Морфофункциональная характеристика этанолокисляющих ферментов головного мозга при смертельном отравлении этанолом

Актуальность исследования. Проблема алкоголизма на протяжении многих веков была, остается и еще долго будет актуальной для человечества в социальном, медицинском плане, а также в аспекте сохранения здорового генофонда людей (Cagdir et al., 2003). Смертность населения России от несчастных случаев, травм и отравлений занимает одно из ведущих мест, опережая показатели смертельных исходов от онкологических заболеваний (Кушнирева О.Н. и соавт., 2002). Из отчетов о деятельности региональных бюро судебно-медицинской экспертизы РФ за t.

2002 год известно, что смертность от отравлений составила 27,5%, причем ведущее место занимают случаи смертельных интоксикаций после приема этилового спирта — 55,2%. Алкоголь способствует скоропостижной смерти от различных заболеваний, прежде всего, сердечно-сосудистой патологии (Морозов Ю.Е., 1998; Минеева Л. Д., 1999). Несчастные случаи в быту, на производстве, транспорте нередко связаны с алкогольным опьянением или его последствиями (Авходиев Г. И., Кузьмина О. В., 2002). Основная масса преступлений совершается в состоянии опьянения (Зороастров О.М., 2003).

Длительное злоупотребление алкоголем приводит к заболеванию хроническому алкоголизму (Билибин Д.П., Дворников В. Е., 1991). Приблизительно у 14 млн американцев — около 7,4% взрослого населенияотмечены диагностические критерии алкоголизма (Dixit et al., 2000). В России число смертельных отравлений этиловым спиртом и его суррогатами остается практически одним из самых высоких в мире (Томилин В.В., Саломатин Е. М., 2001).

Немало исследований в области судебно-медицинской диагностики алкогольной интоксикации выполнено в последние годы (Красильникова Л.Н. и соавт., 1995; Наумов Э. С., Наумова Е. Ю., 1999; Пермяков А. В., I.

Витер В.И., 2000; Морозов Ю. Е., 2001). В то же время недостаточно изученными остаются многие вопросы, касающиеся особенностей танатогенеза при отравлении этиловым спиртом, состояния этанолметаболизирующих ферментных систем и возможности их использования для дифференциальной диагностики причин смерти (Пиголкин Ю.И., 2003).

Согласно современным литературным данным головной мозг является одним из главных органов-мишеней для действия этанола (Пермяков А.В., Витер В. И., 2002; Пиголкин Ю. И. и соавт., 2003). Злоупотребление алкоголем ведет к прямому повреждению нервных клеток (Riihioja et al., 1999). Отмечейо, что при алкоголизме выборочно выпадают нейроны в ядрах головного мозга (Baker et al., 1996; Harding et al., 1997). Окисление этанола с участием оксидоредуктаз — алкогольдегидрогеназы (АДГ) и ацетальдегидцегидрогеназы (АльДГ) — представляет собой основной путь метаболизма алкоголя в организме (J. Hashimoto et al., 1977; Т. Watabiki et al., 1989; P.A. Motavkin et al., 1990; S.M. Zimatkin et al., 1997). Степень их влияния также может быть определена в зависимости от медиаторной организации нервных центров (Арушанян Э.Б., 1977; Tabakoff et al., 1987). Наиболее чувствительными структурами для токсического действия экзогенного этаноЛа являются моноаминергические нейроны, в результате чего их рассматривают как критические центры (Motavkin et al., 1990; Пиголкин Ю. И. и соавт., 2003).

Изменение поведения, эмоциональные расстройства и симптомы психопатологических состояний, характерные для алкоголизма, имеют прямую связь с нарушением нейромедиаторных систем (Сытинский И.А., 1980; Tabakoff et al., 2000).

Учитывая, что нейромедиаторная система нарушается при алкоголизме (Tabakoff et al., 1980; Weiss et al., 2002), данный факт позволяет предположить актуальность de гистохимического изучения в приложении к алкогольной интоксикации.

Исходя из вышеизложенного, целью исследования явилось:

Выяснение закономерностей метаболизма этилового спирта по показателям активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных структурах головного мозга и возможности использования указанных закономерностей для судебно-медицинской диагностики смертельных отравлений этанолом.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести эпидемиологический анализ судебно-медицинских заключений (актов) экспертиз (исследований) трупов на примере одного из регионов России с целью определения распространенности и условий смертельных отравлений этанолом.

2. Установить нормальное распределение активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных отделах головного мозга.

3. Изучить активность алкогольи альдегиддегидрогеназы в моноаминергических ядрах головного мозга при смертельном отравлении этиловым спиртом, а также у лиц с хронической алкогольной интоксикацией и умерших трезвыми от осложнений алкогольной болезни.

4. Определить возможность использования результатов настоящего исследования в качестве дополнительных критериев для судебно-медицинской диагностики смерти от отравления этанолом и алкогольной болезни.

Новизна исследования. На основании данных Приморского областного бюро судебно-медицинской экспертизы впервые проведен анализ случаев смертельного отравления этанолом по г. Владивостоку за последние 5 лет (1999;2003 гг.), в котором отражена тенденция к увеличению распространения алкоголизма. Проведено определение окисляющих этанол ферментов в медиаторно-дифференцированных нервных центрах на практическом судебно-медицинском материале.

Установлены закономерности распределения и изменения гистохимической активности алкогольдегидрогеназы и ацетальдегиддегидрогеназы в структурных отделах головного мозга при смерти от различных причин. На основании полученных данных предложены дополнительные судебно-медицинские критерии диагностики острой и хронической алкогольной интоксикации с учетом индивидуальной толерантности к этиловому спирту. 1.

Практическая значимость. Использование дополнительных объективных критериев поражения головного мозга, предложенных в диссертации, позволяет повысить точность судебно-медицинской и патологоанатомической диагностики острой и хронической алкогольной интоксикации, а также провести их дифференциальную диагностику.

Структура диссертации. Работа включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, результаты собственного исследования, 'обсуждение результатов и выводы.

Список литературы

включает 246 источников, из них 143 на русском языке и 103 — на иностранных. Текст изложен на 153 страницах, содержит 16 таблиц, иллюстрирован 21 микрофотографиями и 20 диаграммами. В конце работы помещено развернутое приложение показателей активности этанолокисляющих ферментов, полученных в результате исследования (5 стр.).

выводы.

1. В последние годы в г. Владивостоке отмечается увеличение г смертности от отравлений, связанных с употреблением алкоголя. I.

Наибольшее количество смертельных исходов наблюдается среди мужчин.

5 трудоспособного возраста, не имеющих работы и определенного места.

I жительства, в весенне-летний период года, вечернее и ночное время суток, ¦ праздничные и выходные дни, ранний период фазы элиминации экзогенного этилового спирта. Указанные данные, по-видимому, отражают 1 з общую тенденцию к росту смертности от острого отравления этанолом у тех же лиц и при тех же обстоятельствах, свойственных для России в целом.

• 2. При отсутствии признаков интоксикации этанолом установлены существенные различия активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных отделах головного мозга: в нейронах.

I бледного ядра шва гистохимически определяется средняя величина г активности АДГ и АльДГв клетках Пуркинье мозжечка имеется высокая.

I активность АДГ и средняя — АльДГв компактном ядре черной субстанции ' ¦ и нейронах голубого пятна определяется высокая активность АДГ и низкая.

— АльДГ.

3. Смертельное отравление этиловым спиртом характеризуется — комплексом дисциркуляторных расстройств. В ткани головного мозга наблюдается поражение сосудов микроциркуляторного русла (дистония, парез капилляров, стазы, сладжи, повышение проницаемости сосудов, плазматическое пропитывание их стенок и набухание базальных мембран, отек и деструкция эндотелия, периваскулярные кровоизлияния), | периваскулярный и перицеллюлярный отек, набухшие и нередко ишемические нейроны, лизис их ядер, нейронофагия.

4. Для смертельного отравления этанолом в стадии его резорбции характерно статистически достоверное увеличение активности АДГ.

4,7+0,04 балла) в нейронах бледного ядра срединного шва и снижение активности АльДГ в компактном ядре черной субстанции (1,2±0,02 балла), нейронах голубого пятна (1,1±0,02 балла) и клетках Пуркинье мозжечка (1,4±0,02 балла).

5. В случаях смертельного отравления алкоголем в стадии его элиминации наблюдается одновременное увеличение активности АДГ и снижение величины активности АльДГ во всех изученных структурах головного мозга, отсутствие статистически достоверных различий энзиматической активности между нейронами.

6. Критериями хронической алкогольной интоксикации при смерти от осложнений алкогольной болезни являются ингибирование активности обоих ферментов в ткани головного мозга.

7. Морфологическая характеристика этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных структурах головного мозга может служить дополнительным критерием судебно-медицинской диагностики смертельного отравления этиловым спиртом, однако, лишь в сочетании с катамнестическими, секционными, гистологическими и судебно-химическими данными.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Для объективизации данных, полученных в результате судебно-медицинского исследования трупа при острой алкогольной интоксикации, необходимо использовать унифицированные подходы к исследованию головного мозга с соблюдением правил изъятия, фиксации, проводки и окраски секционного материала. В настоящих рекомендациях приведены основные условия проведения гистохимической реакции для одновременного определения активности АДГ и АльДГ в одном гистопрепарате и признаки судебно-медицинской диагностики алкогольной интоксикации по изменениям активности этанолокисляющих ферментов головного мозга.

После изъятия фрагментов головного мозга их помещают на полоску фильтровальной бумаги и в биксе с сухим льдом доставляют в лабораторию и переносят в предварительно охлажденную до -18° С камеру криостата. Образцы монтируют на столике микротома МК-25 так, чтобы срезы соответствовали фронтальному сечению мозга, при наклоне ножа микротома 7,5° готовят срезы головного мозга толщиной 25 мкм. Полученные срезы размещают на предметных стеклах, расправляют кисточкой, размораживают пальцем и подсушивают на воздухе. Ферментативная активность АДГ и АльДГ в ткани мозга определяется по методу yatabiki Т. (1989). Предметные стекла со срезами размещают в инкубационных контейнерах, где проводят фиксацию 2 минуты в 2% глутаральдегиде (ОЬА) в 0,1% фосфатном буфере, РН 7,4 при 4° С, а затем промывка в том же буфере 1 час при 4° С. Инкубация срезов выполняется в два этапа:

1. Определение активности АДГ по интенсивности выпавшего осадка формазана синего цвета.

Фиксированные срезы инкубируют в течение 30 минут при 37° С в растворе следующего состава: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4 — 10 мл- 45% этанол — 3 млнитротетразолиевый синий 16,4 mg/6 ml — 6 млдистиллированная вода — 1,0 млNAD — 60 мгPMS — 3 мг.

После инкубации срезы промывают в дистиллированной воде 10 минут при 4° С. Для образования металл-формазанового комплекса контейнеры со срезами помещают в 40 мМ сульфат меди в дистиллированной воде на 30 минут при 4° С, а затем промывают в дистиллированной воде 10 минут при той же температуре.

2. Определение активности АльДГ по интенсивности выпавшего осадка ферроцианида меди коричневого цвета.

Те же срезы инкубируют 60 минут при 37° С в растворе следующего состава: 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,4 — 10 мл- 0,1 М sodium citrate — 0,8 мл — 30 мМ сульфат меди — 2 млдистиллированная вода — 2,2 мл- 5 мМ potassium ferricyanide — 2 мл- 900 мМ ацетальдегид — 3 млNAD — 60 мг.

После инкубации срезы промывают в дистиллированной воде, фиксируют, обезвоживают, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Препараты изучают на оптическом микроскопе. Гистотопографию нейронов уточняют с помощью контрольных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и по Нисслю.

Величину активности ферментов оценивают в баллах от 0 до 5-ти: 0 баллов — отсутствие активности- 1 балл — очень низкая активность- 2 балла — низкая активность- 3 балла — средняя активность- 4 балла — сильная активность- 5 баллов — очень сильная активность. Рассчитывают средний показатель значения активности ферментов на основании ее определения не менее, чем в 20 участках исследуемого объекта.

Ниже приводятся доверительные интервалы величины активности ферментов метаболизма экзогенного этанола в головном мозге при различных причинах смерти.

Для случаев смерти от острой кровопотери в результате механической травмы (контрольная группа наблюдений) характерен следующий комплекс показателей:

— нейроны голубого пятна: АДГ — 3,6−4,0 балла, АльДГ — 1,8−2,0 балла;

— бледное ядро срединного шва: АДГ — 3,1−3,4 балла, АльДГ — 2,7−3,0 балла;

— компактное ядро черной субстанции: АДГ — 3,8−4,2 балла, АльДГ -1,9−2,1 балла;

— клетки Пуркинье мозжечка: АДГ — 4,1−4,5 балла, АльДГ — 2,9−3,2 балла.

При смертельном отравлении этанолом выявлены следующие показатели:

1) в фазе резорбции этилового спирта:

— нейроны голубого пятна: АДГ — 4,5−5,0 балла, АльДГ — 1,0−1,2 балла;

— бледное ядро срединного шва: АДГ — 4,5−4,9 балла, АльДГ — 2,1−2,5 балла;

— компактное ядро черной субстанции: АДГ — 4,7−5,0 балла, АльДГ.

1.0−1,2 балла;

— клетки Пуркинье мозжечка: АДГ — 4,5−4,9 балла, АльДГ — 1,3−1,5 балла.

2) в фазе элиминации этилового спирта:

— нейроны голубого пятна: АДГ — 4,4−4,8 балла, АльДГ — 1,1−1,3 балла;

— бледное ядро срединного шва: АДГ — 4,1−4,6 балла, АльДГ — 2,0−2,2 балла;

— компактное ядро черной субстанции: АДГ — 4,6−4,9 балла, АльДГ.

1.1−1,3 балла;

— клетки Пуркинье мозжечка: АДГ — 4,3−4,7 балла, АльДГ — 1,2−1,4 балла.

Для случаев смерти от хронической алкогольной интоксикации характерна следующая совокупность показателей:

— нейроны голубого пятна: АДГ — 2,0−2,4 балла, АльДГ — 0,9−1,1 балла;

— бледное ядро срединного шва: АДГ — 2,7−3,1 балла, АльДГ — 2,6−2,9 балла;

— компактное ядро черной субстанции: АДГ — 2,3−2,7 балла, АльДГ -1,2−1,4 балла;

— клетки Пуркинье мозжечка: АДГ — 2,6−3,0 балла, АльДГ — 2,8−3,2 балла.