Конструирование иммуноферментных тест-систем на основе авидин-биотинового взаимодействия для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs)

Вакцинопрофилактика рассматривается в настоящее время не только как эффективное, наиболее доступное и экономичное средство в борьбе с инфекциями, но и как средство достижения активного долголетия во всех социальных группах населения развитых и развивающихся стран [14, 16, 17, 39, 112].

Цели и задачи массовой иммунизации в национальных масштабах и в масштабе планеты определяет в настоящее время расширенная программа иммунизации (РПИ), которую сформулировала в 1974 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ). В реализации данной программы участвуют 169 стран мирового сообщества.

В рамках РПИ предусмотрен контроль целого ряда инфекционных болезней с помощью средств специфической профилактики [80, 141, 161, 163].

В системе эпидемиологического надзора за этими инфекциями (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В) важной составной частью является серологический мониторинг. Этой точки зрения придерживаются и эксперты Консультативной группы ВОЗ по проблемам РПИ, которые более 15 лет назад при подготовке рекомендаций и инструкций по целевым национальным программам иммунизации для Европейских стран включили использование в системе эпидемиологического надзора выборочного серологического мониторинга [143].

В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд стран (Финляндия, Швеция, Дания, Польша, Австралия, Япония и др.) включили серологический мониторинг в систему эпидемиологического надзора за инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики [138].

Сыворотка крови служит источником комплексной информации о наличии в ней спектра антител к возбудителям болезней. Способы определения специфических антител могут быть различными. Так, реакция нейтрализации токсина является весьма чувствительным методом и остается «золотым стандартом» при определении дифтерийных и столбнячных антитоксинов. Однако, данный метод весьма дорог, длителен, сложен и требует наличия квалифицированного персонала.

Для определения специфических антител используются также реакции и пассивной гемагглютинации и агглютинации, которые также имеют некоторые недостатки, в частности, невозможность получения точного количественного результата, так как учет проводится визуально и поэтому достаточно субъективен [107].

В настоящее время интенсивно разрабатываются методы иммунофер-ментного анализа, которые по сравнению с другими способами детекции антител обладает следующими преимуществами:

— высокой чувствительностью, которая определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

— возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

— экспрессностью;

— полной безопасностью определений;

— стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА;

— простотой проведения реакции;

— наличием как визуального, так и инструментального учета.

Высокая производительность метода, возможность унификации и стандартизации диагностических тест-систем, а также автоматизация учета результатов делают ИФА предпочтительным при проведении массовых серологических исследований.

В отечественных иммуноферментных тест-системах и большинстве зарубежных, рассчитанных на определение антител различной специфичности в сыворотках крови человека, а опосредованно и антигенов, применяют конъюгаты антивидовых антител (против иммуноглобулина G человека) с ферментами-маркерами. Однако способ получения антивидовых антител, включающий использование животных, достаточно трудоемок и длителен по времени.

Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин-биотин [107, 221, 233, 240]. Исследователи отмечают, что при использовании этих конъюгатов достигается чрезвычайно высокая чувствительность и специфичность определения, а также в значительной степени снижаются фоновые реакции [107, 275].

В качестве универсального детектора в ИФА используется белок, А стафилококка, меченный ферментом. Универсальность этого конъюгата объясняется уникальной способностью белка, А образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека и различных млекопитающих [1,2].

В этой связи актуальны исследования по получению конъюгатов (простых в исполнении и доступных по цене) и создания на их основе иммуно-ферментных тест-систем, пригодных для массовых серологических исследований.

Цель исследования — экспериментально обосновать и сконструировать твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) на основе ампли-фицирующего комплекса авидин-биотин.

Задачи исследования.

1. Разработать эффективный и технологичный способ приготовления конъюгата.

2. Сконструировать оптимальные композиции иммуноферментных тест-систем на основе амплифицирующего авидин-биотинового комплекса.

3. Оценить качество разработанных тест-систем по следующим критериям: линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами.

4. Определить область применения разработанных иммуноферментных тест-систем.

Научная новизна.

1. Впервые предложен универсальный антиглобулиновый маркер на основе белка, А золотистого стафилококка, меченного биотином. Показана возможность эффективного применения сконструированного конъюгата для определения антител различной специфичности (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) в сыворотках крови человека и животных.

2. Экспериментально обоснована и разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для выявления анти-HBs с использованием биотинилированного конъюгата на основе рекомбинантного HBsAg (патент № 2 206 095 от 10.06.03 г.).

3. Впервые разработана оригинальная конструкция иммуноферментной тест-системы для определения коклюшных антител на основе биотинилированного белка, А (приоритетная справка № 2 006 127 549 от 31.07.2006 г.).

Практическая значимость работы.

1. Разработана технология приготовления универсальных конъюгатов на основе биотинилированных белка, А и рекомбинантного HBsAg, не требующая больших экономических затрат.

2. Разработана и утверждена нормативно-техническая документация на производство тест-системы иммуноферментной для выявления антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (Фармакопейная статья № 420 504 656 005, Производственный регламент № 4 862 997−79−06). Получено регистрационное удостоверение (JIC-884 от 03.11.2005 г.) и лицензия на производство (99−04−97 от 27.10.2005 г.).

3. Использование разработанных тест-систем обеспечивает эффективный серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами иммунопрофилактики, на основе количественной оценки уровня специфических антител.

4. Изданы и внедрены в работу территориальных отделов Управления Роспотребнадзора по Пермскому краю и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» методические рекомендации «Эпидемиологический надзор и контроль за коклюшной инфекцией».

Положения, выносимые на защиту.

1. Получены универсальные конъюгаты и сконструированы на их основе иммуноферментные тест-системы для индикации специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs).

2. Разработанные тест-системы соответствуют критериям, предъявляемым ВОЗ к наборам для иммунологических испытаний (линейность и параллелизм, чувствительность, специфичность, точность, сравнение с референс-методами).

3. Определена область применения разработанных иммуноферментных тест-систем.

Выводы.

1. Разработан эффективный и технологичный способ получения конъюгатов на основе белка, А и HBsAg, меченных биотином.

2. Впервые с применением амплифицирующей системы авидин-биотин разработаны конструкции иммуноферментных тест-систем для определения специфических антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) в сыворотках крови, как людей, так и животных.

3. Качество разработанных тест-систем соответствует требованиям ВОЗ, предъявляемым к наборам для иммунологических испытаний, по следующим критериям: линейность и параллелизм, специфичность, чувствительность, точность, сравнение с референс-методами.

4. Научно обоснована возможность использования разработанных иммуноферментных тест-систем в реальной практике для серологического мониторинга за инфекциями, управляемым" средствами иммунопрофилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В), а также для оценки качества профилактических препаратов.

Заключение

.

Вакцинопрофилактика рассматривается в настоящее время не только как эффективное, наиболее доступное и экономичное средство в борьбе с инфекциями, но и как средство достижения активного долголетия во всех социальных группах населения развитых и развивающихся стран [14, 110]. Успех программ вакцинопрофилактики во многом определяется эффективностью эпидемиологического надзора за управляемыми инфекциями, в котором важная роль принадлежит серологическому мониторингу специфического антиинфекционного иммунитета [129, 141, 160].

В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд стран (Финляндия, Швеция, Дания, Польша, Австралия, Япония и др.) включили серологический мониторинг в систему эпидемиологического надзора за инфекциями, управляемыми средствами специфической профилактики [138].

Современным требованиям эпидемиологической практики в значительной степени отвечает иммуноферментный анализ (ИФА), который позволяет организовать эффективную систему диагностики иммунитета на основе точной инструментальной оценки уровня специфических анггител [189].

В отечественных иммуноферментных тест-системах и большинстве зарубежных, рассчитанных на определение антител различной специфичности в сыворотках крови человека, используются варианты твердофазного ИФА, основанные на фиксации антител на нерастворимой основе (обычно полистироловых планшетах с иммобилизованным антигеном) с последующим тестированием связанных антител при помощи индикаторной системы — конъюгатов антивидовых антител (против иммуноглобулина G человека) с ферментами-маркерами.

Однако технология приготовления антивидовых антител, связанная с использованием животных, очень сложна, длительна по времени, трудоемка и вследствие этого высокозатратна. Кроме того, к недостаткам систем с антивидовыми конъюгатами относятся и неспецифические взаимодействия, которые могут иметь место между антиглобулином, меченным ферментом, и гетерологичным иммуноглобулином, присутствующим в клиническом образце, либо с антителом, фиксированным на твердой фазе [274].

В связи с этим актуален поиск новых эффективных и технологичных путей синтеза ферментных конъюгатов.

Перспективным направлением в ИФА является использование амплифи-цирующей системы авидин-биотин. Исследователи отмечают, что при применении авидин-биотиновых конъюгатов достигается чрезвычайно высокая чувствительность и специфичность определения, а также в значительной степени снижаются фоновые реакции [ 189, 234].

Все вышесказанное предопределило цель исследования — экспериментально обосновать и сконструировать твердофазные иммуноферментные тест-системы для определения антител (дифтерийных, столбнячных, коклюшных, анти-HBs) на основе амплифицирующего комплекса авидин-биотин.

Одним из важнейших моментов в программе конкретных инженерных разработок иммуноферментного метода определения специфических антител является выбор оптимальных реагентов для основных составляющих тест-систем — конъюгатов.

В своих исследованиях мы пошли по пути создания конъюгата на основе белка А, обладающего уникальной способностью образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека и различных млекопитающих [1, 2]. Выбор этого реагента в значительной степени был обусловлен тем, что в Пермском НПО «Биомед» разработана оригинальная промышленная технология получения белка А, не уступающего по своим качественным характеристикам препаратам зарубежных фирм (Sigma, Pharmacia).

Известно, что один из наиболее эффективных методов введения ферментной метки основан на использовании авидина и биотина, образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М" 1, что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген-антитело [193].

В связи с этим были проведены эксперименты по отработке оптимальной методики биотинилирования белка А, в результате которых была обоснована технология приготовления стандартных препаратов белка А, меченных биотином.

Основные физико-химические параметры ИФА, а именно чувствительность, точность и воспроизводимость, могут существенно изменяться при варьировании условий проведения эксперимента, что обусловливает необходимость оптимизации каждой стадии анализа.

Для определения оптимальных условий проведения иммуноферментной реакции были исследованы варианты возможных реагентов и параметры их применения: выбор антигенов, блокирующего агента, системы детекции, субстратаопределены оптимальные концентрации реагентов, состав, рН буферных растворов, а также оптимальная температура и время проведения отдельных этапов реакции.

На первом этапе работы были определены условия иммобилизации каждого из исследованных антигенов на твердую фазу. Было установлено, что оптимальной сенсибилизирующей дозой для столбнячного и дифтерийного анатоксинов является 10 мкг/мл (по белку), для коклюшной суспензии — 5 млрд. кл/мл. в 0,1 моль/л карбонат-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6, а для HBsAg — 1 мкг/мл (по белку) в 0,01 моль/л фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,2−7,4.

При выборе оптимального температурного режима и сроков инкубации антигенов на планшетах были использованы следующие параметры: 2, 24, 48 часов при температуре 4 и 37 °C. Результаты изучения влияния температуры и времени фиксации антигена на интенсивность реакции показали, что оптимальными условиями являются: температура 4 °C и время инкубации 48 часов.

Изменения свойств иммобилизованных антигенов не наблюдалось при хранении в течение 12 месяцев при температуре 2−8 °С.

В следующей серии модельных экспериментов была проведена сравнительная оценка полученного конъюгата на основе биотинилированного белка.

А и конъюгатов, меченных пероксидазой хрена (антивидовой и белок А-пероксидаза).

При оценке различных конъюгатов использовали коэффициент позитивности (КП) — отношение средней оптической плотности положительных контрольных образцов к средней оптической плотности отрицательных контрольных образцов (ОП К+ / ОП К-). Оптимальным считали конъюгат, при использовании которого КП составлял не менее 10,0- а оптическая плотность Кбыла не более 0,150.

Было установлено, что все исследованные конъюгаты обеспечивали достаточную чувствительность анализа при определении дифтерийных и столбнячных антител. При использовании конъюгата белок А-пероксидаза при определении коклюшных антител наблюдался высокий уровень фоновых реакций (ОП Кболее 0,150), тогда как при применении конъюгатов белок А-биотин и антивидового уровень фоновых реакций был низким (ОП Кменее 0,150).

Кроме того, было показано, что все исследованные конъюгаты не обеспечивали необходимой чувствительности анализа при определении анти-HBs в сыворотках крови человека.

В связи с этим были проведены эксперименты по созданию конъюгата для определения анти-HBs на основе биотинилированного рекомбинантного HBsAg.

В результате проведенных исследований была разработана конструкция ИФТС, основанная на взаимодействии антигена (дифтерийного, столбнячного, коклюшного или HBsAg), иммобилизованного на полистироловом планшете с антителами, содержащимися в сыворотке крови человека или животных. После фиксации на твердой фазе специфических реагирующих антител не прореагировавшие компоненты системы удаляют из сферы реакции путем последовательных промывок белково-солевым раствором с детергентом. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью амплифици-рующей авидин-биотиновой системы, состоящей из белка, А или HBsAg, меченных биотином и авидина, меченного пероксидазой хрена, которая обусловливает гидролиз перекиси водорода, регистрируемой по изменению окраски индикатора (ТМБ).

Важно отметить, что все разработанные ИФТС содержат универсальные реагенты, а методика постановки ИФА основана на одинаковом наборе манипуляций, что существенно упрощает их применение.

При создании любой ИФТС необходимо быть уверенным в том, что ее характеристики позволяют использовать ее для решения конкретных задач. Подобная оценка должна быть проведена в форме валидации, которая является важной частью системы обеспечения и контроля качества тест-систем [41].

Валидационные исследования были проведены в соответствии с требованиями ВОЗ, предъявляемыми к наборам для иммунологических испытаний.

Дисперсионный анализ показал наличие линейности и параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и положительного контрольного образца (калибрователя).

Специфичность разработанных тест-систем была подтверждена в тесте блокирования. Предварительная инкубация положительных контрольных образцов с различными антигенами приводила к существенному блокированию их активности в ИФА только при использовании антигена, специфичного для тестируемых антител.

Точность результатов измерений в пределах одной серии испытаний (внутрипостановочный коэффициент вариации — ВКВ) и разных серий испытаний (межпостановочный коэффициент вариации — МКВ) для разработанных тест-систем была весьма высокой — коэффициенты вариации не превышали 10%. Была установлена также высокая степень корреляции результатов параллельного исследования сывороток с помощью разработанных ИФТС и регламентированных методов (реакцией нейтрализации при определении дифтерийных и столбнячных антител, реакции агглютинации при определении коклюшных антител, а также с импортными тест-системами при определении анти-HBs) — коэффициенты корреляции составили 0,86−0,93.

Таким образом, проведенные исследования показали, что разработанные ИФТС для выявления дифтерийных, столбнячных, коклюшных антител и анти-HBs обеспечивают достаточно высокую степень достоверности результатов иммуноферментного анализа.

Экспериментальные разработки позволили провести исследования в направлении решения ряда практических задач использования предлагаемых ИФТС.

В экспериментах на животных и наблюдениях на людях была обоснована возможность использования разработанных ИФТС для контроля эффективности иммунизации, при этом тест-системы дают возможность выявлять уровень специфических антител на любой стадии цикла вакцинации, что может служить основанием для определения дальнейшей тактики иммунизации.

Тест-система для определения анти-HBs была успешно применена для обоснования тактики экстренной специфической профилактики гепатита В в эксперименте и наблюдениях на людях. При этом было показано, что оптимальной схемой экстренной специфической профилактики является одномоментное введение препарата Антигеп (иммуноглобулин человека против гепатита В) и вакцины гепатита В, обеспечивающее быстрое появление антител в концентрации, значительно превышающей протективную с последующим развитием иммунного ответа на HBsAg.

Была исследована возможность применения разработанных ИФТС для определения концентрации специфических антител в препаратах иммуноглобулинов.

Разработанные ИФТС били успешно использованы также для определения концентрации анти-HBs в сыворотках крови людей, больных гепатитом В при клинических испытаниях препарата Антигеп (ИФА анти-В) — диагностики коклюшной инфекции (ИФА анти-К) — оценки популяционного иммунитета. При этом основными преимуществами разработанных ИФТС являются автоматизация анализа, стандартизация результатов, исключение субъективизма в интерпретации, и, самое главное, возможность количественной оценки.

В заключение следует отметить, что разработанные ИФТС открывают широкие возможности для проведения массовых эпидемиологических обследований с целью объективной оценки эффективности вакцинации и ревакцинации против дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, характеристики иммунной структуры населения и групп повышенного риска, а также оценки качества иммунобиологических препаратов.