Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Изучение механизмов регуляции трансляции мРНК YB-1 (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Мультифункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1)
1. История открытия и номенклатура семейства Y-бокс-связывающих белков
2. Свойства и структурно-функциональная организация Y-бокс-связывающих белков
- 2. 1. Общие свойства Y-бокс-связывающих белков
- 2. 2. Свойства Y-бокс-связывающего белка 1 (YB-1)
  - 2. 2. 1. Взаимодействие YB-1 с белками
  - 2. 2. 2. Особенности взаимодействия YB-1 с ДНК и РНК
3. Функции YB-1 в ядре
- 3. 1. Участие YB-1 в транскрипции
- 3. 2. Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК
- 3. 3. Участие YB-1 в сплайсинге мРНК
4. Функции YB-1 в цитоплазме
5. Перераспределение YB-1 между ядром и цитоплазмой
6. Участие YB-1 в эмбриональном развитии
7. YB-1 и раковая трансформация клеток
8. Структура гена YB-1 и регуляция его экспрессии
II. Роль 3' НТО мРНК в регуляции трансляции
1. Регуляция с участием белков, взаимодействующих с 3' НТО
2. Регуляция трансляции микрорегуляторными РНК, специфически связывающимися с 3' НТО
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Использованные в работе плазмиды. Получение конструкций, содержащих ген YB-1 с мутациями в регуляторной последовательности
2. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК
3. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia col
4. Обработка плазмиды рестриктазой
5. Лигирование Т4-ДНК-лигазой
6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
8. Выделение рекомбинаитного РАВР
9. Выделение рексшбинантного YB
10. Бесклеточная система трансляции (БСТ) из ретикулоцитов кролика
11. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
12. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы
13. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле в присутствии мочевины
14. Метод замедления подвижности РНК-белковых комплексов в геле (Gel-shift assay)
15. РНК-белковые сшивки под действием ультрафиолетового облучения
16. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы
17. Получение суммарной РНК из лизата ретикулоцитов кролика
18. Получение меченого фрагмента кДНК (ДНК-зонда)
19. Детекция мРНК YB-1 при помощи радиоактивного зонда (Northern-dot анализ)
20. Дефосфрилирование фрагмента РНК
21. Мечение фрагмента РНК по 5' концу
22. Картирование сайтов связывания белков с фрагментом РНК
23. Биотинилирование РНК
24. Выделение белков лизата ретикулоцитов кролика с использованием биотинилированной РНК
25. Иммунологический анализ белковых препаратов (иммуноблоттинг)
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. YB-1 ингибирует трансляцию собственной мРНК на стадии инициации, подавляя присоединение к мРНК 43 S преинициаторного комплекса
2. РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, стимулируя присоединение к мРНК 43 S преинициаторного комплекса
3. Локализация сайтов связывания YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1 методом футпринтинга
4. Подтверждение специфичности взаимодействия YB-1 и РАВР с сайтами их связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1, идентифицированными методом футпринтинга
5. РАВР и YB-1 способны вытеснять друг друга из комплекса с регуляторной последовательностью мРНК YB
6. Влияние мутаций в YB-1- и РАВР-связывающих сайтах мРНК YB-1 на её трансляцию
7. РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB
8. Влияние полиаденилирования на трансляцию мРНК YB
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Регуляция трансляции мРНК YB-1 и её место в общей регуляции белкового синтеза
2. Возможные механизмы влияния YB-1 и РАВР на трансляцию мРНК YB
3. Специфическое взаимодействие YB-1 с РНК
4. Негативный эффект полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляцию как новый способ регуляции синтеза YB
ВЫВОДЫ

Мультифункдиональный ядерно-цитоплазматический Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) входит в обширную группу белков, содержащих домен холодового шока. Этот ДНКи РНК-связывающий белок участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. Нокаут гена YB-1 у мышей приводит к серьезным нарушениям эмбрионального развития и к ранней (пренатальной) гибели животных. YB-1 обладает онкогенной и антионкогенной активностью, повышает устойчивость клеток к ксенобиотикам и ионизирующей радиации и является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости.

Участие YB-1 в широком спектре внутриклеточных процессов объясняется, прежде всего, его почти уникальной способностью взаимодействовать как с ДНК, так и с РНК, а также со многими клеточными белками. В ядре он участвует в регуляции транскрипции многих генов, вовлечен в процессы репликации и репарации ДНК, а также сплайсинга пре-мРНК. В цитоплазме YB-1 упаковывает мРНК в мРНП, стабилизирует мРНК и регулирует их трансляцию.

Характер действия YB-1 на клеточные процессы зависит от его содержания в клетке и от его распределения между ядром и цитоплазмой. YB-1 может переходить в клеточное ядро под действием ксенобиотиков, повреждающих ДНК, и ультрафиолетового облучения, а также в определённый период митотического цикла или при активации некоторых сигнальных путей клетки. Содержание YB-1 в клетке зависит от скорости его синтеза и распада, а скорость синтеза определяется как эффективностью транскрипции гена YB-1, так и эффективностью трансляции его мРНК.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что регуляция синтеза YB-1 осуществляется при участии ~ 80-нуклеотидной регуляторной последовательности, находящейся в 3' нетранслируемой области (3' НТО) мРНК YB-1. С этой последовательностью специфически взаимодействуют два мажорных белка цитоплазматических мРНП — сам YB-1 и поли (А)-связывающий белок (poly (A)-binding protein, РАВР). Было выяснено, что РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 даже в отсутствие З'-концевой поли (А)-последовательности у мРНК (Skabkina et al, 2003), a YB-1 её избирательно ингибирует при относительно низких концентрациях, которые оптимальны для трансляции других клеточных мРНК (Скабкина и др., 2004).

Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению молекулярных механизмов, регулирующих трансляцию мРНК YB-1. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) определить стадию трансляции, на которой YB-1 ингибирует, а РАВР стимулирует синтез YB-1- 2) локализовать сайты специфического связывания YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности мРНК YB-1- 3) установить, конкурируют или не конкурируют белки YB-1 и РАВР за места своего специфического связывания в регуляторной последовательности мРНК YB-1 4) исследовать влияние 3'-концевого полиаденилирования мРНК YB-1 на её трансляционную активность в бесклеточной системе белкового синтеза.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Установлено, что YB-1 избирательно ингибирует, а РАВР стимулирует трансляцию мРНК YB-1 на стадии инициации, на этапе присоединения к мРНК 43 S преинициаторного комплекса или на более раннем этапе взаимодействия мРНК с факторами инициации трансляции.

2. Методом футпринтинга локализованы сайты специфического связывания белков YB-1 и РАВР в регуляторной последовательности в 3' НТО мРНК YB-1. Обнаружено, что сайты специфического связывания этих двух белков перекрываются, и что YB-1 и РАВР конкурируют между собой за связывание с регуляторной последовательностью.

3. Методами точечного и делеционного мутагенеза показано, что специфическое ингибирование трансляции мРНК YB-1 под действием YB-1 и её стимулирование под действием РАВР обусловлены присутствием специфических сайтов связывания этих двух белков в регуляторной последовательности мРНК YB-1.

4. Показано, что в бесклеточной системе белкового синтеза РАВР восстанавливает трансляцию мРНК YB-1, подавленную белком YB-1. Предложена модель координации синтеза двух мажорных белков цитоплазматических мРНП — YB-1 и РАВР.

5. Обнаружено, что полиаденилирование мРНК YB-1 оказывает ингибирующее действие на её трансляцию, в то время как трансляция большинства других мРНК, наоборот, активируется при полиаденилировании.

Показать весь текст

Список литературы

Скабкин М.А., Скабкина О. В. и Овчинников Л.П. (2004) Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов. Успехи биол. химии, 44, 3−52.
Скабкина О.В., Скабкин М. А., Лябин Д. Н., Овчинников Л. П. (2004). Мажорный белок цитоплазматических мРНП р50/УВ-1 регулирует свой синтез. Докл. АН395, 548−550.
Abaza I., Coll О., Patalano S. and Gebauer F. (2006) Drosophila UNR is required for translational repression of male-specific lethal 2 mRNA during regulation of X-chromosome dosage compensation. Genes Dev, 20, 380−389.
Ansari S.A., Safak M., Gallia G.L., Sawaya B.E., Amini S. and Khalili K. (1999) Interaction of YB-1 with human immunodeficiency virus type 1 Tat and TAR RNA modulates viral promoter activity. J Gen Virol, 80 (Pt 10), 2629−2638.
Aoki M., Blazek E. and Vogt P.K. (2001) A role of the kinase mTOR in cellular transformation induced by the oncoproteins P3k and Akt. Proc Natl Acad Sci U SA, 98, 136−141.
Bader A.G., Felts K.A., Jiang N., Chang H.W. and Vogt P.K. (2003) Y box-binding protein 1 induces resistance to oncogenic transformation by the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 100, 1 238 412 389.
Bader A.G. and Vogt P.K. (2005) Inhibition of protein synthesis by Y box-binding protein 1 blocks oncogenic cell transformation. Mol Cell Biol, 25, 20 952 106.
Baer B.W. and Kornberg R.D. (1980) Repeating structure of cytoplasmic poly (A)-ribonucleoprotein. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 1890−1892.
Bagga S., Bracht J., Hunter S., Massirer K., Holtz J., Eachus R. and Pasquinelli A.E. (2005) Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs results in target mRNA degradation. Cell, 122, 553−563.
Barends S., Bink H.H., van den Worm S.H., Pleij C.W. and Kraal B. (2003) Entrapping ribosomes for viral translation: tRNA mimicry as a molecular Trojan horse. Cell, 112, 123−129.
Barnard D.C., Cao Q. and Richter J.D. (2005) Differential phosphorylation controls Maskin association with eukaryotic translation initiation factor 4E and localization on the mitotic apparatus. Mol Cell Biol, 25, 7605−7615.
Barnard D.C., Ryan K., Manley J.L. and Richter J.D. (2004) Symplekin and xGLD-2 are required for CPEB-mediated cytoplasmic polyadenylation. Cell, 119, 641−651.
Behm-Ansmant I., Rehwinkel J., Doerks Т., Stark A., Bork P. and Izaurralde E. (2006) mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4: NOT deadenylase and DCP1-.DCP2 decapping complexes. Genes Dev, 20, 1885−1898.
Blobel G. (1972) Protein tightly bound to globin mRNA. Biochem Biophys Res Commim, 47, 88−95.
Bouvet P., Matsumoto K. and Wolffe A.P. (1995) Sequence-specific RNA recognition by the Xenopus Y-box proteins. An essential role for the cold shock domain. J Biol Chem, 270, 28 297−28 303.
Capowski E.E., Esnault S" Bhattacharya S. and Malter J.S. (2001) Y box-binding factor promotes eosinophil survival by stabilizing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor mRNA. J Immunol, 167, 5970−5976.
Castagnetti S. and Ephrussi A. (2003) Orb and a long poly (A) tail are required for efficient oskar translation at the posterior pole of the Drosophila oocyte. Development, 130, 835−843.
Chansky II.A., Ни M., Hickstein D.D. and Yang L. (2001) Oncogenic TLS/ERG and EWS/Fli-1 fusion proteins inhibit RNA splicing mediated by YB-1 protein. Cancer Res, 61, 3586−3590.
Chen C.Y., Gherzi R., Andersen J.S., Gaietta G., Jurchott K., Royer H.D., Mann M. and Karin M. (2000) Nucleolin and YB-1 are required for JNK-mediated interleukin-2 mRNA stabilization during T-cell activation. Genes Dev, 14, 12 361 248.
Colegrove-Otero L.J., Minshall N. and Standart N. (2005) RNA-binding proteins in early development. Crit Rev Biochem Mol Biol, 40, 21−73.

Заполнить форму текущей работой