Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Идентификация возбудителя гистоплазмоза на основе полимеразной цепной реакции

Диссертация: Идентификация возбудителя гистоплазмоза на основе полимеразной цепной реакции
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

На основе зарубежных литературных источников и компьютерной базы данных Gen Bank были подобраны праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза. Первоначально с этой целью были исследованы несколько пар олигонуклеотидных праймеров на основе генов факторов вирулентности и уникальных структурных компонентов H.capsulatum. В качестве мишеней для отжига праймеров мы использовали различные гены… Читать ещё >

Идентификация возбудителя гистоплазмоза на основе полимеразной цепной реакции (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Таксономическое положение и характеристика основных 14 биологических свойств Histoplasma capsulatum
    • 1. 2. Эпидемиология возбудителя гистоплазмоза
    • 1. 3. Методы лабораторной диагностики гистоплазмоза
  • СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе
    • 2. 2. Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов
    • 2. 3. Обеззараживание материала, содержащего патогенные 45 микромицеты
    • 2. 4. Подготовка проб для постановки реакции амплификации
    • 2. 5. Методы выделения ДНК
    • 2. 6. Выбор и синтез олигонуклеотидных праймеров
    • 2. 7. Постановка полимеразной цепной реакции
    • 2. 8. Секвенирование продуктов амплификации
    • 2. 9. Проведение электрофореза и детекция продуктов амплификации
    • 2. 10. Заражение лабораторных животных 51 2.11 .Статистическая обработка данных
  • ГЛАВА 3. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ПАРАМЕТРОВ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА
    • 3. 1. Анализ нуклеотидных последовательностей и конструирование 53 группоспецифических праймеров
    • 3. 2. Подбор оптимальных условий для постановки полимеразной 56 цепной реакции
  • ГЛАВА 4. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА
    • 4. 1. Подготовка проб и выделение ДНК из чистых культур возбудителя 64 гистоплазмоза для проведения ПЦР
    • 4. 2. Выделение ДНК возбудителя гистоплазмоза из искусственно 69 контаминированных проб
  • ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫБРАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ПРИ АНАЛИЗЕ ГОМОЛОГИЧНЫХ И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ШТАММОВ МИКРОМИЦЕТОВ, А ТАКЖЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИСТОПЛАЗМОЗЕ
    • 5. 1. Определение аналитической чувствительности и специфичности 74 выбранных олигонуклеотидных затравок при исследовании чистых культур различных штаммов Н. capsulatum и гетерологичных микроорганизмов
    • 5. 2. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения 82 возбудителя гистоплазмоза при экспериментальной инфекции

Histoplasma capsulatum — диморфный микромицет, возбудитель тяжелого инфекционного заболевания — гистоплазмоза. В настоящее время выделяют: H. capsulatum var. capsulatum — возбудитель классического (американского) гистоплазмоза, высокоэндемичные очаги которого расположены вдоль реки Миссисипи (США) и H. capsulatum var. duboisii — возбудитель африканского гистоплазмоза, распространенного в странах Центральной и Западной Африки [72, 73]. В последнее время гистоплазмоз зарегистрирован в ряде штатов США, странах Латинской Америки [69, 91, 93, 106, 131], а также многих азиатских странах, таких как Индонезия, Тайланд, Индия [68, 104].

Еще один вариант Н. capsulatum var. farciminosum — возбудитель эпизоотического лимфангоита у лошадей, ослов, мулов. Возбудитель широко распространен в Европе, Северной Африке, Индии и Южной Азии. В патологии людей какого-либо существенного значения не имеет [28, 92]. Более того, первоначально данный вариант Н. capsulatum, рассматривался как отдельный вид Н. farciminosum [3].

В настоящее время случаи заболевания гистоплазмозом зарегистрированы более чем в 60 странах мира [39, 65, 72, 73, 91, 93]. В России до сих пор не было достоверно подтверждено ни одного случая заболевания гистоплазмозом. Можно предположить, что причина заключается в малой осведомленности работников здравоохранения в отношении этого микоза и отсутствие коммерческих препаратов для диагностики. В то же время имеется вероятность выявления данных возбудителей у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных стран, а также в продуктах растениеводства, импортируемых из этих регионов [104].

Ввиду существования угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате террористических актов, интерес к возбудителю гистоплазмоза проявляется и как к потенциальному агенту биотерроризма. Высокая степень угрозы обусловлена легкостью создания микроспорового аэрозоля, неэффективностью вакцин, сложностью диагностики и терапии, а также отсутствием иммунной прослойки и потому практически полной незащищенностью населения от этого патогена [17, 23].

Разнообразие клинических проявлений наряду с отсутствием патогномоничных симптомов являются причинами трудностей диагностики гистоплазмоза [74, 90]. Для подтверждения диагноза необходима изоляция Н. capsulatum на питательной среде. Достоверность культурального метода должна быть подтверждена получением конверсии одной фазы гриба в другую. Как правило, эти процедуры занимают минимум 3−4 недели. К биологическому методу лабораторной диагностики гистоплазмоза прибегают для идентификации культуры гриба при исследовании патологического материала, контаминированного посторонней биотой. При этом время, необходимое для верификации диагноза, увеличивается до 8 недель. Постановка иммунологических реакций занимает значительно меньшее время, но они недостаточно специфичны из-за возможных перекрестных реакций с гетерологичными видами микромицетов [74, 92]. Как следует из этих литературных данных, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет преодолеть эти трудности и выявлять данный патоген независимо от этапа культивирования гриба.

В большинстве зарубежных публикаций посвященных разработке генетических методов идентификации Н. capsulatum в качестве ДНК-мишеней используют последовательности генов 18S рРНК, 100 кДа белка, гена Н-антигенаи гена М-антигена [44, 52, 62, 106, 107, 112, 116, 151].

R. Bialek с соавторами [52] разработали «гнездную"-ПЦР с использованием праймеров на основе гена 18S рРНК. Однако, учитывая высокую консервативность рибосомальных генов грибов, в этой работе рекомендовано дополнительно использовать секвенирование для подтверждения специфичности синтезируемых в реакции ампликонов. Важно отметить, что метод секвенирования для идентификации продуктов ПЦР при анализе клинических проб и проб из объектов внешней среды может быть использован лишь после секвенирования и внесения в GenBank генов 18S рРНК всех грибов. В противном случае возможно получение ложноположительных результатов.

В дальнейших работах авторами разработана «гнездная"-ПЦР, где в качестве мишени для праймеров выбран участок гена, кодирующего уникальный 100 кДа белок H.capsulatum. При секвенировании продуктов реакции все последовательности были гомологичными последовательности гена, кодирующего 100 кДа белок H. capsulatum [44, 62]. Однако 30% положительных при микроскопии клинических образцов от больных гистоплазмозом не детектировались в реакции амплификации с данными праймерами.

A. Bracca et. al. [107] разработали «полу-гнездную» ПЦР с олигонуклеотидными затравками, фланкирующими фрагменты гена Н-антигена возбудителя гистоплазмоза. Заявляемая авторами чувствительность составила порядка 10 геномных копий. В то же время, по словам самих авторов, количество проанализированных образцов недостаточно для оценки возможности применения данного теста в диагностических целях.

Более перспективной оказалась работа H. L. de Matos Guedes et. al. [116], которые подобрали праймеры на основе нуклеотидных последовательностей гена М-антигена. Авторами были исследованы чистые культуры, пробы почвы и клинические образцы. Праймеры детектировали как H. capsulatum var. capsulatum, так и H. capsulatum var. duboisii, в то время как пробы, содержащие Н. capsulatum var. farciminosum, были отрицательными.

По химическому строению клеточная стенка H. capsulatum существенно отличается от клеточной стенки бактерий и содержит глюканы, хитин, небольшое количество белка и липидов. Разрушить оболочку клетки грибасложную и прочную структуру, в формировании которой принимают участие различные типы связей, достаточно сложно. Ввиду особенностей строения клеточной стенки грибов для оптимизации метода выделения ДНК необходимо использование дополнительных приемов, которые обеспечивают эффективный лизис клеток возбудителя гистоплазмоза [5, 7, 54, 43, 137].

Анализ литературных данных не позволяет сделать заключение о преимуществах тех или иных праймеров для идентификации возбудителей гистоплазмоза. До сих пор нет общепринятых ДНК-мишеней, на основе которых конструировали бы амплификационные тест-системы. На сегодняшний день в России не разработаны тест-системы для обнаружения Н. capsulatum методом ПЦР.

На основании вышеизложенного очевидна актуальность исследований, направленных на совершенствование схем лабораторной диагностики гистоплазмоза и создание амплификационной тест-системы для идентификации H. capsulatum методом ПЦР.

Цель работы заключалась в конструировании амплификационной тест-системы для выявления ДНК H. capsulatum методом полимеразной цепной реакции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора праймеров для идентификации H. capsulatum методом ПЦР.

2. Оптимизировать условия проведения ПЦР, оценить специфичность и чувствительность выбранных олигонуклеотидных затравок HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as, НсСВР ls-HcCBP2as на широком наборе гомологичных и гетерологичных штаммов и разработать амплификационную тест-систему для идентификации H.capsulatum.

3. Определить оптимальные методы выделения и очистки ДНК возбудителя гистоплазмоза при анализе чистых культур микромицетов, объектов внешней среды и биологического материала, контаминированных клетками Н.capsulatum.

4. Оценить эффективность сконструированной амплификационой тест-системы для диагностики экспериментального гистоплазмоза.

Научная новизна:

Впервые для выявления ДНК возбудителя гистоплазмоза в качестве ДНК мишеней для посадки праймеров использовали ген, кодирующий белок мицелиальной фазы MS8 и ген, опосредующий синтез кальций-связывающего белка СВР в дрожжевой фазе.

На основании полученных результатов получено положительное решение о выдаче патента на изобретение № 2 011 127 594/10(40 875) «Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum» (от 04.06.2012 г., приоритет от 05.07.2012 г.).

На основе гена ms8 впервые разработана отечественная амплификационная тест-система для идентификации возбудителя гистоплазмоза на основе ПЦР и показана ее эффективность при обнаружении ДНК гриба в объектах внешней среды, контаминированных клетками Н. capsulatum и биологическом материале, полученном от экспериментально зараженных животных.

В результате исследований предложен метод выделения ДНК возбудителя гистоплазмоза, позволяющий проводить эффективный лизис клеток и очистку ДНК патогенных грибов, обеспечивающий высокую чувствительность и специфичность реакции амплификации.

Впервые схема лабораторной диагностики гистоплазмоза дополнена этапами ПЦР с использованием разработанной тест-системы при идентификации чистых культур Н. capsulatum, а также обнаружении возбудителя в клиническом материале и пробах из объектов внешней среды.

Практическая ценность:

Материалы научных исследований использованы при разработке МУ 3.4.3008−12 «Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных „новых“ и „возвращающихся“ инфекционных болезней» (утверждены Главным, государственным санитарным врачом Российской Федерации 28.03.2012 г.), проекта Методических рекомендаций «Идентификация возбудителей особо опасных микозов по таксономическим признакам и эпидемиологической значимости» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека).

По результатам диссертационной работы составлены Методические указания «Лабораторная диагностика особо опасных микозов» (представлены для утверждения в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 3.04.2012 г.), методические рекомендации «Использование олигонуклеотидных праймеров для выявления возбудителей гистоплазмоза с помощью полимеразной цепной реакции» (утверждены директором института 30.06.2009 г.) и методические рекомендации «Подготовка проб контаминированных возбудителями гистоплазмоза для исследования методом ПЦР» (утверждены директором института 10.10.2011 г.).

Для государственной регистрации проведены внутриинститутские комиссионные испытания параметров качества сконструированной амплификационой тест-системы (чувствительность, специфичность) (акт испытаний от 30.06.2010 г.), разработана и утверждена нормативная документация, в том числе Пусковой регламент, Технические условия и Инструкция по применению к «Набору реагентов для выявления ДНК.

ДНК Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции (утверждены директором института 10.10.2011 г.).

Сконструированную амплификационную тест-систему и предложенные праймеры используют в лабораториях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института для анализа генетических особенностей музейных штаммов Н. capsulatum и испытательно-лабораторном центре при исследовании поступающих проб на наличие возбудителей микромицетов II группы патогенности.

Материалы включены в лекционный материал программы повышения квалификации врачей по специальности «Лабораторная микология» утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 21.04.2005 г.- курсов повышения квалификации врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24.09.2007 г.- программы профессиональной переподготовки по специальности «Бактериология. Основы безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II группы» утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 27.08.2010 г.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Группоспецифические праймеры HcMs8s-Ms8as3 подобранные, на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок мицелиальной фазы Ms8 и праймеры HcCBPls-HcCBP2as сконструированные на основе гена кальций-связывающего белка СВР, обеспечивают амплификацию ДНК Н. capsulatum var. capsulatum, Н. capsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum.

2. Амплификационная тест-система, сконструированная на основе праймеров HcMs8s-Ms8as3, обладает аналитической чувствительностью 1×104 кл/мл при анализе чистых культур и объектов внешней среды почвы, воды), контаминированных клетками Н. capsulatum, и позволяет обнаруживать возбудитель в клиническом материале.

3. Праймеры HcMs8s2-Ms8as, обеспечивающие чувствительность ПЦР 1×10 — 1×10° кл/мл, позволяют выявлять ДНК Н. capsulatum var. capsulatum и Н. capsulatum var. farciminosum и не определяют Н. capsulatum var. duboisii.

4. Ферменты «Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum» или «Chitinase from Trichoderma viride», добавленные в образец на стадии пробоподготовки, позволяют улучшить лизис клеток, увеличить концентрацию, чистоту выделяемой ДНК микромицетов и, соответственно, повысить чувствительность реакции амплификации.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены на V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва, Национальная Академия Микологии 2007 г.- на III Международной (XII Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции Москва, 2008 г.- научно-практической конференции по медицинской микологии «XI Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2008 г.- на Междисциплинарном микологическом форуме, Москва Национальная Академия Микологии 2009 г.- на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» Оболенск, 2009 г.- на Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» Новосибирск, Россия, 2009 г.- научно-практической конференции по медицинской микологии «XII Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2009 г.- на V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Москва, 2010 г.- на Междисциплинарном микологическом форуме, Москва, Национальная Академия Микологии 2010 г.- на научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» Оболенск, 2010 г.- на научно-практической конференции по медицинской микологии «XIII Кашкинские чтения» Санкт-Петербург, 2010 г.- на VII Всероссийской научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2010» Москва, 2010 г.- на III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» Оболенск, 2011 г.

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 7 — в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 107 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 158 источников, в том числе 26 отечественных и 132 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками.

ВЫВОДЫ:

1. Выявлено, что группоспецнфические праймеры HcMs8s-Ms8as3, комплементарные фрагменту гена, кодирующего белок мицелиальной фазы Ms8 и праймеры HcCBPls-HcCBP2as — на основе гена кальций-связывающего белка СВР, позволяют детектировать Н. capsulatum var. capsulatum, Н. capsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum.

2. Показано, что с помощью праймеров HcMs8s-Ms8as3, HcCBPls-HcCBP2as и HcMs8s2-Ms8as, возможна дифференциация клинически значимых вариантов возбудителя гистоплазмоза — Н. capsulatum var. capsulatum и Н. capsulatum var. duboisii.

3. На основе нуклеотидной последовательности гена, детерминирующего белок мицелиальной фазы Ms8 определены олигонуклеотидные затравки, подобраны оптимальные условия, определены параметры проведения ПЦР и сконструирована амплификационная тест-система для идентификации возбудителя гистооплазмоза, позволяющая выявлять//, capsulatum в концентрации 1×104 кл/мл.

4. Продемонстрирована возможность применения амплификационной тест-системы, разработанной на основе олигонуклеотидных затравок HcMs8s-Ms8as3 для специфической детекции Н. capsulatum при исследовании объектов внешней среды (почвы, воды), искусственно контаминированных возбудителем гистоплазмоза и моделировании инфекционного процесса.

5. Подобраны оптимальные способы экстракции и очистки ДНК возбудителя гистоплазмоза из контаминированных проб различных объектов внешней среды и биологического материала, позволяющие выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1×104 кл/мл.

6. Установлено, что использование литических ферментов «Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum» или «Chitinase from Trichoderma утс1е» на стадии пробоподготовки повышает концентрацию и чистоту препарата выделяемой ДНК, и, как следствие, чувствительность реакции амплификации на один-два порядка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Гистоплазмоз — заболевание, относящееся к особо опасным микозам. Для гистоплазмоза характерен широкий спектр клинических проявлений от легких и латентных форм до прогрессирующих заболеваний, заканчивающихся смертью больного [22].

Гистоплазмоз эндемичен, прежде всего для стран Африки и Южной Америки, но встречается также в Европе и Азии. В природных условиях возбудитель гистоплазмоза обитает во влажной почве, богатой органическими веществами, в помете птиц и летучих мышей, а заражение человека или животных происходит воздушно-пылевым путем, при вдыхании спор [13, 24, 93, 113].

Трудности при диагностике микоза связаны с отсутствием патогномоничных симптомов заболевания и большим разнообразием клинических проявлений. Установление лабораторного диагноза гистоплазмоза по традиционной схеме связано с длительным процессом культивирования грибов и получением конверсии фаз. Существующие иммунологические методы позволяют получить результат за более короткий срок, однако из-за возможных перекрестных реакций с гетерологичными видами микромицетов возможно получение ложноположительных реакций [92, 95]. Существующие методы идентификации данных возбудителей оказываются недостаточно эффективными для их выявления и ускоренной диагностики микоза.

В решении задач по эффективному обнаружению ДНК возбудителя гистоплазмоза существенную роль играет полимеразная цепная реакция с применением видоспецифичных праймеров, как высокочувствительный, специфичный, но, в то же время, доступный и простой в исполнении метод. Анализ существующих литературных данных не позволяет сделать заключение о преимуществах тех или иных праймеров для идентификации возбудителя гистоплазмоза. На сегодняшний день отсутствуют коммерческие ПЦР тест-системы для идентификации Н.capsulatum.

На основе зарубежных литературных источников и компьютерной базы данных Gen Bank были подобраны праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза. Первоначально с этой целью были исследованы несколько пар олигонуклеотидных праймеров на основе генов факторов вирулентности и уникальных структурных компонентов H.capsulatum. В качестве мишеней для отжига праймеров мы использовали различные гены, специфичные для H.capsulatum. На основе гена ms8 (mold-specific MS8 protein) нами разработаны две пары праймеров HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as и одна пара праймеров HcCBPlsHcCBP2as на основе гена, кодирующего последовательность кальций-связывающего белка (СВР1).

В серии экспериментов установлен оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации.

При оценке чувствительности праймеров НсСВРls-HcCBP2as штаммы возбудителя гистоплазмоза {H.capsulatum var. capsulatum, H. capsulatum vor. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum) в концентрации lxlО4 кл/мл детектировались в 80% случаев.

На основе последовательностей гена ms8 разработаны две комбинации пар праймеров. С первой парой HcMs8s-Ms8as3 в реакции амплификации синтезировались специфические ампликоны ДНК H. capsulatum var. capsulatum, H. capsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum. В концентрациях lxlO4 кл/мл чувствительность ПЦР с данными праймерами составляла 100%.

С помощью праймеров HcMs8s2-Ms8as в ПЦР определялись H. capsulatum var. capsulatum и H. capsulatum var. farciminosum и не детектировались штаммы H. capsulatum var. duboisii. Чувствительность была ниже, чем у других взятых в работу праймеров — при концентрации lxlO4кл/мл детектировались 50% проб.

Аналитическая специфичность праймеров HcMs8s-Ms8as3, HcMs8s2-Ms8as, НсСВРls-HcCBP2as доказана при тестировании проб чистых культур у гетерологичных микроорганизмов в дозах 1×10 кл/мл. Неспецифических (ложноположительных) реакций не выявлено.

Для проверки специфичности продуктов ПЦР проведено их выборочное секвенирование. С помощью программы BLASTn выявлено, что секвенированные нуклеотидные последовательности ампликонов, синтезируемых с помощью праймеров, используемых в работе, были высокогомологичны соответствующим участкам генов.

В результате исследований проб чистых культур возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР с различными олигонуклеотидными затравками установлено, что наибольшей чувствительностью обладали подобранные нами праймеры HcMs8s-Ms8as3. Чувствительность метода ПЦР составила 1×104 клеток/мл и специфичность 100%.

Одним из обязательных методов специфической индикации патогенных биологических агентов является ПЦР. В ходе работы нами отработаны условия проведения анализа объектов окружающей среды и показана принципиальная возможность применения использования ПЦР с праймерами HcMs8s-Ms8as3 для детекции Н.capsulatum. В результате реакции амплификации праймеры HcMs8s-Ms8as3 выявляли ДНК возбудителя гистоплазмоза в пробах воды и почвы в концентрациях 1×104кл/мл в 100% случаев.

С помощью разработанных нами праймеров HcMs8s-Ms8as3 были проанализирована кровь и биоптаты, полученные от лабораторных животных, зараженных возбудителем гистоплазмоза. Исследование проб проводили параллельно культуральным методом и ПЦР. В реакции амплификации ДНК возбудителя гистоплазмоза детектировали в суспензиях органов белых мышей во все сроки наблюдения.

Использование праймеров HcMs8s-Ms8as3 при анализе органов животных методом ПЦР позволило выявить исследуемые микроорганизмы в 19 (14,8%) из 128 проб. Применение культурального метода позволяло обнаружить возбудителя в 27 из 128 проб (21,1%). При сравнительной оценке эффективности микологического метода и ПЦР не установлено статистически достоверных различий в диагностической эффективности этих двух методов (р > 0,05).

При подготовке проб для ПЦР использовали несколько общепринятых методов выделения ДНК: высокотемпературный лизис, метод нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата и гуанидин-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом. Оказалось, что в результате кипячения грибной взвеси не происходит экстракции необходимого для ПЦР количества ДНК, что приводит к ложноотрицательным результатам анализа. При исследовании проб чистых культур микромицетов и объектов окружающей среды оптимальным способом выделения ДНК являлся метод гуанидин-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом.

В случае выделения ДНК из биологического материала наиболее эффективным оказался метод нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата натрия. Кроме того повышению чувствительности реакции амплификации способствовало добавление буфера, лизирующего эритроциты при выделении ДНК из проб крови, а в случае секционного материала — предварительная обработка 50 мМ NaOH .

Во всех случаях была показана эффективность применения литических ферментов на стадии пробоподготовки [25].

Резюмируя все выше сказанное, можно сделать заключение, о том что праймеры HcMs8s-Ms8as3 могут быть использованы для разработки амплификационной тест-системы, которая удовлетворяет всем предъявляемым к современным диагностическим системам требованиям по чувствительности и специфичности, а следовательно, может эффективно применяться для идентификации ДНК Н.capsulatum.

Показать весь текст

Список литературы

  1. P.A., Климко H.H., Васильева Н. В. Диагностика микозов. СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2004. — 186 с.
  2. И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Гос. изд-во мед. лит., 1962. -181 с.
  3. М.В., Кашкин П. Н. Гистоплазмоз. Кишинев.: Издательство «Штиинца», 1977.- 149 с.
  4. М.А. Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза: Автореф. дис.канд. мед.наук. Волгоград. — 2006. — 25 с.
  5. В.Н., Гришин Е. В. Новый подход для выделения геномной ДНК из дрожжей и грибов: получение ДНК-содержащих клеточных оболочек и их прямое использование в ПЦР // Биоорганическая химия.-2002.-Т.28, № 2.-С.156−167.
  6. Идентификация возбудителей кокцидиоидомикоза методом полимеразной цепной реакции / Ткаченко Г. А., Гришина М. А., Антонов В. А., Савченко С. С. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-2007.-№ 4.- С. 25−31.
  7. Т.С., Кулаев И. С. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей // Успехи биологической химии.-2001 .-Т.41 .-С. 105−130.
  8. П.Н. Медицинская микология: Краткое руководство для врачей Л.: Ленмедгис, 1962. — 344 с.
  9. П.Н., Лесовой B.C. Лабораторная диагностика гистоплазмоза и обнаружение его возбудителя на объектах внешней среды // Методическое пособие для врачей курсантов.- Ленинград.: 1973.-С-17.
  10. П.Н., Лисин В. В. Практическое руководство по медицинской микологии. Москва.: Издательство «Медицина», 1983.-192с.
  11. H.H. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 2-е изд. перераб. и доп. М.: Ви Джи Групп, 2008.-336 с.
  12. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство / Под. ред. Г. Г. Онищенко, В. В. Кутырева. М.: Медицина, Шико, 2009. — 472 с.
  13. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика глубоких микозов: Методические рекомендации / Лесовой B.C., Липницкий A.B., Тихонов Н. Г. с соавт. // Элиста, 1995. 47 с.
  14. Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер с англ.- М.: Мир, 1984.- 479 с.
  15. С.М., Иванушкина Н. Е., Кочкина Г. А. Микроскопические грибы в связи с проблемами биологической безопасности // Проблемы медицинской микологии.-2011.-Т. 13., № 3.-С. 103−112.
  16. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму / Онищенко Г. Г., Федоров Ю. М., Жилина Н. Я. и др. В.: 2004.- 288 с.
  17. О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера, 2003. — 305 с.
  18. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285−03 Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности (опасности) // Бюллетень нормативных и методических документов. Госсанэпиднадзор России. М., 2003. — С. 66 — 144.
  19. Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. -М.: Издательство «Мир», 2001.-467с.
  20. А.Ю., Сергеев Ю. В. Грибковые инфекции. М.: Издательство Бином, 2003. — 439с.
  21. А.Ю., Сергеев Ю. В. Грибковые инфекции: Руководство для врачей. М.: Издательство Бином, 2008. — 480 с.
  22. Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство / Под. ред. Г. Г. Онищенко. М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. — 288 с.
  23. СПИД-ассоциированные микозы / Лесовой B.C., Липницкий А. В., Тихонов Н. Г., Яшкулов К. Б. Элиста, 1995.- 173с.
  24. Сравнительный анализ методов выделения ДНК из клеток Histoplasma capsulatum Darling / Вьючнова Н. В., Ткаченко Г. А., Гришина М. А., Савченко С. С., Антонов В. А., Липницкий А.В.// Проблемы медицинской микологии.-2009 г., T.-l 1, № 3., с. 38−42.
  25. А.И., Черченко И. И., Бондарев И. Н., Евтодиенко В. Г., Сафронова О. И., Лащенов П. М. и др. Методические рекомендации по получению из виноградных улиток препарата, лизирующего клеточную стенку дрожжей и грибов.- Волгоград.: 1984
  26. A Molecular epidemiology of canine histoplasmosis in Japan / Murata Y, Sano A, Ueda Y, Inomata T, Takayama et.al. // Med Mycol.-2007.- Vol.45, № 3.-P.233−247.
  27. A1 Ani F.K. Epizootic lymphangitis in horses: a review of the literature // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.-1999.-Vol. 18, № 3.-P.691−699.
  28. Amplification of rDNA loci to detect and type Neisseria meningitidis and other eubacteria / McLaughlin G.L., Howe D.K., Biggs D.R., Smith A.R. et.al. // Mol Cell Probes.-1993.-Vol.7, № 1.-P.7−17.
  29. Assessment of a quantitative PCR method for clinical diagnosis of imported histoplasmosis / Buitrago M.J., Gomez-Lopez A., Monzon A., et al. // Enferm Infecc Microbiol Clin. 2007. — Vol.25, № 1. -P.16−22.
  30. Batanghari J. W, Deepe G.S., Di Cera E. Histoplasma acquisition of calcium and expression of CBP1 during intracellular parasitism // Mol. Microbiol.-1998.-Vol.27.-P.531−540.
  31. Batanghari J.W., Goldman W.E. Calcium dependence and binding in cultures of Histoplasma capsulatum II Infect. Immun.-1997.-Vol.65.-P.5257−5261.
  32. Bohse M.L., Woods J.P. Surface localization of the Yps3p protein of Histoplasma capsulatum II Eukaryot Cell.-2005.-Vol.4, № 4.-P.685−693.
  33. Bouchet V., Huot H., Goldstein R. Molecular genetic basis of ribotyping // Clin. Microbiol. Rev.-2008.-Vol.21, № 2.-P.262−273.
  34. Campbell C.C. Use of yeast phase antigens in a complement fixation test for histoplasmosis. IV. Results with ground yeast phase antigens in serial specimens of serums from thirty-seven patients // Public Health Monogr.-1956.-Vol.70, № 39.-P.140−143.
  35. Carr J., Shearer G. Genome size, complexity, and ploidy of the pathogenic fungus Histoplasma capsulatum // Journal of bacteriology.-1998.-Vol.180, № 24.-P.6697−6703.
  36. Classification of Histoplasma capsulatum isolates by restriction fragment polymorphisms / Vincent R.D., Goewert R., Goldman W. E, Kobayashi G.S. et.al. //J. Bacteriol.-1986.-Vol.165, № 3.-P.813−818.
  37. Comparative evaluation of a chemiluminescent DNA probe and an exoantigen test for rapid identification of Histoplasma capsulatum! Padhye A.A.,
  38. Smith G., McLaughlin D. et al. // J.Clin.Microbiol.-1992.-Vol.30, № 12.-P.3108−3111.
  39. Comparative genomic analyses of the human fungal pathogens Coccidioides and their relatives / Sharpton T.J., Jason E. et al. // Genome Res.-2009.-Vol. 19.-P. 1722−1731.
  40. Comparison of different DNA-based methods for molecular typing of Histoplasma capsulatum / Muniz M.M., Tavares P.M., Meyer W., Nosanchuk J.D. // Appl Environ Microbiol.- 2010.-Vol.76, № 13.-P.4438−4447.
  41. Comparison of different methods for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood / Loffler J., Hebart H., Schumacher U. et al. // J.Clin.Microbiol.-1997.-Vol.35, № 12.-P.3311−3312.
  42. Comparison of staining methods and a nested PCR assay to detect Histoplasma capsulatum in tissue sections / Bialek R., Ernst F., Dietz K. et al. // Microbiology and Infectious Disease.- 2002.-Vol.l 17.-P.597−603.
  43. Contaminations occurring in fungal PCR assays / Loeffter J., Hebart H., Biallek R. et.al. // J.Clin.Microbiol.-1999.-Vol.37, № 4.-P. 1200−1202.
  44. Darling S.T. A Protozoon general infection producing pseudotubercles in the lungs and focal necroses in the liver, spleen and lymphnodes // J. Am. Med. Ass., (JAMA).-1906.-Vol.46.-P. 1283−1285.
  45. Darling S.T. Histoplasmosis: A fatal infection disease resembling kala-azar found among natives of tropical America // Archiver of internal medicine.-1908.-P.107−123.
  46. Davis T.E., Domer J.E., Li Y.T. The. Cell wall studies of Histoplasma capsulatum and Blastomyces dermatitidis using autologous and heterologous enzymes // Infect Immunity.-1977.-Vol. 15, № 3.-P.978−987.
  47. Definition of the extracellular proteome of pathogenic-phase Histoplasma capsulatum / Holbrook E.D., Edwards J.A., Youseff B.H., Rappleye C.A. //J Proteome Res.-2011.-Vol. 10, № 4.-P. 1929−1943.
  48. Detection of Histoplasma capsulatum DNA in lesions of chronic ocular histoptasmosis syndrome / Spencer W.H., Chan C.-C., Shen D.F. et.al. // Arch Ophthalmol.-2003 .-Vol. 121 .-P. 1551 -155 5.
  49. Development of a novel antigen detection test for histoplasmosis / Gomez B.L., Figueroa J.I., Hamilton A.J., Ortiz B.L. et.al. // J. Clin. Microbiol.-1997.-Vol.35, № 10.-P.2618−2622.
  50. Diagnosis and monitoring of murine histoplasmosis by a nested PCR assay / Bialek R., Fischer J.R., Feucht A. et al. // J.Clin.Microbiol.-2001.-Vol.39, № 4.-P. 1506−1509.
  51. Diagnosis of acute pulmonary histoplasmosis by antigen detection / Swartzentruber S., Rhodes L., Kurkjian K., et al. // Clin Infect Dis. 2009. — Vol.49, № 12. -P.1878−1882.
  52. Domer J. Monosaccharide and chitin content of cell walls of Histoplasma capsulatum and Blastomyces dermatitidis II J. Bacteriology.-1971.-Vol.107, № 3.-P.870−877.
  53. Domer J.E., Hamilton J.G., Harkin J.C. Comparative study of the cell walls of the yeastlike and mycelial phases of Histoplasma capsulatumII J. Bacteriology.-1967.-Vol.94, № 2.-P. 466−474.
  54. Dubois A., Vanbreuseghem R. Experimental study on a Belgian strain of Histoplasma capsulatum- comparison with other strains and with Histoplasma duboisii II Antonie Van Leeuwenhoek.-1956.-Vol.22, № 1.-P. 103−112.
  55. Eissenberg L.G., Goldman W.E. Histoplasma variation and adaptive strategies for parasitism: new perspectives on histoplasmosis // Clin Microbiol Rev.-1991.-Vol.4, № 4.-P.411121
  56. Electrophoresis karyotype and chromosome-length polymorphism of Histoplasma capsulatum clinical isolates from Latin America / Canteros C.E., Zuiani M.F., Ritacco V., et al. // FEMS Immunol Med Microbiol. 2005. — Vol.45, № 3. -P.423−428.
  57. ELISA for early diagnosis of histoplasmosis / Guimaraes A.J., Pizzini C.V., De Matos Guedes H.L., Albuquerque P.C. et.al. // J. Med. Microbiol.-2004.-Vol.53, № 6.-P.509−514.
  58. Emmons C.W. Isolation of Histoplasma capsulatum from soil in Washington, D. C // Public Health Rep.-1961.- Vol.76, N07.-P.591.595.
  59. Epididymal and prostatic histoplasmosis in a renal transplant recipient from southern India / Baig W.W., Attur R.P., Chawla A., Reddy S. et.al. // Transpl Infect Dis.-2011 .-Vol. 13.- P.489−491.
  60. Evaluation of two nested PCR assays for detection of Histoplasma capsulatum DNA in human tissue / Bialek R., Feucht A, Aepinus C. et al. // J.Clin.Microbiol.-2002.-Vol.40, № 5.-P. 1644−1647.
  61. False-positive Histoplasma capsulatum gen-probe chemiluminescent test result caused by a Chrysosporium species / Brandt M.E., Gaunt D., Iqbal N. et al. // J.Clin.Microbiol.-2005.-Vol.43, № 3.-P. 1456−1458.
  62. Fast DNA isolation from Histoplasma capsulatum: methodology for arbitrary primer polymerase chain reaction-based epidemiological and clinical studies / Woods J.P., Kersulyte D., Goldman W. et al. // J.Clin.Microbiol.-1993.-Vol.31, № 2.-P.463−464.
  63. Ferreira M.S., Borges A.S. Histoplasmosis // Rev Soc Bras Med Trop.-2009.-Vol. 42, № 2.-P.192−198.
  64. Fosmid-based physical mapping of the Histoplasma capsulatum genome / Magrini V., Wesley C. Warren, Wallis J. et.al. // Genome Research.-2004.-Vol. 14.-P.1603−1609.
  65. Fungal infections: a growing threat / Dixon D.M., McNeil M.M., Cohen M.L., GellinB.G. et.al. //Public HealthRep.-1996.-Vol. Ill, № 3.-P.226−235.
  66. Genetic analysis of Histoplasma capsulatum strains isolated from clinical specimens in Thailand by a PCR-based random amplified polymorphic DNA method / Poonwan N., Imai T., Mekha N. et al. // J.Clin.Microbiol.-1998.-Vol.36, № 10.-P.3073−3076.
  67. Geographic distribution of endemic fungal infections among older persons, United States / Baddley J.W., Winthrop K.L., Patkar N.M. et al. // Emerg Infect Dis serial on the Internet. 2011 Sep [date cited]. http://dx.doi.org/10.3201/eidl709.101 987.
  68. Gerber J.D., Riley R.E., Jones R. Evaluation of a microtiter latex agglutination test for histoplasmosis // Appl. Microbiol.-1972.-Vol.24, № 2.-P.191−197.
  69. Gugnani H.C. Histoplasmosis in Africa: a review // Indian J Chest Dis Allied Sci.-2000.-Vol.42, № 4.-P.271−277.
  70. Gugnani H.C., Muotoe-Okafor F. African histoplasmosis: a review // Rev Iberoam Micol.-1997.-Vol.l4.-P.155−159.
  71. Guimaraes A.J., Nosanchuk J.D., Zancope-Oliveira R.M. Diagnosis of histoplasmosis // Brazilian Journal of Microbiology.-2006.-Vol.3 7.-P. 1−13.
  72. R., Larsen N., Woese C. / Lessons from an evolving rRNA:16S and 23 S rRNA structures from a comparative perpective // Microbiological review.-1994.-Vol.8, №l.-P.10−24.
  73. Hadley S, Karchmer A.W. Fungal infections in solid organ transplant recipients // Infect Dis Clin North Am.-1995.-Vol.9, № 4.-P. 1045−1074.
  74. Heiner D.C. Diagnosis of histoplasmosis using precipitin reactions in agar gel // Pediatrics.-1958.-Vol.22.-P.616−627.
  75. Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the BioRad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay / Wheat L.J., Hackett E., Durkin M. et.al. // Clinical and Vaccine Immunology.-2007.-Vol. 14, № 5.-P.638−640.
  76. Hoehn T, Clark V.L. Isolation and nucleotide sequence of the gene (aniA) encoding the major anaerobically induced outer membrane protein of Neisseria gonorrhoeae II Infect Immun.- 1992.-Vol.60.-P.4695−4703.
  77. Hogan L.H., Klein B.S., Levitz S.M. Virulence factors of medically important fiingi // Clinical Microbiology Reviews.-1996.-Vol.9, № 4.-P.469−488.
  78. Howard D. Studies on the catalase of Histoplasma capsulatum. il Infect Immun.-1983.-Vol.39, № 3.-P. 1161−1166.
  79. Howard D. The epidemiology and ecology of blastomycosis, coccidioidomycosis and histoplasmosis // Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A.-1984.-Vol.257, № 2.-P.219−227.
  80. Huffnagle K.E., Gander R.M. Evaluation of Gen-Probe's Histoplasma capsulatum and Cryptococcus neoformans AccuProbes // J Clin Microbiol.-1993.-Vol.31,№ 2.-P.419−421.
  81. Identification of Histoplasma capsulatum from culture extracts by RealTime PCR / Martagon-Villamil J., Shrestha N., Sholtis M., et al. // J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, № 3.-P. 1295−1298.
  82. Identifying phase-specific genes in the fungal pathogen Histoplasma capsulatum using a genomic shotgun microarray / Hwang L., Hocking-Murray D., Bahrami A.K. et al. // Molecular Biology of the Cell.-2003.-Vol.14.-P.2314−2326.
  83. Itoh Y., Johnson R., Scott B. Integrative transformation of the mycotoxin-producing fungus Penicillium paxilli II Curr Genet.-1994.-Vol.25.-P. 508 513.
  84. Javerzat J.P., Jacquier C., Barreau C. Assignment of linkage groups to the electrophoretically-separated chromosomes of the fungus Podospora anserine 11 Curr. Genet.- 1993.-Vol.24.-P. 219−222.
  85. Joseph H., Filler S.G., Mitchell A.P., Edwards J.E., Jr. Molecular principles of fungal pathogenesis. 1st ed. New York: ASM Press, 2006. (Heitman et al. 321−331).
  86. Kasuga T, Taylor J. W, White T.J. Phylogenetic relationships of varieties and geographical groups of the human pathogenic fungus Histoplasma capsulatum Darling//J. Clin. Microbiol.-1999.-Vol.37.-P.653−663.
  87. Kauffman C. A. Pulmonary histoplasmosis // Curr. Infect. Dis. Rep. -2001. -Vol.3. -P.279−285
  88. Kauffman C.A. Histoplasmosis // Clin Chest Med. 2009. — Vol.30, № 2. -P.217−25
  89. Kauffman C.A. Histoplasmosis: a clinical and laboratory update // Clinical Microbiology Reviews.-2007.-Vol.20, № 1.-P. 115−132.
  90. Kauffman C.A. Endemic Mycoses: Blastomycosis, Histoplasmosis, and Sporotrichosis // Infect Dis Clin N Am.-2006.-Vol.20.-P.645−662.
  91. Keath E.J., Kobayashi G.S., Medoff G. Typing of Histoplasma capsulatum by restriction fragment length polymorphisms in a nuclear gene // Journal Clinical Microbiology.-1992.-Vol. 30.-P.2104−2107.
  92. Khansari N., Segre D., Segre M. Diagnosis of histoplasmosis and blastomycosis by an antiglobulin hemagglutination test // Am. J. Vet. Res.-1982.-Vol.43, № 12.-P. 2279−2283.
  93. Kleger B., Kaufman L. Detection and identification of diagnostic Histoplasma capsulatum precipitates by counterelectrophoresis // Appl Microbiol.-1973.-Vol.26, № 3.-P.231−238.
  94. Kostman J. R, Edlind T. D, LiPuma J.J., Stull T.L. Molecular epidemiology of Pseudomonas cepacia determined by polymerase chain reaction ribotyping // J. Clin. Microbiol.-1992.-Vol. 30, № 8.-P.2084−2087.
  95. Kurowski R., Ostapchuk M. Overview of Histoplasmosis // Kentucky Am Fam Physician.-2002.-Vol.66, № 12.-P.2247−2253.
  96. Laniado-Laborin R. Coccidioidomycosis and other endemic mycoses in Mexico // Rev.Iberoam.Micol.-2007.-Vol. 24.-P.249−258.
  97. Lee B.N., Adams T.H. The Aspergillus nidulans fluG gene is required for production of an extracellular developmental signal and is related to prokaryotic glutamine synthetase //1. Genes Dev.-1994.-Vol.8.-P.641−651.
  98. Lindsley M.D., Hurst S.F., Iqbal N.J., Morrison C.J. Rapid identification of dimorphic and yeast-like fungal pathogens using specific DNA probes // J Clin Microbiol.-2001 .-Vol.39, № 10.-P.3505−3511.
  99. Lopez C.E. Dimorphism and pathogenesis of Histoplasma capsulatum II Rev Argent Microbiol.-2006.-Vol.38, № 4.-P.235−242.
  100. Loulergue P. Literature review and case histories of Histoplasma capsulatum var. duboisii infections in HIV-infected patients // Emerg Infect Dis. -2007. Vol.13, № 11. — P.1647−1652.
  101. Manfredi R, Mazzoni A, Nanetti A, Chiodo F. Histoplasmosis capsulati and duboisii in Europe: the impact of the HIV pandemic, travel and immigration // Eur J Epidemiol.-1994,-Vol. 10, № 6.-P.675−681.
  102. Maresca B., Kobayashi G.S. Dimorphism in Histoplasma capsulatum: a model for the study of cell differentiation in pathogenic fungi // Microbiological Reviews.- 1989.-Vol.53, № 2.-P. 186−206.
  103. Molecular characterization of Histoplasma capsulatum isolated from an outbreak in treasure hunters Histoplasma capsulatum in treasure hunters / Munoz B., Martinez M.A., Palma G., et al. // Infect Dis. 2010. — Vol. 8, № 10. 264.
  104. Molecular detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum in human clinical samples / Bracea A., Tosello M.E., Girardini J.E. et al. II J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, № 4.-P. 1753−1755.
  105. Molecular diagnosis of human histoplasmosis in whole blood samples / Toranzo A.I., Tiraboschi I.N., Fernandez N. et al. // Rev Argent Microbiol. 2009. -Vol.41, №l.-P.20−26.
  106. Monbreun W. The cultivation and cultural characteristics of Darling’s Histoplasma capsulatum II Am. Jour. Trop. Med.-1934. .-Vol.l4.-P.93−125.
  107. Nemecek J.C., Wuthrich M., Klein B.S. Global control of dimorphism and virulence in fungi // Science.-2006.-Vol.312, № 28.-P.583−588.
  108. Nguyen V.Q., Sil A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Rypl, a conserved transcriptional regulator // The National Academy of Sciences of the USA.-2008.
  109. Non-culture based diagnostic tests for mycotic infections / Reiss E., Obayashi T., Orle K., Yoshida M. et.al. // Med Mycol.-2000.-Vol.38, № 1.-P. 147−159.
  110. Nosanchuk J.D., Gacser A. Histoplasma capsulatum at the host-pathogen interface 11 Microbes and Infection.-2008.-Vol. 10, № 9.-P.973−977.
  111. Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens / Burik J-A.V., Myerson D., Schreckhise R.W. et.al. // J.Clin.Microbiol.-1998.-Vol.36,№ 5.-P.l 169−1175.
  112. Pathogenic fungi in humans and animals / Howard D.H. New York. -2002.- 790 p.
  113. PCR assay for identification of Histoplasma capsulatum based on the nucleotide sequence of the M antigen / de Matos Guedes H. L., Guimaraes A.J., Peralta J.M. et al. // J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, № 2.-P.535−539.
  114. Phenotypic variation and intracellular parasitism by Histoplasma capsulatum /Kugler S., Sebghati T.S., Eissenberg L.G. et.al. // PNAS.-2000.- Vol.97, № 16.-P.8794−8798.
  115. Phylography of the fungal pathogen Histoplasma capsulatum / Kasuga T., White T. J, Koening G., Mcewen J. et.al. // Mol Ecol.-2003.-Vol.-12.-P.3383−3401.
  116. Pine L., Malcolm G.B., Gross H., Gray S.B. Evaluation of purified H and M antigens of histoplasmin as reagents in the complement fixation test // Sabouraudia.-1978.-Vol. 16, № 4.-P.257−269.
  117. Pounder J.I., Hansen D., Woods G.L. Identification of Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, and Coccidioides species by repetitive-sequence-based PCR// J Clin Microbiol.-2006.-Vol.44, № 8.-P.2977−2982.
  118. Radford A., Parish J.H. The genome and genes of Neurospora crassa // Fungal Genet Biol.-1997.-Vol.21, № 3.-P.258−66.
  119. Rapid and simple method purification of nucleic acids / Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. // J.Clin.Microbiol.-1990.-Vol.28, № 3.-P.495−503.
  120. Rapid diagnosis of Histoplasma capsulatum endocarditis using the AccuProbe on an excised valve / Roy F.C., Tomford J.W., Hall G.S. et al. // J.Clin.Microbiol.-2001.-Vol.39, № 7.-P.2640−2641.
  121. Rappleye C.A., Goldman W.E. Defining virulence genes in the dimorphic fungi // Annu Rev Microbiol.-2006.-Vol.60.-P.281−303.
  122. Ratel J.B., Batanghari J.W., Goldman W.E. Probing the yeast phase-specific expression of the CBP1 gene in Histoplasma capsulatum II Journal of Bacteriology.-1998.-Vol. 180, № 7.-P. 1786−1792.
  123. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing / Espy M.J., Uhl J.R., Sloan L.M. et.al. // Clinical Microbiology Reviews.-2006.-Vol. 19, № 1 .-P. 165−256.
  124. Reid T.M., Schafer M.P. Direct detection of Histoplasma capsulatum in soil suspensions by two-stage PCR // Mol Cell Probes.-1999.-Vol. 13, № 4.-P.269−273.
  125. Reiss E., Miller S.E., Kaplan W., Kaufman L. Antigenic, chemical, and structural properties of cell walls of Histoplasma capsulatum yeast-form chemotypes 1 and 2 after serial enzymatic hydrolysis // Infect Immun.-1977.-Vol. 16, № 2.-P.690−700.
  126. Rios-Fabra A., Moreno A. R, Isturiz R.E. Fungal infection in Latin American countries // Infect Dis Clin North Am.-1994.-Vol.8, № 1.-P.129−154.
  127. Salazar O., Juan) K., Asenjo A. Enzymatic lysis of microbial cells // Biotechnol Lett.-2007.-Vol.29.-P.985−994.
  128. Salvin S.B. Cysteine and related compounds in the growth of the yeastlike phase of H. capsulatum II J. Infect. Dis.- 1989.-Vol.84.-P. 275−283.
  129. Samaila M.O., Abdullahi K. Cutaneous manifestations of deep mycosis: an experience in a tropical pathology laboratory Indian // J Dermatol.-2011.-Vol.56, № 3.-P.282−286.
  130. Sandhu G.S., Bruce C.K., Stockman L. Molecular probes for diagnosis of fungal infections // J.Clin.Microbiol.-1995.-Vol.41, № 4.-P.2913−2919.
  131. Scherr G.H. The roles of -SH group and incubation temperature // Exp. Cell Res.-1957.-Vol.l2.P.92−102.
  132. Scott J.H., Schekman R. Lyticase: endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis // Journal of Bacteriology.-1980.-Vol. 142, № 2.-P.414—423.
  133. Sen P.K., Ghosh M.B. A study on histoplasmosis // Indian Journal of Tuberculosis.-1956.-Vol.3, № 3.-P. 78−85.
  134. Steele P. E, Carle G. F, Kobayashi G.S., Medoff G / Electrophoretic analysis of Histoplasma capsulatum chromosomal DNA // Mol. Cell. Biol.-1989.-Vol.9, № 3.-P.-983−987.
  135. Strauss E.J., Guthrie C. A cold-sensitive mRNA splicing mutant is a member of the RNA helicase gene family // Genes Dev.-1991.-Vol 5.-P.629−641.
  136. Structural features responsible for the biological stability of Histoplasma’s virulence factor CBP / Beck M.R., DeKoster G.T., Hambly D.M., Gross M.L. et.al. // Biochemistry.-2008.-Vol.47, № 15.-P.4427^1438.
  137. Strunnikov A.V., Larionov V. L, Koshland D. SMC1: an essential yeast gene encoding a putative head-rod-tail protein is required for nuclear division and defines a new ubiquitous protein family // J. Cell Biol.-1993.-Vol. 123.-P. 1635−1648.
  138. Taylor J.W., Geiser D.M., Burt A., Koufopanou V. The evolutionary biology and population genetics underlying fungal strain typing / Clin Microbiol Rev.-1999.-Vol. 12, № 1 .-P. 126−146.
  139. The Ajellomycetaceae, a new family of vertebrate-associated Onygenales / Untereiner W.A., Scott J.A., Naveau F.A., Sigler L. et.al. // Mycologia.-2004.-Vol.96, № 4.-P.812−821.
  140. The protein «mycoarray»: a novel serological assay for the laboratory diagnosis of primitive endemic mycoses /Ardizzoni A., Baschieri M. C, Manca L, Orsi C.F. et.al.//New Microbiol.-201 l.-Vol.34, № 3.-P.307−316.
  141. Tian X., Shearer G. Cloning and analysis of mold-specific genes in the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum II Gene.-2001.-Vol.275.-P. 107−114.
  142. Timberlake W.E. Low repetitive DNA content in Aspergillus nidulans. II Science 1978.-Vol. 202.-P.973−975.
  143. Torres M., Diaz H., Herrera T., Sada E. Evaluation of enzyme linked immunosorbent-assay and western blot for diagnosis of histoplasmosis // Rev. Invest. Clin.-l993.-Vol.45, № 2.-P. 155−160.
  144. Typing of Histoplasma capsulatum strains by fatty acid profile analysis / Zarnowski R., Miyazaki M., Dobrzy A. et.al. // J Med Microbiol.-2007.-Vol.56.-P.788−797.
  145. Validation and clinical application of a molecular method for identification of Histoplasma capsulatum in human specimens in Colombia, South America / Munoz C, Gomez B.L., Tobon K.A. et.al. // Clin Vaccine Immunol.-2010.-Vol.17, №l.-P.62−67.
  146. Vanbreuseghem R. African histoplasmosis or histoplasmosis caused by Histoplasma duboisii // Bull Acad R Med Belg.-1964.-Vol.4.-P.543−585.
  147. Woods J.P. Histoplasma capsulatum molecular genetics, pathogenesis, and responsiveness to its environment // Fungal Genet Biol.-2002.-Vol.35, № 2.-P.81−97.
  148. Xianbin T., Glenmore S. The mold-specific ms8 gene is required for normal hypha formation in the dimorphic pathogenic fungus Histoplasma capsulatum II Eukaryotic cell.-2002.-Vol.l, № 2.- P.249−256.
  149. Xue B., Goodwin P.H., Annis S.L. Pathotype identification of Leptosphaeria maculans with PCR and oligonucleotide primers from ribosomal internal transcribed spacer sequences // Physiolog Mol Plant Pathol.-1992.-Vol.1, № 3.-P.179−188.
  150. Zancoper-Oliveira R.M., Tavares P.M., de Medeiros Muniz M. Genetic diversity of Histoplasma capsulatum strains in Brazil // Immunology and Medical Microbiology.-2005. -Vol.45 .-P.443−449.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!