Изучение эффективности фотодинамического действия сенсибилизаторов, используемых в фотодинамической терапии, на клеточных моделях

Актуальность работы. Энергия видимого света, имеющего длину волны 400 — 750 нм, составляет около 45% всей энергии солнечного спектра, падающей на Землю. При прохождении через атмосферу он ослабляется в меньшей степени по сравнению с ультрафиолетовым излучением. В связи с этим видимый свет является одним из наиболее важных экологических факторов, влияющих на живые организмы. Видимый свет является основным источником энергии для поддержания жизни, а фоторегуляторные реакции необходимы для правильной организации биологических процессов, протекающих в одноклеточных и многоклеточных организмах. Наиболее важную группу фотобиологических процессов, которые вызывает видимый свет, составляют фотоэнергетические (фотосинтез), фотоинформационные (зрение у животныхфототропизм, фототаксис, фотопериодизм и другие — у растений) и фоторегуляторные процессы. Последние активно влияют на многие стороны жизнедеятельности организмов — рост, развитие, дифференцировку, биосинтез различных ферментов, пигментов и других биологически активных соединений.

Первоначальным событием, способным запустить цепь тех или иных фоторегуляторных реакций, является поглощение видимого света хромофорами, которые по своим структурным особенностям могут быть разделены на три основные группы: 1) циклические и линейные тетрапирролы, (порфирины, фитохромобилин, фикоцианины) — 2) полиены (ретиналь) — 3) ароматические соединения (флавины, тетрагидрофолаты) [Сапежинский, 1988]. Основным хромофором в пигменте фитохроме, запускающем процессы фотоморфогенеза и фотопериодизма у зеленых растений при действии на них красного и дальнего красного света, является билитриен (фитохромобилин), который представляет собой разомкнутый тетрапиррольный цикл. Зрительный родопсин содержит ретиналь. Возможными фоторецепторами синего света, запускающего процессы фототропизма, каротиногенеза и фототаксиса являются соединения флавиновой природы.

Однако видимый свет способен вызывать и деструктивные реакции, опосредуемые как эндогенными, так и экзогенными сенсибилизаторами. Следствием этих реакций может стать повреждение или гибель организма.

Многие метаболиты, поглощающие свет видимой области спектра, помимо своих основных функций, обладают побочным фотосенсибилизирующим действием, вызывающим повреждения компонентов клеток — белков, липидов, нуклеиновых кислот. В состав клеток входят сотни окрашенных веществ, способных поглощать видимый свет и являющихся потенциальными фотосенсибилизаторами. Это витамины, флавины, флавиновые ферменты, НАДН2, каротиноиды, гемсодержащие вещества (хлорофилл и др.), порфирины, билирубин [Сапежинский, 1988, Черницкий, Воробей, 1988]. Кроме того, участвовать в повреждении клетки могут и экзогенные сенсибилизаторы, попавшие в нее — ароматические углеводороды, многие красители, применяющиеся в косметике, пищевой и легкой промышленности, а также лекарственные вещества, такие как тетрациклин, хлорпромазин.

Процессы фотосенсибилизации вызывают особый интерес по ряду причин. Во-первых, создание мощных источников света и повышение уровня загрязненности окружающей среды увеличивают вероятность фотоповреждений с участием экзогенных сенсибилизаторов. Эти фотоповреждения могут вызывать различные кожные заболевания, включая, например, рак кожи. Некоторые нарушения метаболизма в организме приводят к чрезмерному накоплению в тканях эндогенных фотосенсибилизаторов. Так, при наследственном заболевании эритропоэтической протопорфирии увеличение уровня протопорфирина в эритроцитах человека вызывает фотосенсибилизированные реакции, приводящие к гемолизу эритроцитов. В связи с этим возникает проблема защиты и профилактики клеток от фотосенсибилизированных повреждений.

Во-вторых, необходима разработка и усовершенствование способов направленного фотоповреждения клеток и биологических структур, например, для развития метода фотодинамической терапии (ФДТ) опухолей и некоторых кожных заболеваний.

Интерес к проблемам фотодеструкции, изучение ее механизмов, свойств сенсибилизаторов привело к значительным успехам в этой области исследований, что нашло и практическое применение. В последнее время особенно интенсивно развивается медицинское использование процессов фотодеструкции, в частности, для лечения раковых опухолей методом фото динамической терапии. В основе этого метода лежит повреждение видимым светом клеток опухоли, способных избирательно накапливать сенсибилизаторы порфириновой природы. В настоящее время разрабатываются основы и модифицированного метода ФДТ, принцип которого заключается в накоплении эндогенных порфиринов, индуцированном предшественником синтеза порфиринов 5-аминолевулиновой кислотой (АЛК).

В основном в клинике используется облучение красным светом лазерных источников. Это связано с тем, что воздействие красного излучения может быть уникальным, так как, с одной стороны, в дальней красной и ближней инфракрасной области (800−1200 нм) максимальным является проникновение излучения в биологические тканис другой — можно использовать достаточно большие дозы излучения, не опасаясь его повреждающего действия, так как энергия фотонов в этой области спектра низка.

В связи с интенсивным развитием клинического применения фотодинамических эффектов ведутся сравнительные исследования динамики накопления экзогенных и эндогенных сенсибилизаторов в различных опухолях.

Zhengwen Xiao et al, 1998], однако, молекулярно-клеточные механизмы фотодинамического действия на клеточном уровне, в том числе, на культивируемых клетках млекопитающих изучены ещё не достаточно.

В связи с возрастающей устойчивостью микроорганизмов к антибиотикам растет интерес к исследованиям фотодинамической инактивации бактериальных клеток, вызывающих различные заболевания [Malik et. al. 1990, Yoshimura et. al., 1996]. На основе этих исследований и клинических разработок складывается в настоящее время метод фотодинамической антимикробной химиотерапии (ФАХТ).

Поэтому активно исследуется фотодинамическая активность различных эндогенных сенсибилизаторов и пути AJlK-индуцированного синтеза эндогенных сенсибштизаторов-порфиринов в клетках различных организмов. В этих исследованиях одноклеточные организмы, прежде всего, различные виды дрожжей и бактерий, и культивируемые клетки млекопитающих рассматриваются в качестве удобной модели для изучения механизмов регуляции биосинтеза порфиринов и отработки новых методов фотодинамической инактивации клеток с помощью эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей накопления, распределения и эффективности фотодинамического действия некоторых экзогенных и эндогенных сенсибилизаторов на клеточных моделях. Были использованы две моделикультивируемые клетки млекопитающих, о фотодинамическом повреждении которых судили по тесту колониеобразования, и светящиеся бактерии — генно-инженерные штаммы Е. coli с встроенным lux-опероном, — о фотодинамической деструкции которых судили по изменению интенсивности их биолюминесценции.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

— получить на культивируемых клетках млекопитающих зависимости фотодинамического действия от дозы видимого света, концентрации и длительности воздействия различных фотосенсибилизаторов;

— на клеточной модели, позволяющей быстро оценить степень фотодинамического повреждения — светящихся бактериях — получить дозовые, концентрационные и временные зависимости действия экзогенных сенсибилизаторов;

— сравнить на этих моделях эффективность действия различных сенсибилизаторов;

— на основании сравнения действия фотосенсибилизаторов на колониеобразование культивируемых клеток млекопитающих и на биолюминесценцию светящихся бактерий отработать модель для быстрого отбора экзогенных сенсибилизаторов на основании данных об изменении биолюминесценции светящихся бактерий.

Научная новизна работы. Впервые показано, что биолюминесцентная система светящихся бактерий чувствительна к действию различных фотосенсибилизаторов и предложено использовать их для оценки эффективности фото динамического действия. При сравнении фотодинамического действия экзогенных фотосенсибилизаторов в культуре клеток млекопитающих и на бактериях (генно-инженерные штаммы Е. coli, клонированные с lux-опероном) обнаружено, что их влияние на биолюминесценцию бактерий коррелирует с их действием на колониеобразование у клеток млекопитающих. Аналогичная зависимость наблюдается и при индукции биосинтеза эндогенных сенсибилизаторов с помощью АПК.

Полученные данные могут быть использованы для разработки метода быстрой оценки эффективности различных сенсибилизаторов.

Изучены соотношения между накоплением в клетках и фотодинамической эффективностью фотодитазина, а также временная и концентрационная зависимости накопления протопорфирина IX у культивируемых клеток HeLa.

Научная и практическая значимость работы.

Обнаружено, что фотодинамическое повреждение клеток светящихся бактерий приводит не только к их репродуктивной гибели по тесту колониеобразования, но и к снижению их биолюминесценции в ранние сроки после воздействия. Эта реакция биолюминесцентной системы на освещение в присутствии фотосенсибилизатора связана, по-видимому, с тем, что при фотодинамической деструкции повреждается дыхательная цепь, в результате чего в клетке истощается уровень восстановленных флавинов, необходимых для функционирования люциферазы.

Обнаруженная нами корреляция интенсивности биолюминесценции Е. coli и выживаемости культуры клеток HeLa, облученных в одной и той же дозе, позволяет предложить клетки светящихся микроорганизмов, в том числе лиофильно высушенные и регидратированные, в качестве удобной модели для быстрого и эффективного отбора экзогенных сенсибилизаторов, а так же для подбора их действующих концентраций.

Полученные данные о возможности усиления фотодинамического повреждения клеток млекопитающих с помощью модификации процессов биосинтеза порфиринов также могут иметь не только теоретическое, но и практическое значение при фотодинамической терапии опухолей, а предложенные клеточные системы могут быть использованы в качестве адекватной модели для отработки действующих концентраций для ФДТ и ФАХТ.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на II Международной конференции по биофизике (Каир, 1998), на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов, 1 статья, 2 статьи приняты в печать.

Выводы.

1. При изучении фотодинамического действия фотосенса и фотодитазина обнаружена корреляция в их повреждающем воздействии на двух (клеточных моделях — культивируемых клетках млекопитающих HeLa и генно-инженерных штаммах грамотрицательных бактерий E.coli. Показано, что облучение одинаковыми дозами света клеток, проинкубированных с одинаковым количеством красителя, приводит к одинаковой степени снижения как колониеобразования клеток HeLa, так и интенсивности бактериальной биолюминесценции.

2. Обнаружено что на обеих моделях используемый гидрофильный сенсибилизатор фотосенс менее эффективен, чем более гидрофобный фотодитазин.

3. Показано, что динамика накопления фотодитазина культивируемыми клетками HeLa не связана линейно с его фотодинамической эффективностью по тесту колониеобразования. Количества красителя, связавшегося с клетками в течение первых трех часов инкубации, достаточно для максимального проявления эффекта.

4. Выявлено, что экзогенные сенсибилизаторы обладают меньшей эффективностью, чем эндогенные, образованные из добавленной аминолевулиновой кислоты. На обеих моделях сенсибилизаторы образуют ряд ФС < ФД < АПК по возрастанию фотодинамической деструкции.

5. Впервые показано, что биолюминесцентная система светящихся бактерий по чувствительности к фотодинамическому действию красителей близка к колониеобразованию культивируемых клеток млекопитающих, что позволяет рекомендовать люминесцентные бактерии в качестве модели для быстрого отбора фотосенсибилизаторов, используемых в ФДТ онкологических и инфекционных заболеваний.

Заключение

.

Исследования биологического действия различных физических факторов на различные клеточные модели (ионизирующая радиация, УФ-излучение различных диапазонов) свидетельствует о том, что основные закономерности этих эффектов определяются мишенью этого действия. Сходство эффектов, наблюдаемых на 2-х различных клеточных моделях, культивируемых клетках млекопитающих и способных к биолюминесценции штаммах Е. coli, позволяют предположить, что и в фотодинамической деструкции ее основные закономерности определяются ее мишенью.

В частности, различия в фотодинамической эффективности двух используемых экзогенных сенсибилизаторов, фотодитазина и фотосенса на обеих моделях связаны, возможно с тем, что фотодитазин, как более гидрофобное соединение, локализуется на мембране и таким образом вызывает более ярко выраженную фотодинамическую деструкцию, как в клетках HeLa, так и в клетках Е. coli. Фотосенс, благодаря своим гидрофильным свойствам, видимо, накапливается по большей части в цитоплазме либо менее прочно связывается с мембраной и, в результате, в наших экспериментах вызывает меньший фотодинамический эффект. Эти различия хорошо выражены, несмотря на различия в фотовыцветании этих соединений: фотодитазин очень быстро выгорает на свету, а фотовыцветание фотосенса в используемом нами диапазоне доз света отсутствует.

Однотипное действие фотодитазина на клетки HeLa и на клетки Е. coli может быть связано с тем, что повреждение мембраны является одним из ключевых для снижения колониеобразования клеток HeLa в результате интерфазной и репродуктивной их гибели, и для снижения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма Е. coli.

Известно, что основной причиной репродуктивной гибели клеток является повреждение ДНК. Однако определенный вклад в нее может вносить и изменение цитоплазматической мембраны, например, изменение ее адгезивных свойств и снижение способности клеток к прикреплению к стеклу [Яаеу е! а1., 1982]. Кроме того, повреждение мембраны как при действии длинноволнового УФ-излучения, так и при фотодинамическом действии, в результате определенной последовательности процессов (нарушение работы электронно-транспортной цепи, накопление продуктов перекисного окисления липидов, вызывающих повреждения в ДНК) может вызывать не только к интерфазную, но и репродуктивную гибель клеток.

В отношении биолюминесцентной системы микроорганизмов большинство исследователей склоняется к тому, что эта система или по крайней мере часть ее компонентов, участвующих в биолюминесцентной реакции локализована в мембранах [Ые'етап е! а1., 1977; Данилов, Егоров, 1990]. Лишь немногие полагают, что полученные ими экспериментальные данные свидетельствуют о том, что биолюминесцентная система может находиться в цитозоле и в периплазматическом пространстве [Сальников и др., 1984]. Видимо именно поэтому, как и в клетках НеЬа, у способной к биолюминесценции генно-инженерной Е. соИ мембранотропный фотосенсибилизатор вызывает более выраженное повреждение, чем гидрофильный.

Кроме того, есть основания предполагать, что фотодитазин является более эффективным сенсибилизатором, чем фотосенс, благодаря тому, что он лучше проникает в клетки из-за меньших размеров, особенно из-за меньшего количества заряженных боковых групп.

Следует отметить, что в клинических исследованиях, где практикуется многократное облучение опухоли, которое обычно более эффективно, чем однократное длительное облучение [Мевзшапп еГ а1.5 1997, ОгЙ1 е! а1., 1998], и где каждая доза в серии не меньше тех доз, которые мы использовали при однократном облучении, фотосенс действует как более эффективный фотосенсибилизатор. Возможно, это связано с отсутствием его фотовыцветания. Следует упомянуть, что этим же свойством обусловливается и крайне высокая и длительная его фототоксичность для кожи [Огф е1. а1., 1998]. Таким образом, в случае использования больших доз света фотосенс оказывает более эффективное фотодинамическое воздействие, а при воздействии доз видимого света на порядок меньших более эффективным фотосенсибилизатором является фотодитазин.

Высокая эффективность действия эндогенного сенсибилизатора АЛК, вероятно, связана с местом внутриклеточной локализации синтезируемого протопорфирина IX. В работе [Кепр ТаЬа1а е1 а!., 1997] при сравнительном изучении фотодинамической эффективности экзогенного протопорфирина IX, локализующегося на цитоплазматической мембране и протопорфирина IX, образующегося в митохондриальной мембране при добавлении к клеткам АЛК, было обнаружено значительно большее повреждение клеток при действии эндогенного протопорфирина IX. Было показано, что добавление 0,7 мМ АЛК в среду культивирования клеток НеЬа приводит к образованию внутри клеток примерно Ю" 10 М протопорфирина IX на мг белка, такое же количество протопорфирина IX оказывается прочно связанным с клетками после их инкубации с 10″ 6 М экзогенного протопорфирина. При этом примерно одинаковое количество внутриклеточного протопорфирина IX, индуцированного АЛК и накопленного из экзогенно добавленного препарата, снижало выживаемость клеток НеЬа до 0,01% и до 90% соответственно.

В наших экспериментах с АЛК получены аналогичные данные. Добавление 0,5 мМ АЛК, которая, судя по данным литературы, вызывает образование примерно такого же количества протопорфирина IX, что и добавление 10″ 3 мМ протопорфирина IX, приводило к большему повреждению клеток, чем добавление 3,8*10″ 3 мМ фотодитазина.

Остается пока неясным, идет ли фотодинамическое повреждение колониеобразования клеток HeLa и биолюминесцентной системы микроорганизмов в соответствии с первым или вторым типом фотодинамического повреждения. В частности, по результатам британских исследователей фотодинамическая деструкция с помощью аналога фотосенсадисульфоната фталоцианина алюминия в клетках млекопитающих идет в основном по первому типу, а в бактериальных и дрожжевых клетках протекает, наоборот, по второму типу [Oldham & Phillips, 2000].

Наиболее интересно то, что полученные сравнительные данные об эффективности действия фотосенса, фотодитазина и АЛК на клетках HeLa и клетках Е. coli (фотодинамическая эффективность исследованных соединений и в той и в другой модели составляет ряд ФС > ФД > АЛК) позволяют считать перспективными дальнейшие исследования фотодинамической эффективности красителей на светящихся бактериях. На их основе может быть создана модель для быстрой предварительной оценки темновой токсичности и фотосенсибилизирующей активности новых соединений для фотодинамической терапии.