬС имеет нисходящий тренд в зависимости от типа ОМЛ (от МО до Мб), а экспрессия гена СЕВРА наоборот увеличивается. Также показано, что уровень экспрессии гена СЕВРА зависит от наличия у пациентов с ОМЛ внутренней тандемной дупликации (ВТД) в гене БЬТЗ и наличием мутации в гене МРМ1. На основании оценки уровня экспрессии исследуемых генов можно получить дополнительную прогностически значимую информацию о варианте ОМЛ.

Практическая значимость.

Достоверное повышение уровня экспрессии гена ВААЬС и снижение активности гена СЕВРА по сравнению с контрольной группой (доноры) являются достоверными диагностическими маркерами наличия у пациентов ОМЛ, особенно в случаях, когда у этих пациентов не выявляются какие-либо цитогенетические изменения.

Понижение экспрессии гена СЕВРА статистически значимо коррелирует с наличием ВТД в гене БЬТЗ по сравнению с пациентами без подобной мутации.

Таким образом, использование разработанной тест-системы для оценки мутационного и экспрессионного статуса исследуемых генов у пациентов с ОМЛ с отсутствием цитогенетических перестроек может служить дополнительным диагностическим критерием при постановке диагноза ОМЛ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показана диагностическая значимость выявления мутаций в гене FLT3 (ВТД и D835Y) и гене NPM1 у пациентов с острым миелобластным лейкозом.

2. Повышенный уровень экспрессии гена BAALC достоверно определяется у пациентов с острым миелобластным лейкозом, по сравнению с пациентами с острым лимфобластным лейкозом и группой контроля (доноры).

3. Супрессия активности гена СЕВРА достоверно определяется у пациентов с острым миелобластным лейкозом, по сравнению с контрольной группой (доноры).

4. Установлено, что наличие изолированных и сочетанных мутаций в генах FLT3 и NPM1 не связаны с изменением экспрессии гена BAALC, в то время как мутации в этих генах, особенно сочетанные, связаны с изменениями экспрессии гена СЕВРА.

Внедрение результатов исследования.

Результаты работы внедрены в практику лечебной работы СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова и городской поликлиники № 31, а так же используются для обучения студентов и курсантов факультета последипломного образования кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова.

Апробация диссертации и публикации.

Материалы диссертации доложены на конференции с международным участием «Modern trends in human leukemia» (Вильзеде, Германия, 2008), конференции с международным участием «Modern Trends in Human Leukemia and Cancer» (Гамбург, Германия, 2010) — 6-ом симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2009), 3-ем мемориальном конгрессе имени P.M. Горбачевой «Трансплантация гематопоэтических клеток» (Санкт-Петербург, 2009) — научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете концепции здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009 г).

По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 в реферируемых ВАК журналах и 6 в иностранных журналах.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методик, главы результатов собственных исследований, заключения и выводов. Текст диссертации изложен на 97 страницах стандартной печати, цифровой материал представлен в 8 таблицах, работа иллюстрирована 26 рисунками. Указатель литературы содержит 125 ссылок на публикации отечественных и зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ.

1. Мутации Б835У и ВТД в гене БЬТЗ и мутации типа «А» и «В» в гене 1МРМ1 являются важными диагностическими маркерами патогенетических механизмов при остром миелобластном лейкозом, особенно в случаях, когда цитогенетические изменения не выявляются стандартными методиками.

2. Уровень экспрессии гена ВААЬС достоверно повышен (Р<0,01) у пациентов с острым миелобластным лейкозом по сравнению с пациентами с острым лимфобластным лейкозом и донорами.

3. Уровень экспрессии гена СЕВРА достоверно снижен (Р<0,05) у пациентов с острым миелобластным лейкозом по сравнению с группой доноров.

4. Наличие изолированных и сочетанных мутаций в генах БЬТЗ и ЫРМ1 не связано с модуляцией экспрессии гена ВААЬС у пациентов с острым миелобластным лейкозом.

5. Наличие у пациентов с острым миелобластным лейкозом внутренних тандемных дупликаций в гене РЬТЗ достоверно связано с 2-х кратным увеличением супрессии гена СЕВРА, а отсутствие этого типа мутаций, сочетающееся с наличием нормального гена КРМ1, наоборот коррелирует с активацией гена СЕВРА.

6. Использование при первичной диагностике острого миелобластного лейкоза диагностической тест-системы, учитывающей мутационные повреждения генов КРМ1 и ГЬТЗ и экспрессионный статус генов ВААЬС и СЕВРА, может служить для дополнительной диагностики данного заболевания, особенно в случаях, когда у пациентов при стандартных методиках не выявляются цитогенетические нарушения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Острый миелобластный лейкоз — злокачественное заболевание системы крови, которое характеризуется многообразием клинической картины. Это многообразие объясняется большим числом молекулярно-генетических механизмов, которые включены в патогенез ОМЛ.

К наиболее изученным механизмам патогенеза ОМЛ относятся формирование в клетках опухоли транслокаций. Обмен смысловыми и/или промоторными последовательностями генов, расположенных на одной или разных хромосомах приводит либо к формированию нового белкового продукта («химерного белка»), либо к изменению экспрессии смыслового гена. Клинически значимыми такие повреждения генетического аппарата становятся, если вновь сформированный ген содержит все структурные области (промотор, экзоны, интроны, терминаторы и т. д.), а «химерный белок» имеет возможность запускать процессы жизнедеятельности клетки-мишени. Это приводит к изменению пролиферативной и дифференцировочной способности клеток, а так же их чувствительности к внешним регуляторным факторам. Например, транслокация 1:(15- 17)^22²¹) формирует химерный ген РМЬ-КАЯА. «Химерный белок» РМЬ-ЯАКА ассоциирован с подавляющим числом случаев острого промиелоцитарного лейкоза (ОПмЛ).

Другие примеры — транслокация 1:(8−21)(я22²²), которая является наиболее общей абберацией для ОМЛ, 1(9- 11)(р22-ц23), затрагивающая гены МЬЬ и АР9, дупликация гена М1Х и т. д. Ввиду высокой специфичности данных транслокаций для ОМЛ, определение цитогенетических аббераций используются для первичной диагностики ОМЛ.

Альтернативным путем диагностики ОМЛ, особенно в случаях, когда у пациента при рутинном обследовании не выявляются цитогенетические нарушения, безусловно, является поиск мутаций в генах, включенных в патогенез заболевания. К таким, наиболее клинически значимым генам относятся БЬТЗ и №М1. Их роль в диагностике и прогнозе течения заболевания общепризнана. На этом основании исследование структуры указанных генов включено как обязательный критерий диагностики ОМЛ в классификацию ВОЗ 2008 года. Тем не менее, мы посчитали необходимым включить детекцию мутаций типа ВТД и Б835У гена ГЬТЗ и мутаций типа «А» и «В» гена КРМ1 в наше исследование. Этому были две основные причины.

С одной стороны, данное исследование было посвящено разработке клинико-лабораторной панели для комплексной диагностики ОМЛ. Использованные методики разрабатывались автором и получение экспериментальных данных по встречаемости указанных мутаций, сопоставимых с литературными, служило залогом ликвидности выбранной методологии.

С другой стороны, данные по встречаемости мутаций в генах БЬТЗ и №М1 в обследуемой выборке, использовались нами в плане оценки их возможной связи с различным уровнем экспрессии генов ВААЬС и СЕВРА.

Интерес к гену СЕВРА у различных авторов неслучаен. Это подтверждается высокой диагностической значимостью выявления ряда мутаций в данном гене. Работ же по исследованию экспрессионного анализа гена СЕВРА немного. Принято считать, что в гемопоэзе белок СЕВРА крайне важен на ранних стадиях миелоидной дифференцировки. Однако механизм его участия остается до конца неясным. Нами было показано, что ген СЕВРА в лейкоцитах периферической крови больных с ОМЛ находится в крайне супрессированном состоянии. Причем уровень супрессии достоверно отличается не только от контрольной группы, но и от пациентов группы сравнения — ОЛЛ. Этот феномен нам кажется крайне важным, так как дает дополнительную возможность повышения достоверности диагностического процесса.

Литературных,., данных, по .&bdquo-функционированию гена ВААЬС применительно к гемопоэзу недостаточно. По мнению большинства авторов, повышенный уровень экспрессии этого гена маркирует предшественников нейральных и гемопоэтических клеток. Однако сведения об уровнях активации гена ВААЬС, например, у пациентов с лейкозами по сравнению с донорами разнятся от нескольких десятков до нескольких сотен раз. Проведенное нами исследование показало, что повышенный уровень гена достоверно маркировал пациентов с ОМЛ, по сравнению с донорской группой. Этим мы хотели бы подчеркнуть диагностическую значимость гена ВААЬС.

Немаловажным направлением работы стало выявление и характеристика факта связи мутационного процесса в генах РЬТЗ и ЫРМ1 с изменением уровней экспрессии генов ВААЬС и СЕВРА. Конечно, мы не ставили задачу по выявлению прямой модуляции выработки мРНК мутированными генами. В наши задачи входило описание данного феномена и оценка его клинической достоверности. Так было показано, что уровни экспрессии гена ВААЬС не связаны с наличием или отсутствием мутационного поражения генов РЬТЗ и №N11. Напротив, наличие у пациентов с ОМЛ мутации типа ВТД гена РЬТЗ было достоверно связано со снижением экспрессии гена СЕВРА. Учитывая тот факт, что мутация гена РЬТЗ связана не только с наличием ОМЛ, но и с неблагоприятным прогнозом течения заболевания, можно предположить, что пониженный уровень экспрессии гена СЕВРА может являться неблагоприятным прогностическим критерием. Справедливость этой гипотезы будет исследована нами в дальнейшем.

Небезынтересен факт инверсии экспрессии гена СЕВРА в случаях, отсутствия мутаций в гене ЫРМ1 и ВТД гена РЬТЗ. Дело в том, что факт отсутствия мутации в гене ЫРМ1 описан как неблагоприятный фактор прогноза течения ОМЛ, а отсутствие мутации в гене РЬТЗ, так же как и феномен увеличения экспрессии гена СЕВРА расценивается как благоприятный. Таким образом, эти три гена формируют своеобразный «прогностический треугольник», позволяющий формировать группы повышенного риска рецидива ОМЛ. Хотя выявленный феномен и не имел четких статистических подтверждений (Р=0,07), в дальнейших работах он будет нами изучен более детально.

Подводя итог проделанной работе можно заключить, что диагностика ОМЛ, как многогранного с точки зрения молекулярной генетики заболевания, требует получения крайне достоверной информации о состоянии и функционировании многих генетических систем, а разработанный и апробированный алгоритм может служить хорошим дополнительным инструментом в диагностике ОМЛ.

Большинство используемых в настоящее время способов диагностики острого миелобластного лейкоза основываются на общепринятых рекомендациях ФАБ-классификации 1989 года и классификации ВОЗ от 2008 года. Крайне важной на наш взгляд особенностью последней классификации является факт активного внедрения в диагностический процесс методов, основанных на выявлении молекулярно-генетических характеристик опухолевого клона клеток. К ним относятся транслокации, выявляемые рутинными цитогенетическими методами, а так же мутации в некоторых генах, диагностическая ценность которых не вызывает сомнения. Однако гетерогенность ОМЛ столь высока, что формируется достаточно большое количество пациентов, чей диагноз, а, стало быть, и прогноз течения заболевания остается неясным. Таким образом, поиск новых достоверных генетических маркеров, пригодных для диагностики ОМЛ, остается крайне актуальным.

В результате проведенного исследования нам удалось разработать диагностическую систему для оценки патогенетических механизмов ОМЛ у пациентов с отсутствием цитогенетических поломок. Данная система была разработана с использованием отечественных реактивов и оборудования для детекции различных типов мутаций в генах БЬТЗ и.

КРМ1, а так же для оценки уровней относительной экспрессии генов ВААЬС и СЕВРА.

Нами было показано, что различные типы мутаций в генах РЬТЗ и КРМ1 у пациентов с острым миелобластным лейкозом являются важными самостоятельными диагностическими маркерами. Повышенный уровень экспрессии гена ВААЬС, выявляемый в лейкоцитах периферической крови достоверно маркирует пациентов с острым миелобластным лейкозом.

Данные по оценке активности гена СЕВРА показали, что это исследование может служить самостоятельным диагностическим маркером ОМЛ, однако проводимая вместе с этим оценка мутационной активности генов РЬТЗ и ЫРМ1, безусловно увеличивает диагностическую значимость.

Таким образом, использование при первичной диагностике острого миелобластного лейкоза системы, учитывающей мутационные повреждения генов 1МРМ1 и РЬТЗ и экспрессионный статус генов ВААЬС и СЕВРА, может служить дополнительным механизмом для верификации данного заболевания, особенно в случаях, когда при стандартных методиках не выявляются цитогенетические нарушения.