Характеристика биологических свойств бактерий рода Serratia, выделенных при инфекционных процессах различной локализации

ГЛАВА 1 АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ В связи с неблагополучной экологической ситуацией и нерациональным применением антибактериальных препаратов в практике, в последние годы наблюдается тенденция увеличения частоты выделения условно-патогенных грамотрицательных бактерий, в частности бактерий рода Serratia, при инфекциях различной локализации (1, 8, 79, 80,192).

Бактерии рода Serratia достаточно широко распространены в природе: их обнаруживают в воде, почве, пищевых продуктах, а в последние десятилетия они часто стали выделяться от здоровых и больных людей, животных (87).

Представители вышеуказанных микроорганизмов в ходе эволюции приобрели способность при попадании в организм человека не только выживать, но и наносить ему вред (5, 84).

Бактерии рода Serratia часто являются причиной гнойновоспалительных, урологических, гинекологических и кишечных заболеваний (94, 95). Также инфекционные процессы, вызванные этими бактериями, нередко развиваются у детей раннего возраста, онкологических больных, и являются причиной внутрибольничных инфекций (89, 91, 96).

Способность бактерий рода Serratia размножаться в макроорганизме и вызывать инфекционный процесс зависит от наличия у бактерий ряда факторов, определяющих их адгезивную, колонизирующую, цитотоксиче-скую и энтеротоксическую активности возбудителя. В связи с этим изучение этих факторов может позволить разработать критерии этиологической значимости, основанные на изучении указанных биологических характеристик возбудителей и улучшить диагностику инфекций, вызванных бактериями рода Serratia (84). К сожалению, недостаточно изучена роль отдельных поверхностных структурных элементов бактериальной клетки Serratia и факторов, обуславливающих патогенность клинических изолятов, в частности их адгезивная, энтеротоксигенная, гемолитическая, ДНК-азная, лецитиназная активности и персистентный потенциал микроорганизмов.

Исходя из вышеизложенного, проведение комплексных исследований, направленных на изучение факторов патогенности, тесным образом связаных с этиологической значимостью выделяемых штаммов бактерий рода Serratia, является весьма актуальным.

Цель исследования. Изучить биологические свойства клинических штаммов бактерий рода Serratia, выделенных от больных с инфекционными процессами различной локализации.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту встречаемости бактерий рода Serratia при кишечных, урологических инфекциях и гнойно-воспалительных заболеваниях хирургического профиля, и их устойчивость к наиболее широко применяемым в практике антибиотикам.

2. Изучить культуральные, морфологические свойства и ультраструктуру клеток бактерий рода Serratia.

3. Выяснить частоту проявления адгезивной, гемолитической (а-, энтеро-, тиолзависимый гемолизин), лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной, LT-энтеротоксигенной активностей у штаммов бактерий рода Serratia, выделенных от больных с кишечными, урологическими и гнойновоспалительными заболеваниями.

4. Дать биологическую характеристику бактерий рода Serratia на различных моделях экспериментальной инфекций.

5: Изучить природу генетических детерминант некоторых факторов патогенности бактерий рода Serratia.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

С помощью электронного микроскопа описаны морфологические особенности бактерий рода Serratia и изучены взаимоотношения между бактериальными клетками Serratia в колониях. Выявлено два типа контактов: плотное слипание и образование перемычек на уровне наружных мембран. У клинических штаммов, обладающих высокой адгезивной активностью, по периметру клеток обнаружены реснички. У двух клинических штаммов Serratia выявлена способность к синтезу холероподобного термо лабильного энтеротоксина.

Определен широкий спектр антибиотикоустойчивости у клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Получены новые данные о распространении агемолитической, ти-олзависимой, энтерогемолитической, антиинтерфероновой, антикомплементарной, антилизоцимной, ДНК-азной, лецитиназной активностей клинических штаммов Serratia.

У штаммов, выделенных при кишечных инфекциях, обнаружена способность к синтезу гемолизина нового типа — энтерогемолизина, формирующего на кровяном агаре с 5% кровью барана зоны двойного лизиса и вызывающего накопление геморрагической жидкости в петле тонкого кишечника кролика.

Среди клинических штаммов бактерий рода Serratia выделены два штамма: S. odorifera и S. marcescens, обладающие комплексом факторов патогенности. Штаммы депонированы в ГНИСК им. JI.A. Тарасевича под №№ 275, 268 соответственно и запатентованы № 2 003 138 265/13 (41 348), № 2 003 133 683/13 (36 133) для использования в качестве эталонных культур при изучении биологических свойств бактерий рода Serratia.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Среди клинических штаммов Serratia выделены культуры, обладающие факторами патогенности, что свидетельствует о их роли в инфекционной патологии человека.

Из числа клинических штаммов Serratia отобраны культуры, обладающие комплексом факторов патогенности, депонированные в коллекции живых культур Государственного Научно — исследовательского института стандартизации и контроля им. Л. А. Тарасевича для использования в качестве эталонных культур.

Полученные в процессе диссертационной работы результаты используются в учебном процессе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Башкирского государственного медицинского университета и в бактериологических лабораториях г. Уфы, Стерлитамака и Ишимбая.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы работы представлялись на научных конференциях Башкирского Государственного Медицинского Университета (2002, 2004) — на III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003) — Республиканской Конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука-2003" — Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии», ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, (Уфа, 2004) — на 69-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2004) — На конференции, посвященной 10-летию НПЦ лечения дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ». (Челябинск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ и получено 2 положительных решения на изобретения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 21 рисунок.

ВЫВОДЫ.

1. Из клинического материала было выделено 148 изолятов бактерий рода Serratia, среди которых 74 составляли штаммы, изолированные от больных с урологическими, 32 — хирургическими, 14 — гинекологическими заболеваниями, 10 с кишечными инфекциями и 20 от практически здоровых людей. Среди них 43,9% штаммов принадлежали к виду S. odorifera, 29,1% штамма к виду S. marcescens, 21,6% к S. liguefaciens, 4,1% к S. rubidaea и 1,3% к S. plymuthica.

2. Штаммы бактерий рода Serratia, выделенные от больных с кишечными и урологическими инфекциями, обладали высокой адгезивной активностью и по периметру клетки имели реснички, обусловливающие D — маннозорезистентную гемагглютинацию.

3. Бактерии рода Serratia, выделенные от больных с кишечными, урологическими, гинекологическими и хирургическими заболеваниями, по сравнению со штаммами изолированными от здоровых людей, чаще обладали адгезивнои, гемолитическои (а-, энтеро-, тиолзависимои гемолизин), лецитиназной, ДНК-азной активностями и LT-энтеротоксигенностью.

4. Пенетратность и экспрессивность персистентных характеристик (антилизоцимной, «антиинтерфероновой», антикомплементарной активностей) бактерий рода Serratia, выделенных от больных были значительно выше бактерийных изолятов от здоровых людей.

5. Генетическим детерминантом адгезивной активности являются структурные элементы хромосомной природы, LTэнтеротоксигенностиплазмида массой 60 МД, а a-гемолитической активности как плазмидная (массой 120 МД), так и хромосомная ДНК.

6. Среди клинических изолятов рода Serratia отобраны два штамма S. odorifera и S. marcescens, обладающие комплексом факторов патогенности и депонированные в ГНИСК им. JI.A. Тарасевича (№№ 275, 268 соответственно). Штаммы запатентованы (№ 2 003 138 265/13 (41 348), № 2 003 133 683/13 (36 133)), для использования в качестве эталонных культур при изучении биологических свойств бактерий рода Serratia.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с неблагополучной экологической ситуацией и нерациональным применением антибактериальных препаратов в практике, в последние годы наблюдается тенденция увеличения частоты выделения условно-патогенных грамотрицательных бактерий, в частности бактерий рода Serratia, при инфекциях различной локализации.

Способность бактерий рода Serratia размножаться в макроорганизме и вызывать инфекционный процесс зависит от наличия у бактерий ряда факторов, определяющих их адгезивную, колонизирующую, цитотоксическую и энтеротоксическую активности возбудителя. В связи с этим изучение этих факторов, может позволить разработать критерии этиологической значимости, основанные на изучении указанных биологических характеристик возбудителей и улучшить диагностику инфекций, вызванных бактериями рода Serratia.

Исходя из вышеизложенного, проведение комплексных исследований, направленных на изучение факторов патогенности, тесным образом связанных с этиологической значимостью выделяемых штаммов бактерий рода Serratia является весьма актуальным.

При проведении исследований были использованы 148 штаммов бактерий рода Serratia, среди которых 48,6% составляли штаммы, выделенные от больных с урологическими, 21,6% - гнойно-воспалительными хирургического профиля, 9,5% — гинекологическими заболеваниями, 6,7% с кишечными инфекциями и 13,6% от практически здоровых людей. По биохимическим свойствам 43,9% штаммов принадлежали к виду S. odorifera, 29,1% - S. marcescens, 21,6% - S. liguefaciens, 4,1% - S. rubidaea и 1,3% - S. plymuthica.

Поскольку бактерии рода Serratia относятся к семейству Enterobacteriaceae, и способны синтезировать пигмент — продигиозин, оказалось, что из всего количества штаммов бактерий S. marcescens 15,5% синтезировали продигиозин.

Бактерии рода Serratia на поверхности универсальных плотных питательных сред растут с образованием характерных изолированных колоний, а в МПБ — вызывают равномерное помутнение с выпадением осадка к концу суточного культивирования. Штаммы S. marcescens образуют пигмент красно-малинового цвета.

При посеве на полужидкий агар бактерии диффундировали в среду в течение суток. Исследования на подвижность методом «раздавленной» и «висячей» капли показали, что бактериальные клетки обладали поступательными и маятникообразными движениями.

На окрашенных препаратах по Граму бактериальные клетки представляли собой мелкие грамотрицательные палочки.

При электронно — микроскопическом изучении бактериальные клетки представляли собой палочки размерами длиной 1,1−1,3 мкм и шириной 0,5−0,6 мкм, окруженные перитрихиально расположенными жгутиками, которые имели различную толщину и длину (2×4 — 20 нм). Их количество и место расположения различны и неодинаковы у разных штаммов, среднее число жгутиков колебалось в пределах от 6 до 50−60. Следует отметить, что на количество жгутиков определенное влияние оказывали используемые в приготовлении препарата химические вещества: так при обработке препаратов раствором уранилацетата наблюдали большую ломкость жгутиков, что соответственно резко уменьшало их количество.

Исследование структуры колоний бактерий рода Serratia показало, что между клетками внутри колоний существуют контакты двух типов: плотное слипание клеток между собой и образование внутрицитоплазматических перемычек на уровне наружных мембран клеточных стенок.

Кроме того, при электронной микроскопии у высокоадгезивных штаммов удалось выявить короткие нитевидные выросты — фимбрии, исходящие из клеточной стенки и располагающиеся на поверхности у бактерий.

При определении групповой, родовой и видовой принадлежности бактерий опирались на их ферментативные свойства. По биохимическим признакам все выделенные штаммы были типичными для рода Serratia.

При изучении антибиотикоустойчивости клинических штаммов Serratia, изолированных при урологических, хирургических, гинекологических, кишечных инфекциях и от здоровых людей, было установлено, что из 148 штаммов 92,4% оказались устойчивыми к ампициллину, 88,8% - стрептомицину, 90,4% - рифампицину, 46,3% -тетрациклину, 50,3% - карбенициллину, 36,4% - гентамицину, 37,6% -левамицетину, 50,3% - канамицину, а наибольшей активностью к данным бактериям обладали ципробай (80%), клафоран (95%), лизолин (78%). Анализ антибиотикоустойчивости бактерий показал, что из всех выделенных штаммов 53% обладали устойчивостью к 5 и более применяемым в практике антибиотикам.

Учитывая, что у патогенных бактерий первым этапом развития инфекционного процесса является лиганд — рецепторное взаимодействие, обусловленное адгезией микроорганизмов на специфических рецепторах чувствительных клеток макроорганизма, для выявления адгезинов у бактериальных клеток использовали реакцию гемагглютинации с эритроцитами различных видов животных и птиц. В качестве клеток-мишеней для выявления адгезинов, и выяснения природы структур бактериальной клетки, определяющих у Serratia адгезивную активность, использовали эритроциты цыпленка.

При постановке реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка из 148 штаммов бактерий рода Serratia 39,2% давали маннозочувствительную (MS) и 30,4% маннозорезистентную (MR) реакцию. Среди штаммов способных давать MR реакции гемагглютинации 45,5% проявляли высокую, 35,3% - среднюю и 19,2% слабую адгезивную активности.

В дальнейшем была изучена частота встречаемости MS, так и MR реакции у культур Serratia, выделенных от больных с хирургическими, урологическими, кишечными, гинекологическими заболеваниями, а так же от практически здоровых людей. Так из 58 штаммов, способных давать положительную MS РГА с эритроцитами цыпленка 44,8% оказались выделенными при урологических, 25,9% - хирургических, 10,3% -гинекологических, 15,5% - кишечных заболеваниях и 3,5% - от здоровых людей (Р< 0,05). Из 45 штаммов, способных давать положительную MR РГА, 53,4% - были выделены при урологических, 33,3% - хирургических, 11,1%) — гинекологических, и 2,2% - кишечных заболеваниях.

Одновременно было проведено изучение среднего показателя адгезивности (СПА) в опытах на формализированных эритроцитах I группы крови человека при микроскопическом учете результатов в соответствии с методом Брилис В. И. с соавт. (1986). Результаты исследований показали, что из 148 культур 6,8% штаммов имели высокий показатель СПА, 28,4% - средний, 17,6% - низкий, а. у 47,2% культур, в том числе и у штаммов выделенных от здоровых людей СПА вообще не выявлялся (Р< 0,05).

Полученные результаты исследований подтверждают, что адгезия бактерий рода Serratia — это сложный процесс, при котором специфическое взаимодействие микроба с определенными рецепторами клеток хозяина зависит от наличия определенных фимбриальных структур, однако, адгезивная активность, возможно, зависит и от других структур бактериальной клетки, выяснение которых требует дальнейших исследований.

Учитывая, что гемолизины относят к факторам патогенности, и они могут быть использованы в качестве маркеров при оценке этиологической значимости выделенных культур Welch R.A. et. al., (1987), была изучена а-гемолитическая, тиолзависимая гемолитическая и энтерогемолитическая активности у бактерий рода Serratia.

Наличие а-гемолизина исследовали на эритроцитах I группы крови человека. Результаты проведенных исследований показали, что из 148 изученных штаммов Serratia агемолитической активностью обладали 36 культур, среди которых высокую активность проявляли 58,3% штаммов, среднюю — 25,0% и слабую — 16,7%, а остальные 112 не проявляли а-гемолитической активности.

Из 36 культур, продуцирующих агемолизин, 38,9% были выделены при урологических заболеваниях, 33,3% - при гнойно-воспалительных, 8,3% - при гинекологических, 16,7% - при кишечных инфекциях и 2,8% -от здоровых людей.

Достоверность различий в агемолитической активности между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05). По биохимическим свойствам 52,8% штаммов принадлежали к S. marcescens, 27,7% - S. odorifera, 13,9% - S. liquefaciens и 5,6% - S. rubidarae.

Принимая во внимание, что энтерогемолизин является ведущим фактором в развитии диарейного синдрома мы изучили энтерогемолитическую активность бактерий рода Serratia. Оказалось, что зону двойного лизиса на среде Blood agar (Difco и Oxoid) содержащей 5% дефибринированную кровь барана, и ЮМ хлористый кальций давали 8 штаммов изолированных при кишечных инфекциях. Количественное определение энтерогемолитической активности позволило выявить высокую активность у 4 штаммов (в разведении 1:80), у 2- среднюю (1:40) и 2 слабую (1:10). По биохимическим свойствам 6 культур принадлежали к S. odorifera, по одному к S. marcescens и S. liguefaciens. Штаммы, выделенные от здоровых людей оказались не способными продуцировать энтерогемолизин. — ,.

Анализ корреляции гемолитической активности и вирулентности показал, что наиболее вирулентными при интраназальном заражении белых мышей и в протистоцидном тесте оказались штаммы, обладающие одновременно агемолитической и энтерогемолитической активностями.

Таким образом, результаты данного раздела исследований показали, что клинические штаммы Serratia способны продуцировать агемолизин, синтезировать тиолзависимый и энтерогемолизин.

Были изучены и факторы персистенции, позволяющие возбудителю в целях самосохранения от бактерицидных факторов макроорганизма располагать средствами, направленными на инактивацию механизмов защиты: антилизоцимная (АЛА), антиинтерфероновая (АИА) и антикомплементарная (АКА) активности бактерий (Бухарин О.В., 1999).

Результаты исследований показали, что из 128 клинических штаммов АЛА обладали 69 культур, из них 40 были выделены от больных с урологическими, 17- хирургическими, 7- гинекологическими, 5-кишечными заболеваниями и 5 — от здоровых людей. Достоверность различий между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05).По биохимическим свойствам — 41,9% культур относились к S. marcescens, 45,9% - S. odorifera, 12,2% - S. liquefaciens.

АКА признак обеспечивает персистирование микробной клетки и характеризует способность инактивировать комплемент. Изучение частоты встречаемости АКА среди клинических штаммов бактерий рода Serratia^ выделенных при различных инфекционных процессахпоказало, что из 148 штаммов АКА обладали 53 клинических штаммовсреди которых 20 были: выделены при урологических, 17 — хирургических, по 8 -гинекологических и кишечных инфекциях, 5 — от здоровых людей (Р<0,05).

Таким образом результаты данного раздела исследований, дают основание заключить, что клинические штаммы бактериирода Serratia, выделенные от больных с различными1 инфекционными заболеваниями: чаще обладают персистирующими-. свойствами (AJIA, АИА, АКА), чем штаммы изолированные от здоровых людей (Р<0,05), что необходимо учитывать при оценке этиологической значимости бактерий родаSerratia:

Лецитиназа — фермент агрессии, биологическаяролькоторойзаключается в растворении лецитина оболочек и мембран клеток, что позволяет считать, лецитиназную активность одним из показателей вирулентности бактерий:

Исходя изэтого, была изучена лецитиназная активность клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Как показали результаты наших исследований, из 148 культур Serratia лецитиназной активностью обладали 35 культурсреди которых высокую лецитиназную активность проявляли 34,3%, среднюю — 48,6% и слабую — 17,1%.

Структура распределения штаммовс лецитиназнойактивностью, выделенных при урологических, инфекциях выявляется более половины штаммов с определяемым признаком (51,4%) и 22,9% бактерий при хирургической патологии и только. 5,7% бактерий было выделено от здоровых лиц. Достоверность различий между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05).

Таким образомрезультаты проведенных исследований показали, что клинические штаммы Serratia, выделенные от больных с инфекционными процессами различной локализации, чаще обладают лецитиназной активностью, что позволяет рекомендовать этот метод при отнесении выделенных штаммов к этиологическим.

Учитывая, что нуклеиновые кислоты являются основным субстратом действия ДНК-аз и РНКаз, понятен интерес исследователей к изучению этих ферментов, связанных с патогенностью бактерий (Jacob S.L. et al., 1964, ledakis N. et al., 1974). Подтвреждением тому является, что некоторые представители семейства Enterobacteriaceae, выделенные от больных гнойновоспалительными и острыми кишечными инфекциями, по сравнению с культурами изолированными из окружающей среды и от здоровых людей чаще обладают ДНКазной активностью (Nassif X., 1987).

В этой связи мы изучили частоту встречаемости среди клинических штаммов бактерий рода Serratia, ДНКазную активность.

В ходе проведенных нами исследований по изучению ДНКазной. активности было установлено, что из 148 штаммов 48 обладали ДНК-азной активностью, среди которых 37,6% штаммов проявляли высокую, 31,2% -среднюю, 31,2% - слабую активности. Подавляющее количество бактерий с ДНК — азной активностью выделялось при хирургической патологии (41,7%) и от урологических больных (39,6%), доля выделенных:-микроорганизмов от здоровых составила 4,2%. По видовой принадлежности штаммы распределились следующим образом: 39,6% - S. marcescens, 43,8% - S. odorifera, 16,6% - S. liquefaciens.

В дальнейшим была изучена корреляция ДНК — азной активности с их вирулентностью в опытах интраназального заражения белых мышей и на модели инфузорий туфелек. Анализ полученных результатов показал, что из 48 ДНК — аза активных штаммов 15 обладали вирулентностью, среди которых 46,7% проявляли высокую, 40,0% - среднюю и 13,3% -низкую ДНК — азную активность. Таким образом проведенные исследования показали, что ДНКазная активность в комплексе с другими факторами патогенности может быть использована в качестве маркера оценки этиологической значимости клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Для сравнительной оценки частоты встречаемости патогенных вариантов бактерий рода Serratia использовали следующие тесты:

• отек лапки на беспородных белых мышах;

• изолированная петля тонкого кишечника кролика;

• интраназальное заражение беспородных белых мышей;

• тест на простейших (протистоцидная активность).

Принимая во внимание работу Вартаняна Ю. П. и соавт., 1984 о возможности использования метода «отек лап» для выявления у бактерий термолабильных токсических веществ типа энтеротоксинов, мы на беспородных белых мышах (весом 18−20г) провели исследования по обнаружению термолабильных токсических компонентов в центрифугате 20 часовой бульонной культуры клинических штаммов бактерий рода Serratia. Предварительные исследования показали, что из 148 исследованных культур Serratia при введении центрифугата 20- часовой бульонной культуры 21 штамма давали разницу между опытом и контролем (65 мг и более). Среди них 23,8% штаммов оказались способными продуцировать LT-энтеротоксин высокой активности (разница составила 105 мг и более), из них 3 культуры — S. marcescens, 2 культуры — Sodorifera, 23,8% штаммов с разницей от 75 до 95 мг. условно считали способными продуцировать активный LTэнтеротоксин, центрифугаты 52,4% штаммов (от 65 до 75 мг) считали способными продуцировать LTэнтеротоксин слабой активности, тогда как штаммы, дающие разницу между опытными и контрольными лапками менее 65 мг, считали не способными продуцировать LTэнтеротоксин. Ни один штамм, выделенный от здоровых людей, не давал отек лап белых мышей более 65 мг (Р<0,05).

В дальнейшим определение способности культур продуцировать LT-энтеротоксин проводили в опытах изолированный петли тонкого кишечника кролика.

Необходимо отметить, что штаммы продуцирующие энтеротоксины и энтеротгемолизин, вызывали патоморфологические и гистологические изменения кишечника. Патоморфологическая картина поражения кишечника в известной степени дифференцировалась в зависимости от наиболее выраженных фенотипических свойств, наличие которых коррелирует с патогенностью бактерий.

Наиболее чувствительным методом при изучении вирулентности бактерий оказался метод интраназального заражения белых мышей (весом 18−20), который позволял определять динамику развития острой токсической пневмонии от момента введения возбудителя, а по времени гибели и количеству погибших животных установить степень вирулентности бактерий.

Вирулентность была изучена у 148 клинических штаммов Serratia. При этом только 3,4% штаммов оказались способными вызывать острую токсическую пневмонию с гибелью более 50% животных в течение 5 часов от начала заражения, 5,4% в течение 12−18 часов вызывали гибель до 50% (средняя степень вирулентности) и 8,1% (слабая степень вирулентности), вызывали гибель 50% животных в течение 36 — 48 часов, 83,1% штаммов были авирулентными, (не вызывали гибель или болезненное состояние животных). Штаммы выделенные от здоровых людей оказались авирулентными (Р<0,05).

С целью выявления цитотоксических токсинов бактерий был использован протистоцидный тест, который, по мнению X.JI. Галикеева и соавт., (1987) позволяет оценивать не только наличие токсинов, но и определять степень вирулентности микроорганизмов в зависимости от времени гибели инфузорий туфелек.

За поведением инфузорий наблюдали до и после внесения суспензии культур Serratia. Оказалось, что при добавлении суспензии вирулентных штаммов движения инфузорий замедлялись и полностью прекращались.

Анализ полученных результатов показал, что 5 штаммов, вызывающих гибель инфузорий в течение 30- 90 секунд, оказались способными вызывать «отек лап» с разницей 105 мг. и более, вызывал гибель более 50% взятых в опыт белых мышей в течение 5 часов с момента интраназального заражения. Из 14 штаммов, вызывающих гибель инфузорий в течение 1,5 — 5,5 минут, 71,4% оказались способными вызывать «отек лап» до 65 мг. и гибель до 50% животных в течение 18 часов, а 4 штамма вызывали лишь некоторое болезненное состояние в поведении животных.

Изучение взаимодействия штаммов Serratia с простейшими позволило выявить у штаммов сочетание свойств, вызывающих токсическую пневмонию, «отек лап» и гибель инфузорий — туфелек.

Таким образом, результаты проведенных исследований дали основание заключить, что время, в течение которого происходит гибель инфузорий, зависит от биологической активности клинических штаммов Serratia, в частности от их продукции токсических веществ, наличие которых у бактерий сочетается с их способностью вызывать гибель белых мышей при их интраназальном заражении.

Используя отработанный нами способ определения адгезивной активности бактерий мы попытались выяснить природу генетического детерминанта факторов патогенности клинических штаммов Serratia.

Вначале была выяснена роль плазмид в способности бактерии рода Serratia давать D — маннозочувствительную и D — маннозорезистентную реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка (Еабидуллин 3.F. и соавт., 1987). Для этого было отобрано 27 культур с высокой адгезивной активностью и изучен профиль их плазмидной ДНК (Kado G.T., Liu S.T. 1981). При этом 13 штаммов оказались несущими плазмиды. Все плазмидонесущие штаммы были представлены клиническими изолятами. Молекулярные массы плазмид значительно различались. Так электрофоретически было установлено, что бактерии рода Serratia могут нести плазмиды массой от 19 до 120 МД. В качестве контроля использовали штамм S. marcescens ГИСК № 268, несущей плазмиду массой 120 МД, обладающийсвойством давать D-маннозочувсвительную и Dманнозорезистентную реакции геммаглютинации с эритроцитами цыпленка и его изогенный, бесплазмидный вариант. При этом у изогенных культур не выявлено наличие разницы в их способности давать реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка:

Наши попытки в опытах прямой передачи. плазмид осуществить между штаммами Serratia spp, передачидетерминанта, контролирующего реакцию? гемагглютинации с эритроцитами цыпленка не увенчались успехом. Полученные результаты дали нам основание заключить, что генетическим детерминантом, контролирующей MR* и MS реакции у Serratia, возможно являются структурные элементы хромосомной природы.

Для выявления природы генетического детерминанта, контролирующего синтез LTэнтеротоксина использовали две группы штаммов и изучали профиль их плазмидной ДНК. Первую группу составляли 3 штамма, продуцирующие высокоактивный LTэнтеротоксин, который вызывали отек лап. более 100 мг, вторую- 4 штамма, не продуцирующие LT — энтеротоксина и вызывающие «отек лап» не более 35 мг. Из 3 штаммов суперпродуцентов LTэнтеротоксина 2 -оказались несущими плазмиду массой 60 МД' и 1 штамм 40 МД, а у 4 штаммов второй группы не было выявлено плазмиды массой 60 МД.

В следующей серии опытов изучали возможность конъюгативной передачи Ent плазмиды между бактериями рода Serratia и от Serratia к.

E.coli K12 G62 Rif®. В качестве донора брали S. marcescens (Ent+, Str®, Amps) и реципиента S. marcescens (Ent", Strs, Amp®). В качестве селективной среды использовали, 2% мясопептонный агар, содержащий 500мкг/мл. стрептомицина и- 300 мкг/мл. ампицилина. Полученные трансконъюгаты были способны давать «отек лап» 95 мг и более и на фореграмме просматривалась плазмиды массой 60 МД.

Наши попытки в опытах прямой передачи плазмид осуществить передачу Ent плазмиды от Serratia к E. coli К12 G62 Rif® не имели успеха.

Полученные данные дали нам основание считать, что генетическим' детерминантом, контролирующий у бактерий рода Serratia продукцию LT — энтеротоксина, возможно, является конъюгативная плазмида массой 60 МД, выявляемая у ряда бактерий, вызывающих «отек лап» 95 мг. и более.

По мнению Ильинской В. В1, Керашевой С. И. (1979), Петровской B.F. с соавт. (1983) гемолизины могут быть отнесены к фактору, потенциальной патогенности энтеробактерий, в том числе и для бактерий рода Serratia.

В связи с этим мыпопытались выяснить природу генетического детерминанта, контролирующего свойство продуцировать агемолизин:

Исследование проводили на 8 штаммах бактерий рода Serratia, обладающих агемолитической активностью, и 6 штаммах, не способных продуцировать агемолизин. В качестве эталонной культуры использовали штамм P. vulgaris Rts-1, обладающий агемолитической активностьюи несущий плазмиду массой 120 МД. Результаты исследований показали, что среди клонов 8 штаммов, обладающих агемолитической-активностью, у большинства была обнаружена плазмида массой 120 МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции а-гемолизина.

В дальнейшим эти плазмиды элиминировали по общепринятой методике и у клонов изучали профиль плазмидной ДНК. При этом клоны 6 штаммов потеряли способность, продуцировать агемолизин, а на фореграмме не просматривалась плазмида массой 120 МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции агемолизина. Тем не менее, некоторые клоны, утратившие плазмиды массой 120МД продолжали продуцировать агемолизин, что свидетельствовало о вероятности существования у Serratia генетического детерминанта иной природы, контролирующею продукцию агемолизина. Все наши попытки осуществить конъюгативную передачу плазмиды массой 120 МД между бактериями рода Serratia и от Serratia к универсальному реципиенту E. coli Kl2 G62 Rif® не увенчались успехом.

Таким образом, результаты наших исследований позволяют полагать, что генетическим детерминантом адгезивной активности бактерий являются структурные элементы хромосомной природыпродукции LT — энтеротоксина — плазмида массой 60 МД, агемолизинаплазмида массой 120 МД и хромосома.

Проведенные опыты по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и коныогативной передачи плазмид не позволили выявить плазмиды контролирующие синтез тиолзависимого гемолизина, энтерогемолизина, лецитиназной и ДНК-азной активности.

Методом ПЦР были протестированы клинические штаммы бактерий рода Serratia в количестве 16 штаммов, выделенных при различных инфекционных процессах и несущих плазмидный профиль с различной молекулярной массой. Из них 8 штаммов относятся к виду S. odorifera, 5 штаммов — к S. marcescens, 2 штамма — S. ligufaciens и один — S. rubidara.

Амплификацию участков ДНК «островков патогенности» осуществляли методом ПЦР. ПЦР проводилась в амплификаторе MC- 16 («ДНКтехнология», Россия). По завершении амплификации из реакционной смеси отбирали аликвоту объемом 10 мкм и анализировали в 1%- 2%-ом агарозном геле, в зависимости от предполагаемого размера фрагмента ДНК.

Проведенные исследования позволили установить факт наличия у протестированных микроорганизмов фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности Е. coli. Среди исследованных штаммов образование искомых ампликонов при использовании праймеров к hly, А и hly В имело место в 4 случаях, cnf 1 — в 2, sfa, А и sfa G — в 2 случаях. При этом у 2-х штаммов одновременно были обнаружены фрагменты генов «островков патогенности» к образованию sfa, А и sfa G, продукции hly, А и hly В, cnf 1, выделенные при урологической и гинекологической инфекциях, (S. marcescens).

Таким образом, наши данные по изучению адгезивной, гемолитической (а-, энтеро-, тиолзависимой гемолизин), LT-энтеротоксигенной, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой активностей, тестов на вирулентность, проводимых в опытах на лабораторных животных, в совокупности служат основанием для отнесения ряда выделенных штаммов Serratia к потенциально патогенным, т. е. этиологически значимым, что следует учитывать при проведении профилактики и лечения заболеваний, вызванных бактериями рода Serratia.