Морфологические варианты комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов человека и критерии прогноза успешности экстракорпорального оплодотворения

В последнее время в России сложилась крайне неблагоприятная демографическая ситуация. На 1 января 2001 г. население России насчитывало 145 185 тыс. человек. За столетие, прошедшее после первой всеобщей переписи населения, его численность более чем удвоилась. Но по сравнению с данными последней переписи — 1989 г., — оно сократилось на 2216 тыс. человек, или на 1,5%. В последние 2 года темпы убыли населения возросли. Только за 1999 г. число россиян уменьшилось на 768 тыс. человек, за 2000 г. — еще на 740 тыс. человек, или на 0,5% в год. Население начало убывать в 1992 г. К началу 2001 г. его численность уменьшилась на 3,5 млн. человек, или на 2,4%. В 1999 г. рождаемость в России продолжала снижаться. Общее число родившихся было на 68,6 тысяч меньше, чем в предыдущем году, а показатель итоговой рождаемости достиг небывало низкого значения — 1,17 рождений на одну женщину. Едва заметное повышение показателя в 1998 г. не оправдало надежд на перелом тенденции. В 2000 г. вновь был отмечен некоторый рост рождаемости, и сегодняшнюю ситуацию можно охарактеризовать как стагнацию с сохранением возможности дальнейшего снижения. (А.Г. Вишневский, 2001). Снижение численности населения происходит в основном из-за естественной убыли, которая за период с 1989 по 2002 год составила в сумме 7,4 млн. человек. Компенсация естественных потерь населения за счет миграционных потоков не должна внушать оптимизма, поскольку остается постоянное превышение числа умерших над числом родившихся в 1,7 — 1,8 раза. Перепись населения зафиксировала уменьшение численности населения в Сибирском федеральном округе на 4,8%, в Северо-Западном на 8,2%, в Дальневосточном на 15,9%! Суммарный коэффициент рождаемости не превышает 131 родившихся на 100 женщин репродуктивного возраста (15−49лет). Это значительно ниже уровня, необходимого для воспроизводства населения (215 родившихся на 100 женщин). Что же касается Алтайского края, то на первое января 2002 года численность населения составила 2621 тыс. человек. За последние пять лет численность населения уменьшилась более чем на 50 тыс. человек. Рождаемость в Алтайском крае не обеспечивает простого воспроизводства населения. Существующее поколение воспроизводит себя менее чем на 60%, семьи характеризуются малодетностыо, что ведет к старению общества.

На фоне сохраняющейся тенденции к сокращению народонаселения особенно острой является проблема бесплодия. В мире, по данным Всемирной организации здравоохранения, бесплодием страдают около 15% супружеских парв России этот показатель составляет 12−15% (В.И. Кулаков, 1999), а при показателе бесплодия свыше 15% проблема уже приобретает государственное значение.

Методы вспомогательной репродукции, в частности экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и перенос эмбриона в полость матки, введение единичного сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ICSI) делают возможным прижизненное изучение человеческих гамет, зигот и эмбрионов на ранних стадиях развития. Это позволяет совершенствовать лабораторные технологии при ЭКО: оптимизировать процесс культивирования и селекции гамет, зигот и эмбрионов в программах вспомогательной репродукции.

Важную роль в достижении беременности в процессе оплодотворения in vitro и переноса эмбрионов играет выбор наиболее перспективного клеточного материала (ооцитов, зигот, эмбрионов). Однако в настоящее время в практической эмбриологии существуют лишь качественные, субъективные критерии его оценки.

Цель исследования Исследование вариантной анатомии ооцитов, зигот, эмбрионов и разработка информативных критериев для повышения надежности прогнозирования успешности ЭКО.

Задачи исследования.

1. Выявить вариабельность и информативность морфологических параметров комплекса ооцит-кумулус, зигот и эмбрионов.

2. Изучить, степень надежности качественных морфологических параметров ооцитов и эмбриональных клеток для прогноза успешности ЭКО.

3. Разработать методику морфометрического" исследования строения ооцитов и: эмбриональных клеток.

4. Осуществить отбор информативных количественных морфологических параметровэмбрионального клеточного материалаисследовать степень их надежности для прогноза исходов ЭКО.

5. Предложить морфометрические критерии оценки функционального состояния клеточного материала и проанализировать их эффективность для обеспечения результативности ЭКО.

Научная новизна Изучена вариантность строения комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов. Предложены информативные качественные и количественные параметры оценки морфофункционального состояния системыооцит-кумулус, зигот, эмбрионов. Получено подтверждение возможности прогноза успешности ЭКО по результатам оценки состояния эмбриональных структур, г Впервые на человеческом материале морфометрическими методами подтверждена оправданность использования наиболее информативных i морфологических характеристик для использования их в роли критериев, обеспечивающих повышение результативности, ЭКО и ICSI.

Практическая значимость Предложенные критерии качественной и количественной оценки морфофункционального состояния системы ооцит-кумулус-. ооцитов, зигот, эмбрионов при использовании их: для отбора наиболее перспективного) гi' клеточного материала в повседневной работе врача-эмбриолога повышают успешность ЭКО и ICSI.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. По данным морфометрического исследования выявлена высока морфологическая вариабельность системы ооцит-кумулус, зигот и эмбрионов по таким элементам, как: лучистый венец, прозрачная оболочка, перивителлиновое пространство, цитоплазма, бластомеры.

2. Информативно значимые качественные морфологические признаки системы ооцит-кумулус, зигот и эмбрионов могут быть использованы в качестве критериев отбора наиболее перспективного клеточного материала в программе ЭКО.

3. По данным морфометрического исследования наиболее информативными критериями для прогноза эффективности ЭКО являются: умеренная интенсивность окраски и компактность клеток кумулуса, отчетливая выраженность границы лучистого венца и лучей в нем, однородность структуры лучистого венца, умеренная толщина прозрачной оболочки зиготы, равномерность перивителлинового пространства, симметричность пронуклеусов, одинаковые размеры бластомеров в эмбрионе при наибольшем их количестве.

Обзор литературы Как справедливо указывал еще И. Ранке (1902), не было такого времени, когда мысль человеческая не занималась бы вопросами репродукции человека. Однако только в 1827 году Baer С.Е. описал «Ovulum», человеческое яйцо — материнское зародышевое начало. И. Ранке подчеркивал, что в зрелом состоянии его можно видеть невооруженным глазом, поскольку его размеры в поперечнике составляют 0,08 — 0.2 мм. Автор детально описал структуру яйцеклетки, выделив стекловидно-прозрачную оболочку (zona pellucida), пронизанную многочисленными тончайшими канальцами, главную массу материнского зародышевого начала — протоплазму и зародышевый пузырек в ней. Структура зародышевого пузырька определялась автором как «ядерная плазма» и характеризовалась содержанием особого вещества — нуклеина. Несмотря на спорность и ошибочность определений в отношении состава протоплазмы и нуклеина, И. Ранке принципиально правильно определил понятие яйцеклетки «как самостоятельно живущего организма, обладающего в высочайшей степени способностью к размножению, к воспроизведению». A.B. Немилов (1925), описывая яйцеклетку в яичниковых пузырьках (Граафовы пузырьки), указывал на наличие вокруг нее фолликулярного эпителия, расположенного в несколько слоев. Ближайший к яйцеклетке ряд фолликулярных клеток образует лучистый венец. Автор считал, что клетки лучистого венца принимают участие в образовании наружного слоя оболочки яйцеклетки — оолеммы, или блестящей оболочки и выделял в ней три слоя: наружный — губчатый, среднии — мелкозернистый и внутренний, прилежащии к самой протоплазме. Последний он предлагал считать «настоящей оболочкой» яйцеклетки, подчеркивая, что в ней нет никакого «предобразованного отверстия для вхождения спермия». В яйцеклетке автор описывал ядро, занимающее центр протоплазмы и представленное в виде «объемистого пузырька с ядрышком и отчетливым ядерным остовом». Он выделял первое «эквационное» и второе «редукционное» деление яйцеклетки с образованием полярных или направительных редукционных телец. Эти исследования были дополнены, уточнены и обобщены в более поздних работах (Рябов К.П., 1990; Афанасьев Ю. И., Юрина H.A., 2001). В терминологическом аспекте. сведения различных авторов о структурах яйцеклетки противоречивы. Одни исследователи (В .Г. Елисеев, Ю. И. Афанасьев, H.A. Юрина, 1983) указывают, что яйцеклетка содержит ядро, цитоплазму (ооплазму) и цитолемму (первичную и вторичную). Периферический слой яйцеклетки имеет микроворсинки, цитоплазма заполнена рибосомами. Митохондрии развиты умеренно, пластинчатый комплекс на ранних стадиях развития яйцеклетки располагается около ядра, окружая центросому. Указанные авторы подчеркивали, что в цитоплазме яйцеклетки всегда выявляются мультивезикулярные тельца, а снаружи она окружена слоем плоских и кубических клеток, называемых фолликулярными. Функционирование ооцита и фолликулярных клеток приводит к образованию зоны, богатой гликозаминогликанами, которая называется прозрачной зоной. Авторы указывают на существенную роль фолликулярных клеток, выполняющих защитную, барьерную и регуляторную функции.

Исследования яйцеклетки человека, в основном, проводились гистологичски. Запросы репродуктивных технологий побудили исследователей к изучению яйцеклеток, выделенных из Граафова пузырька путем аспирации фолликулярной жидкости. Безусловно, сведения о структурах яйцеклетки, полученные с помощью фазово-контрастной и электронной микроскопии весьма ценны, однако эти методы лишь способствовали накоплению важных данных об ооцитах, но были мало пригодны для выполнения процедуры экстракорпорального оплодотворения. Это же касается и исследований, направленных на изучение функционально значимых деталей яйцеклетки: выявление эластичности zona pellucida, отростков клеток corona radiata, связывающих ее с прозрачной оболочкой, ряда органелл в виде кругло-овальных телец и мультивезикул.

Следует положительно оценить попытку авторов дать сводную классификацию типов: яйцеклеток, дробления, бластул и гаструляции. Классификация предусматривала: типы яйцеклеток (первично олиголецитальные, полилецитальные и вторично олиголецитальные), типы дробления (полное и равномерное, полное и неравномерное, частичное меробластическое и полное асинхронное неравномерное), типы бластулы (целобластула, амфибластула, дискобластула и перибластула) и типы гаструляции (инвагинация, инвагинация и эпиболия, деламинация и иммиграция).

Характеристика типов, представленная выше, при всей ее оправданности, мало что дает репродуктологу, скорее это терминологический изыск, а не детализация структурных особенностей, так необходимых для, дифференцировки и подбора клеточного материала, наиболее пригодного для репродуктивных целей. Э. Г. Улумбекова, Ю. А. Челышев, 1997 достаточно подробно описывают структуры яйцеклетки, химический их состав, процессы, происходящие при оплодотворении и развитии эмбриона, однако не выделяют типов клеточных структур, не дают характеристик эмбрионального материала, представляющих интерес для репродуктологии своей конкретикой.

Важно отметить, что вышеназванные авторы усматривали существенную роль структур оболочек яйцеклетки для сохранения ее активного функционального состояния.

Изучению гаметогенеза и эмбриогенеза были посвящены фундаментальные работы Б. П. Хватова (1960), Е. А. Пожидаева (1967), Б. П. Токина (1987), А. П. Дыбана (1988), создавшие базу для прижизненной оценки качества эмбрионов человека in vitro.

Идее преодоления бесплодия с помощью оплодотворения яйцеклетки in vitro предшествовали многолетние исследования, проводимые учеными самых различных специальностей, в первую очередь биологами и эмбриологами, в основном на экспериментальных животных.

В ранее проведенных экспериментах на животных (1890) был впервые проведен удачный перенос эмбрионов самки одной породы кроликов в полость матки самке другой породы (Неаре W., 1890). Груздевым B.C. проводились опыты по извлечению яйцеклеток из яичников самки кролика, их смешиванию со сперматозоидами in vitro и введению в яйцеводы самки. При этом исследователем было подчеркнуто первостепенное значение степени зрелости ооцита для успешного оплодотворения (Груздев B.C., 1897).

Оплодотворение яйцеклетки кролика in vitro было осуществлено в 1934 году О. В. Красовской, которая впоследствии, в 1936 году, провела успешный перенос эмбрионов одной самки кролика в полость матки другой (Красовская О.В., 1934, 1936). Подобные опыты с оплодотворением яйцеклеток млекопитающих in vitro проводились Chang М.С., 1955; Briggers J.D., Moore B.D., Whittingham D.G., 1965. В 1944 году Rock J. и Menkin M., 1944 впервые получили оплодотворение человеческих яйцеклеток in vitro и дробление зигот до стадии двухклеточного эмбриона. Работы по оплодотворению и культивированию эмбрионов человека in vitro активно велись и в нашей стране (Квасницкий A.B., 1950; Петров Т. Н., 1955, 1958, 1959; Хватов Б. П., 1960). Однако полученные результаты не были внедрены в клиническую практику. Как указывают Леонов Б. В. и Гусарева A.A. (2005) это было связано с необходимостью совершенствования подготовительного этапа, включающего в себя разработку методов гормональной стимуляции суперовуляции. Кроме того, совершенно необходимой была разработка методов ультразвукового мониторинга роста фолликулов. Очень важным моментом было совершенствование способов пункции преовуляторных фолликулов и переноса эмбрионов.

Накопленные сведения по морфологии яйцеклетки и сперматозоидов в наибольшей степени нашли свое применение при лечении бесплодия с 1978 года, когда был разработан и применен в клинике метод экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона в полость матки (Steptoe P.C., Edwards.

R.G., 1978; Edwards R.G. et al. 1980). В нашей стране первые дети после экстракорпорального оплодотворения родились в 1986 году благодаря работе коллективов под руководством Б. В. Леонова и А. И. Никитина (Никитин А.И., Китаев Э. М., Савицкий Г. А. и соавт., 1987; Лукин В. А., Леонов Б. В., Калинина Е. А. и соавт., 1988; Леонов Б. В., 1994). Это событие положило начало новой эпохе в лечении бесплодия, которая требовала нового подхода к оценке гамет и эмбрионов, в том числе морфологической. Главным требованием этого подхода было минимальное воздействие на клеточный материал, поэтому методы, ранее служившие для изучения строения яйцеклеток и эмбрионов, в том числе с окрашиванием препаратов (Хватов Б.П., Шаповалов Ю. Н., 1969), в этом случае оказались неприменимы.

Существенная роль степени зрелости ооцита была подтверждена после введения в клиническую практику микроманипуляционных методов оплодотворения, одним из этапов которых является выделение ооцита из окружающих его клеток, что позволило определять зрелость его ядра и цитоплазмы (Леонов Б.В. и соавт., 2005; Rattanachaiyanont М., Leader А., Leveille М.-С., 1999). Авторы пришли к выводу, что оценка степени зрелости яйцеклетки по комплексу «ооцит-корона-кумулус» не имеет практического значения. Подобное заключение страдает некоторым субъективизмом, поскольку авторы оценивали указанный комплекс весьма поверхностно, не проводя морфометрических исследований и не сопоставляя качественные признаки отдельных структур комплекса с результатами ЭКО. Безусловно, объективная оценка состояния ооцита имеет прогностическую значимость, поскольку оплодотворение не достаточно созревшего ооцита может привести к задержке деконденсации спермального хроматина и появления второго полярного тела и полиспермии (Van Blerkom J., 1989), а преждевременное созревание ооцита сопряжено со снижением вероятности оплодотворения или, даже если последнее происходит — зачастую может закончиться абортом (Regan L., Owen Е.J., Jacobs Н., 1990). Известные варианты определения степени зрелости ооцита по качеству его цитоплазмы (Barnes F.L., Sirard М.А., 2000) с учетом интенсивности накопления белков, РНК и органелл, необходимых в течение первых двух дней эмбрионального развития, когда эмбриональный геном еще не активирован (Braude P., Bolton V., Moore S., 1988; Белоусов JI.B., 1993; Zenzes M., Belkien L., Bordt J., et al., 1985), при абсолютной непогрешимости самой идеи, мало приемлемы в клинике, поскольку существенно изменят процедуру ЭКО и удлинят время ее проведения с непредсказуемыми последствиями. Целый ряд исследователей указывает на зависимость успешности ЭКО не только от степени зрелости ооцита, но и от его других характеристик (Xia Р., 1997, Serai P.F., Ranieri D.M., Kinis А., Marchant S., Davies M., Khadun I.M., 1997, Loutradis D., Drakakis P., Kallianidis K., Milingos S., Dendrinos S., Michalas S., 1999, Ebner T., Yaman C., Moser M., Sommergruber M., Feichtinger O., Tews G., 2000). Многие авторы, уделяя основное внимание аномалиям формы ооцитов, дефектам строения прозрачной оболочки, наличию в цитоплазме ооцитов гранул и вакуолей, агрегации гладкого эндоплазматического ретикулума, пришли к достаточно парадоксальному заключению, что ни одна из аномалий не влияет на частоту оплодотворения при помощи ICSI, однако, их же данные подчеркивают, что полученные из аномальных ооцитов эмбрионы имеют сниженную жизнеспособность и малую частоту имплантации с частым прерыванием беременности (Alikani M., Palermo G., Bertoli M., Blake M., Cohen J., 1995). Сведения о том, что ICSI позволяет повысить частоту оплодотворения аномальных ооцитов по сравнению • с ЭКО подтверждены и другими репродуктологами (Serai H.F., Ranieri D.M., Kinis A., Marchant S., Davies M., Khadum I.M., 1997, Kahraman S., Yakin K., Donmez E., Samli H., Bahce M., Cengiz G., Sertyel S., Samli M., Imirzalioglu N., 2000). Отдельные разрозненные исследования указывают, что частота оплодотворения зависит от морфологических характеристик первого полярного тельца, размеров перивителлинового пространства и наличия в нем цитоплазматических включений (Xia P., 1997, Ebner Т., Moser М., Sommergruber М., Yaman С., Pfleger U., Tews G., 2002). Следует отметить, что есть и прямо противоположные мнения, и таких работ достаточно много, где не обнаружено никакой связи особенностей морфологии ооцитов с результатами ICSI (Balaban В., Urman В., Sertas A., Alatas С., Aksoy S., Mercan R., 1998). B.M. Здановский, (2001) подчеркивает необходимость подбора метода вспомогательных технологий каждой пациентке и предлагает считать более рациональным перенос в матку эмбриона на стадии бластоцисты. Особенно ценным в его работах является изучение перспектив ВРТ. Автор отмечает, что в связи с грядущей обязательной предимплантационной диагностикой генетических заболеваний возникнет возможность, еще до переноса зародыша в полость матки, отбора полноценного эмбриона и дальнейшая детализация сведений по ВРТ — существеннейшая задача современности. Многие авторы (Menezo Y., Testart J., et al., 1984; Schillaci R., Ciriminna R., et al., 1994; Menezo Y J., Sakkas D., et al., 1995; Карачун E.E., 2001; Roberts R., Franks S., et al., 2002; Emiliani S., Delbaere A., et al., 2003) отмечают влияние условий культивирования гамет и эмбрионов на качество эмбрионального клеточного материала, частоту оплодотворения, частоту наступления беременности. Авторы, однако, не приводит сведения о качественных признаках клеточного материала, зависящих от этих условий.

В исследованиях Коренева В. И., Калининой Е. А., Лукина В. А., Широковой Д. В., Попова Г. Д. (2001), выгодно отличающихся от многих других работ, приводятся критерии выбора наиболее пригодных эмбрионов, однако эти критерии в различных группах эмбрионов мало отличаются и сами признаки не достаточно убедительны, поскольку не имеют морфометрического подтверждения, а возможная прогностическая ценность качественных признаков комплекса ооцит-кумулус и зигот авторами не учитывалась. Очень ценным является указание Б. В Леонова, В. И Кулакова, А. А Беляевой, Л. Н Кузьмичева, (2001) на необходимость, при выборе наиболее пригодного для ЭКО или ICSI клеточного материала или его анализе, строгого соблюдения условий культивирования для снижения риска нежелательных исходов. Авторы не обращали внимания на качественные характеристики отдельных структур клеточного материала, усматривая лишь существенную роль условий культивирования и отстаивая преимущества его пролонгирования. Однако их данные, несмотря на логическую обоснованность, вызывают определенные сомнения, поскольку возникающую иногда остановку развития бластоцисты можно связать именно с пролонгированным культивированием. Л. Левков, Б. Розенлунд, П. Себлом, О. Ховатта, (2001), выясняя на какой день лучше переносить эмбрион в полость матки — на 2−3 или на 5−6 — для снижения частоты многоплодной беременности, обнаружили, что при втором сроке переноса нередко не удается получить ни одной бластоцисты. Решение о культивировании эмбрионов до стадии бластоцисты часто принимается на основании морфологической оценки ооцитов, зигот и эмбрионов, но четких критериев для такого выбора пока нет (Боярский К.Ю., Василевская С. Е., Иванов A.B., 2005). В ряде работ предпринимались попытки определения факторов, влияющих на качество ооцитов (Diamond М.Р., DeCherney А.Н., Hill G.A., Nero F., Wentz A.C., 1987, Homburg R., Armar N., F., Eshei A., Adams J., Jacobs H.S., 1988, Navot D., Bergh P.A., Williams M.A., Garrissi G.J., Guzman I., Sandier В., 1991, Munne S., Alikani M., Tomkin G., Grifo J., Cohen J., 1995, Dailey T., Dale В., Cohen J., Munne S., 1996, Lim A.S., Tsakok M.F., 1997, Ludwig M., Finas D.F., ai-Hasani S., Diedrich К., Ortmann О., 1999, Norenstedt S., N., Linderoth-Nagy C., Bergendal A., Sjoblom P., Bergqvist A., 2001). В качестве таковых авторами назывались: возраст пациентки, метод стимуляции суперовуляции, изначальная причина бесплодия, а также хромосомные аномалии и эндокринный статус (Балахонов A.B., 2000; Imthurn В., Macas Е., Rosselli M., Keller P.J., 1996, Aboulghar М.А., Mansour R.T., Ramzy A.M., Amin Y.M., 1997, Mercan R., Mayer J.F., Walker D" Jones S., Oehninger S., Toner J.P., 1997, Verpoest W.M.J., Cahill D.J., Harlow C.R., Hull M.G.R., 2000; Balaban В,.

Ercelen N., et al. 2002). Что же касается самих качественных признаков ооцитов, то названные авторы их не приводят.

С момента начала применения данных теоретической и экспериментальной биологии и эмбриологии для преодоления бесплодия в рамках программы ЭКО возникла необходимость объективной оценки качества получаемого клеточного материала. Эмбриональная культура может быть мощным диагностическим инструментом для получения информации об имплантационном потенциале человеческих эмбрионов и свидетельствует о качестве работы лаборатории (Balaban В, Urman В., 2003). Авторы подчеркивают, что, несмотря на двадцатишестилетний период, прошедший с момента рождения первого ребенка, главной нерешенной остается проблема: как выбрать наилучшие ооцит, зиготу, эмбрион? И это стало тем более важным, так как ныне применяемая в клинической практике медикаментозная стимуляция суперовуляции приводит к появлению большего количества яйцеклеток, чем это необходимо для одного цикла. С одной стороны это расширяет возможности выбора, с другой требует разработки критериев последнего. Указанные авторы, обращая внимание на морфологию пронуклеусов, наличие раннего начала дробления, количество бластомеров через 48 — 72 часа после инсеминации, морфологию эмбриона до стадии бластоцисты, отмечают достоверную корреляцию характеристик клеточного материала с имплантацией. Однако, подразделяя пронуклеусы на «идеальные», «с одной аномалией», «с двумя аномалиями» они не приводят признаков, по которым такое деление производилось. На клиническую значимость морфологических параметров гамет, зигот и эмбрионов указывали P.C. Steptoe, R.G. Edwards и D.E. Walters, (1986). Этими авторами, хотя и не было приведено конкретных морфометрических критериев, оценки указанных структур, но отмечено, что у 90% пациенток, у которых попытка ЭКО привела к беременности, хотя бы один из полученных эмбрионов был «наилучшего» качества (эмбрион класса А). При этом не было обнаружено корреляции между качеством эмбрионов и частотой невынашивания беременности.

Описанные в литературе варианты подхода к морфологической оценке клеточного материала для прогнозирования результатов ЭКО разноречивы и, следовательно, трудно сопоставимы. Ряд авторов придавал особое значение оценке гамет, а именно морфологической характеристике комплекса oocyte-cumulus и сперматозоидов (Воробьева O.A., Корсак B.C., Леонтьева O.A., 1986; M. Rattanachaiyanont, A. Leader, М.-С. Leveille, 1999, A. Salumets, А.-М. Suikkari, T. Mois, V. Soderstrom-Anttila and T. Tuuri, 2002), ооцитов (P.F.Serhall, D.M.Ranieri, A. Kinis, S. Marchant, M. Davies and I.M.Khadum, 1997, P. Xia, 1997,.

B. Balaban, В. Urman, A. Sertac, C. Alatas, S. Aksoy, R. Mercan, 1998, S. Kahraman, К. Yakin,. E. Donmez, H. Samli, M. Bahce, G. Cengiz, S. Sertyel, M. Samli,. N. Imirzalioglu, 2000; Otsuki J., Okada A., et al., 2004), первого полярного тельца (Т. Ebner, M. Moser, С. Yaman, О. Feichtinger, J. Hartl, G. Tews, 1999, T. Ebner,.

C.Yaman, M. Moser, M. Sommergruber, O. Feichtinger and G. Tews, 2000; T. Ebner, M. Moser, M. Sommergruber, C. Yaman, U. Pfleger and G. Tews, 2002), цитоплазмы ооцита (Никитин А.И., 2005; T. Ebner, M. Moser, M. Sommergruber, U. Gaiswinkler, R. Wiesinger, M. Puchner, G.Tews., 2003), перивителлинового пространства (Hassan-Ali H., Hisham-Saleh A., El-Gezeiry D., 1998). Некоторые исследователи проводили оценку зависимости частоты наступления беременности, качества зигот, частоты имплантации от деталей строения прозрачной оболочки (Gabrielsen A., Lindenberg S., Petersen К., 2001; Garside W.T., Loret de Mola J.R., 1997; Shen Y., Stalf T., et al., 2005) Авторы производили первую морфологическую оценку яйцеклетки в момент ее обнаружения в фолликулярной жидкости. Однако, это было лишь приблизительное определение зрелости ооцита, исходя из объема, плотности окружающих ооцит клеток лучистого венца (corona radiata) и яйценосного бугорка (cumulus oophorus). Согласно рекомендациям клиники Bourn Hall (1999), разным стадиям зрелости соответствуют морфологические характеристики ооцита. В связи с ,.

19 разными фазами созревания автор (Elder К.Т., 1999) приводит мало отличающие их признаки, что, естественно затрудняет использование их в' клинической практике врача-репродуктолога. Субъективная оценка зрелости весьма неточна (Veeck L.L., 1988; Khan I., Staessen С., Van den Abeel E., et al., 1989, Plachot M., Mandelbaum J., 1990). Качество мужских гамет имеет меньшее значение для нормального развития эмбриона в первые 2−3 дня после оплодотворения, чем качество яйцеклеток, что было продемонстрировано в работе Saluments et al., где клетки, полученные от одного донора ооцитов, оплодотворяли спермой разных мужчин (Salumets A, Suikkari А-М, Mois Т, Soderstrom-Anttila V, Tuuri T., 2002).

Многие авторы обращали внимание на строение первого полярного тельца (Ciotti P.M., Notarangelo L., 2004). T. Ebner et al. (2002) проводили отбор эмбрионов для переноса в полость матки на основании морфологических особенностей первого полярного тельца. Ооциты, полученные в программе ICSI, подразделяли на пять групп, в зависимости от морфологии первого полярного тельца: первая группа — круглые или овальные полярные тельца без фрагментации, имеющие гладкую поверхностьвторая группа — полярные тельца имеют округлую форму, незначительные дефекты поверхноститретья группа — фрагментированные полярные тельца (более двух фрагментов) — четвертая — разделенное на две части полярное тельцепятая — «огромные» полярные тельца, значительно увеличенное перивителлиновое пространство. Обращает на себя внимание слабое различие первой и второй групп, некоторая неопределенность понятия «огромные» полярные тельца. В качестве контроля авторы использовали группу пациенток, у которых селекцию материала для переноса проводили на основании морфологической оценки эмбрионов. Было отмечено, что частота наступления беременности в этой группе пациенток ниже (35,7% и 23,3% соответственно).

В более позднем исследовании,' проведенном этими же авторами, оценивалось оплодотворение и дальнейшее развитие двух групп ооцитов: с фрагментированным и не фрагментированным первым полярным тельцем. Авторами была обнаружена статистически значимая связь между морфологическими параметрами первого полярного тельца и качеством полученных эмбрионов, при этом частота наступления беременности при переносе эмбрионов, развившихся из ооцитов первой группы была значительно выше, чем при переносе эмбрионов, полученных из ооцитов второй группы (68,4 и 34,8%, соответственно). В исследованиях Т. Ebner et al. (1999) корреляционной связи между особенностями полярного тельца и частотой оплодотворения ооцитов выявлено не было, равно как и в работах Т. Ebner, M. Moser, et al., (2002). Таким образом, было показано, что морфологические параметры первого полярного тельца могут служить критерием для отбора наиболее качественного материала в программах вспомогательных репродуктивных технологий, однако визуализация и оценка первого полярного тельца в день забора ооцитов затруднена из-за плотного слоя клеток cumulus и corona radiata и возможна лишь при проведении процедуры ICSI, требующей обязательной ферментативной очистки яйцеклеток в день их получения.

Многие исследователи обращали особое внимание на возможность прогнозирования результативности ЭКО с помощью оценки морфологических параметров зиготы, особенно пронуклеусов (Scott L.A., Smith S., 1998; Kahraman S., Kumtepe Y., Sertyel S., et al., 2002; Garello G., Baker H., 1999; Tesarik J., Junca A.M., et al., 2000; Yoon S. J., Paik H. R., et al., 2000; Montag M., Van der Ven H., 2001; Salumets A., Hyden-Granskog C., et al., 2001; Gamiz P., Rubio С., Jose de los Santos M., 2003; NagyZ.P., Dozortsev D., 2003; Ebner T., Moser M., Tews G., 2004; ICattera S., Chen С., et al., 2004) Это обусловлено активными процессами в мужском и женском пронуклеусах, сопровождающимися изменением их размеров и перемещением внутри ооцита (Голиченков В.А., 2004). В некоторых странах необходимость селекции клеточного материала на уровне зиготы продиктована законодательством: культивирование эмбрионов, которые не будут впоследствии перенесены в полость матки, запрещено (Embryonenschutzgesetz, Германия). Были предложены различные варианты морфологической классификации пронуклеусов (Balaban В., Urman В., et al. 2001). Так, Tesarik J., Greco E., 1999, разработали набор критериев оценки последних и соотнесли их с другими показателями дальнейшего развития эмбрионов, подчеркивая значимость селекции именно на стадии зиготы. Классификационные признаки пронуклеусов по данным авторов: «количество проядрышек в обоих пронуклеусах не отличается более, чем на 3», «проядрышки поляризованы, когда их меньше, чем 7 и не поляризованы, когда их более, чем 7 хотя бы в одном пронуклеусе», «общее количество проядрышек в каждом пронуклеусе не менее 3 штук» отличаются сложностью формулировок и неопределенностью самих признаков. И таким образом авторы описывают 5 типов пронуклеусов.

Предпринимались попытки определения факторов, влияющих на качество ооцитов. В качестве таковых называют заболевания, приводящие к бесплодию (Homburg R., Armar N.A., Eshel A., et al., 1988, Ludwig M., Finas D.F., al-Hasani S., et al., 1999, Norenstedt S.N., Linderoth-Nagy C., Bergendal A., et ab, 2001), возраст женщины (Navot D., Bergh P.A., Williams M.A., et al., 1991, Munne S., Alikani M-, Tomkin G., et al., 1995, Dailey T., Dale В., Cohen J. and Munne S., 1996, Lim A.S. and Tsakok M.F., 1997), метод стимуляции суперовуляции (Diamond M.P., DeCherney A.H., Hill G.A., Nero F. and Wentz A.C. 1987, Imthurn В., Macas E., Rosselli M. and Keller P. J, 1996, Aboulghar M.A., Mansour R.T., Serour G.I., Ramzy A.M. and Amin Y.M., 1997, Mercan R., Mayer J.F., Walker D., Jones S., Oehninger S. and Toner J.P. et al., 1997, Cahill DJ., Harlow C.R. and Hull M.G.R., 2000).

В работе Леонова Б. В. и Гусаревой A.A. большое внимание уделяется оценке качества ооцитов, подчеркивается, что при этом очень важно соблюдать методику отмывания и культивирования комплекса ооцит-кумулус (Леонов Б.В., Гусарева A.A., 2005) ¦. 22.

Zenzes M., Belkien L., Bordt J., et al., 1985, указывали на то, что состояние цитоплазмы ооцита на момент проникновения в него сперматозоида существенно влияет на поведение последнего, а именно на темпы образования пронуклеусов, скорость конденсации хромосом. Согласно данным Plachot M., Crozet N., 1992, 33,9% ооцитов, полученных в программе ЭКО, имеют морфологические признаки незрелости. Рядом авторов было выявлено, что грубые хромосомные аберрации, равно как и другие виды патологии зародышей на доимплантационных стадиях развития проявляются в виде нарушения морфогенеза эмбрионов, образования полимультинуклеарных бластомеров, фрагментов бластомеров, зачастую не содержащих ядерного материала (Pellestor F., Dufour М.С., et al., 1994; Balakier H., Cadesky К., 1997; Pickering S.J., Taylor A., et al., 1995; Pelinck M.J., De Vos M., et al., 1998; Hardy К., Winston R.M.L., 1993; UrmanB., Balaban В., et al. 2002; Van Royen E., Mangelschots K., et al., 2003; Moriwaki T., Suganuma N., 2004) В своем исследовании Winston N.J., Braude P.R., Pienering S.J. et al., 1991, выявили, что только около 10% эмбрионов, полученных в результате оплодотворения in vitro содержат 100 процентов морфологически нормальных бластомеров, при этом был выявлен порог жизнеспособности эмбрионов: более 70% поврежденных бластомеров, однако авторами не применялась количественная оценка морфологических параметров эмбрионов, и степень достоверности качественных признаков в их работах сомнительна. М. Alikani и соавторы, используя очистку ооцитов в день их получения с последующим введением единичного сперматозоида в яйцеклетку (ICSI), провели исследование по оценке потенциала эмбрионов, полученных из яйцеклеток с дисморфией, под которой авторы подразумевали проявления гранулированности цитоплазмы, наличие очагов некроза, вакуолизацию, различные варианты изменения формы ооцита. В ходе исследования было выявлено, что эмбрионы, полученные из яйцеклеток с проявлениями дисморфии имеют сниженный потенциал для имплантации и дальнейшего развития (Alikani M., Palermo G., Adler A., et al.,.

1995). Многие авторы обращали особое внимание на сроки начала дробления и стадию развития эмбрионов в момент их переноса в полость матки или криоконсервации (Zhu J., 1997; Staessen С., 1992; Shulman A., Gen-nun I., et al., 1993; Tao J., Tamis R., et al., 2002; Lundin K., Bergh G., et al., 2003; Salumets A., Tuuri T., et al., 2003; Balaban В., IsiklarA., GursoyH., 2004; Van Montfoort A., 1 Dumoulin J., et al., 2004; Windt M.-L., Kruger T.F., et al., 2004), подчеркивая прямую взаимосвязь скорости дробления эмбриона и его способности к имплантации, предлагали варианты комплексной оценки качественных признаков эмбрионов третьего дня культивирования (Desai N., Goldstein J., et al., 2000; TerriouP., Sapin С., et al., 2001; Fisch J.D., SherG., et al., 2003; Neuber E., Rinaudo P., et al., 2003; LanK.C., Huang F.J., et al., 2003; HsuM.I., Mayer J., 1999; Isaza V., Garcia-Velasco J.A., et al., 2002; Maddox-Hyttell P., Gjorret J.O., et al., 2003; Mikkelsen A.L., Lindenberg S., 2001; Volpes A., Sammartano F., et al., 2003; Yakin K., Balaban В., et al., 2005).

Некоторые авторы особенно подчеркивали необходимость качественной оценки эмбрионов в случаях, когда необходимо точно определить допустимое их количество для переноса в матку (Adonakis G., Camus M., Joris H. et al., 1997; Vilska S., Tiitinen A., et al., 1999; Gardner DK., Sakkas D., et al., 2003; Hunault C.C., Eijkemans M.J.C., et al., 2002; Soderstrom-Anttila V., Vilska S., et al., 2003; Lukassen H.G.,.Braat D.D., et al., 2005; Van Montfoort A., Dumoulin J., Land J., et al., 2005).

Очень ценными следует считать исследования Ercelen N., Balaban В., et al., (2002) по сопоставлению морфологических характеристик эмбриона с его генетической полноценностью, оцененной с помощью преимплантационной генетической диагностики. Однако, в этих исследованиях не проводилось морфометрии эмбрионального материала.

Большинство авторов (Brinsden P.R., 1999; Lens J.W., Rijnders P.M., 1996) придерживаются следующего варианта морфологической оценки ооцитов, зигот и эмбрионов, полученных в программе экстракорпорального оплодотворения: при морфологической оценке комплекса oocyte-cumulus выделялся широко распространенный, светлый, «бархатистый» (М — mature) мало распространенный, светлый (NM — nearly mature), плотный, компактный (IMimmature), очень светлый, с уплотнениями, которые могут группироваться вокруг ооцита, создавая впечатление уплотненной corona radiata (РМpostmature), плотный, компактный^ фрагментированный в виде «кружев» (Atratretic). Обращает на себя внимание и неопределенность, терминов -«бархатистый», «светлый — очень светлый», «малораспространенный», в виде «кружев» и отсутствие какой-либо объективизации.

Такой же некоторый субъективизм, с неопределенностью градаций и признаков прослеживается и при анализе результатов оценки corona radiata: 1 -лучистая, хорошо распространенная, с четким просветлением вокруг zona pellucida, 2 — распространенная, с четкой границей ооцита, 3 — мало распространенная, ооцит виден, но граница неразличима, 4 — очень светлая, плохо заметная, максимально распространенная, 5 — плотная, ооцит не виден.

При субъективной оценке ооцитов авторы вообще не приводят конкретных классификационных характеристик, а констатируют лишь названия общих признаков, по которым необходимо анализировать состояние ооцита. Если в отношении зрелости ооцитов авторы называют 3 достаточно определенные стадии (GV, MI, Mil), то по поводу гранулированности цитоплазмы определения не четкие — «слабая — выраженная», равно как и при оценке цитоплазматических включений, в частности, не ясно, какие признаки характеризуют агрегацию гладкой эндоплазматической сети, что понимается под «мятой» и «ровной» неправильными формами ооцита, по отношению к какому «эталону» следует оценивать перивителлиновое пространство и полярные тельца как «увеличенные или уменьшенные». Что же касается предложенных авторами классификационных характеристик зигот и эмбрионов jf .

2 — 3 дня), то в них представлены достаточно четкие признаки, позволяющие определять пригодность клеточного материала для переноса в полость матки, однако, в отношении такой значимой структуры, как zona pellucida, по предлагаемым авторами оценочным свойствам ее («тонкая, толстая»), без морфометрических данных трудно разобраться. Едва ли следует считать удачными и такие признаки, как «отсутствие плотного контакта между бластомерами» (как это выявить?) и «наличие компактизации и ее оценка» (по каким признакам она оценивалась?).

Некоторые исследователи уделяли внимание прогностической значимости оценки бластоцист, которые являются наиболее поздней стадией развития зародыша человека, доступной для наблюдения врача-репродуктолога. Авторы (Balaban В., Urman В., Sertac А., 2000; Balaban В., Isiklar A., AlatasC., 2002; Utsunomiya Т., Naitou Т., et al., 2002; Virant-Klun I., Tomazevic Т., et al., 2003) предлагали использовать классификацию бластоцист, основанную на весьма корректно подобранных качественных параметрах. Однако, без морфометрии структур бластоцист их оценка с позиций исхода экстракорпорального оплодотворения не может быть признанной достаточно обоснованной.

Данная классификация рекомендована к использованию в повседневной практике врачей эмбриологов центров ЭКО, однако многие авторы отмечали, что морфологическая оценка качества ооцита, степени его зрелости, а также оценка качества зигот и эмбрионов весьма субъективна, зачастую не отвечает истинному состоянию клеточного материала (Кулаков В.И., Леонов Б. В., 2000; VeeckL., 1988).

В то же время, необходимость в создании фундаментально обоснованной системы оценки качества дробящегося эмбриона трудно переоценить. Перенос эмбрионов в полость матки во многих клиниках производится именно на стадии дробления (2−3-й день культивирования). Единственным практическим неинвазивным способом оценки способности этих эмбрионов к дальнейшему развитию является морфологический анализ.

В этой связи необходимо вспомнить понятие об «эмбриональной регуляции», предложенное Л. В. Белоусовым (1980) на основании экспериментальных работ с эмбрионами животных. Эксперименты показали, что удаление, добавление и перемешивание эмбриологического материала не препятствует возникновению целых зародышей с нормальным строением. Эти искусственные воздействия в период дробления соответствовали естественной вариабельности объемов зиготы, отдельных бластомеров и эмбриона в целом, а также пространственной организации дробящегося эмбриона. Уникальные свойства бластомеров подтверждаются их. тотипотентностью, то есть потенциальной способностью отдельных бластомеров давать начало целому организму, что было продемонстрировано и на грызунах (Matsumoto К. et al., 1989), и на низших обезьянах Chan A.W.S. et al. (2000), добившихся рождения здоровой макаки резус после разделения 8-клеточного эмбриона на 4 части. Еще П. П. Иванов (1937) писал о дроблении как о «цитотипическом периоде развития», когда элементы зародыша состоят из самостоятельных одноклеточных единиц, непосредственным результатом динамики которых являются надклеточные процессы — формирование бластоцисты и т. д. Указанные эксперименты в некоторой степени подтверждают обоснованность такого утверждения.

Исходя из изложенного становится очевидным, что так необходимые для врача-репродуктолога качественные характеристики, предложенные многими авторами — разноречивы, субъективны, отдельные из них не конкретны, не воспринимаются однозначно. Кроме того, мало исследований, где бы были выделены самые существенные, значимые из характеристик, которые можно было бы принять в качестве критериев для выбора наиболее пригодного материала. Следует подчеркнуть, что очень мало исследований посвящено получению морфометрических данных о структурах эмбриональных клеток. В то время как именно морфометрический анализ клеточного материала в сопоставлении с результатами ЭКО позволяет выявить и наиболее информативные критерии по структурным признакам и определить объективно их вариабельность в пределах искомого качества. В этом отношении заслуживает внимания история применения стереометрического метода. Последний был применен в медико-биологических исследованиях Автандиловым Г. Г. в 1973 году и позднее стал все шире использоваться в работах морфологов и клиницистов (Ягубов A.C., Кац В. А., 1974; Автандилов Г. Г, Зукакова И. Б., 1975; Стропус P.A. и соавт., 1976— Струков А. И., Кактурский Л. В., 1979; Ташкэ К., 1980; Зинкович И. И., 1983; Бонашевская Т. И. и соавт., 1984; Автандилов Г. Г. и соавт., 1984; Перов Ю. Л., 1984; Непомнящих Л. М. и соавт., 1986;). Качественные характеристики структур объектов не всегда бывают достаточными для четкого представления об их значимости, функциональном состоянии. Только количественная морфологическая оценка любых структур позволяет объективно оценивать их свойства (Гуцол A.A., Кондратьев Б. Ю., 1988) и это особенно важно в оценке эмбрионального клеточного материала;

Известны многие морфометрические методики оценки морфологических структур (Глаголев A.A., 1941; Лакин Г. Ф., 1968; Плохинский H.A., 1970; Васильев Г. и соавт., 1977; Автандилов Г. Г., 1980; Леонтюк A.C., 1981). В них оценка результатов страдает существенным недостатком — нет компьютерной обработки с высокой степенью достоверности по многим параметрам и выявить значимые величины достаточно сложно. Кроме того, без компьютерных технологий морфометрия становится крайне трудоемкой и несет в себе дефектность в отношении достоверности результатов (Автандилов Г. Г., 1990). Развитие компьютерных технологий привело к созданию программ, ускоряющих и упрощающих методику морфометрии (Исаков В.Л., 1988).

Одним из немногих исследований, где in vivo и in vitro проводилась морфометрия эмбрионального клеточного материала, является работа Bertolini.

M., Mason J. В. et al., (2002). Однако, авторами были описаны общие морфометрические параметры, мало применимые в клинической практике, поскольку работа проводилась на животных. Авторы не ставили своей целью придать параметрам критериальный статус. Морфометрические исследования проводились и на человеческом эмбриональном материале, но они касались только бластомеров эмбрионов (Hnida С., Engenheiro Е., Ziebe S., 2004), внутренней клеточной массы бластоцист (Richter К., Harris D., Daneshmand S., Shapiro В., 2001) без сопоставления с параметрами структур ооцитов и зигот.

В настоящее время создано много систем и программ морфометрического анализа, однако в отношении морфометрической оценки комплекса ооцит-кумулус, зигот и эмбрионов, с выявлением зависимости исходов экстракорпорального оплодотворения от параметров клеточного материала, пока еще нет достаточно убедительных сведений. Следует учесть, что использование визуальных признаков эмбриональных клеток в качестве критериев для выбора наиболее пригодного для ЭКО материала возможно только после подтверждения его перспективности морфометрическими методами, при обязательном сопоставлении с результатами процедуры. Безусловно, это должно быть выполнено на современнейшем компьютерном оборудовании, с использованием новейших программ, принятых для такого рода исследований (Mortimer D., Mortimer S.T., 1998). Некоторые известные методы морфометрии вообще неприемлемы для анализа эмбрионального клеточного материала, поскольку ведут к нарушению процедуры ЭКО (Кошевой Ю.В. и соавт., 1977; De Vos A. et al. 2003) или требуют слишком сложных лабораторных условий (Berkovitz A. et al., 2005).

Таким образом, отсутствие в литературе достаточно убедительных сведений о роли качественных признаков комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов, равно как и морфометрически объективизированных критериев для выбора прогностически позитивного эмбрионального клеточного материала привело к необходимости выполнения данной работы.

I Лака йгйалй! й мь «ида!

125 Выводы.

1. При выявленной широкой вариабельности структур комплекса ооцит-кумулус, зигот и эмбрионов, оценка и отбор наиболее перспективного клеточного материала в программе экстракорпорального оплодотворения может проводиться с использованием качественных морфологических критериев, поскольку обнаружена взаимосвязь между этими критериями и успешностью этапов процедуры.

2. Значимыми и позитивными в отношении результатов экстракорпорального оплодотворения качественными признаками при выборе комплексов ооцит-кумулус являются: распространенный лучистый венец, выраженные лучи в лучистом венце, низкая оптическая плотность.

3. Качественными параметрами выбора наиболее перспективных зигот являются: светлая цитоплазма, равномерно широкое перивителлиновое пространство.

4. Качественными признаками отбора эмбрионов, обеспечивающих высокий процент имплантации, следует считать: количество бластомеров не менее 6−8, светлую цитоплазму бластомеров, отсутствие фрагментации.

5. Информативными морфометрическими параметрами комплекса ооцит-кумулус, подтверждающими значимость выбранных качественных признаков для прогнозирования успешности экстракорпорального оплодотворения, являются: площадь комплекса, периметр, большая и малая оси, диаметр Фере и интегративная оптическая плотность.

6. При выборе наиболее перспективных для получения качественных эмбрионов зигот информативно значимыми морфометрическими критериями следует считать: площадь, периметр, большая и малая оси, диаметр Фере и интегративная оптическая плотность.

7. Информативно значимыми морфометрическими параметрами эмбрионов, обеспечивающих высокий процент имплантации, являются: площадь и периметр комплекса бластомеров, длина большой оси комплекса бластомеров, его удлиненность, диаметр Фере, интегративная оптическая плотность.

Внедрение результатов в практику.

Предложенные критерии качественной и количественной оценки морфофункционального состояния системы ооцит-кумулус, ооцитов, зигот, эмбрионов при использовании их для отбора наиболее перспективного клеточного материала в повседневной работе эмбриологических лабораторий Российско-американского центра репродукции и генетики человека и Сибирского института репродукции и генетики человека способствуют повышению результативности лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения.