Миелоидные супрессорные клетки при экспериментальной туберкулёзной инфекции

Научная новизна.10.

Практическая значимость.10.

Структура и объём диссертации.12.

Глава 1. Обзор литературы.13.

1.1 Иммунный ответ хозяина на инфекцию М. tuberculosis.13.

1.1.1 Начальные этапы иммунного ответа на инфекцию Mtb.13.

1.1.2 Роль отдельных популяций иммунокомпетентных клеток в противотуберкулёзном иммунитете.15.

1.1.3 Особенности иммунного ответа при прогрессировании ТБ инфекции.20.

1.1.4 Прогрессирование ТБ: роль воспалительного ответа.21.

1.1.5 Прогрессирование ТБ: супрессия иммунного ответа Т-лимфоцитов.22.

1.2 Супрессорные клетки миелоидного происхождения.25.

1.2.1 Фенотип клеток и субпопуляции.25.

1.2.2 Эффекты МС на иммунную систему организма.27.

1.2.3 Механизмы супрессии Т-лимфоцитов клетками МС.30.

1.2.4 Факторы, индуцирующие образование МС при патологических состояниях.33.

1.2.5 Заключение.35.

Глава 2. Материалы и методы.36.

2.1 Животные.36.

2.2 Культуральные среды и растворы.36.

2.3 Экспериментальная туберкулёзная инфекция.36.

2.4 Определение количества микобактекрий в лёгких заражённых мышей.37.

2.5 Получение суспензий клеток лёгочной ткани, костного мозга и селезёнки экспериментальных мышей.37.

2.6 Анализ клеточных суспензий методом проточной цитометрии.38.

2.7 Световая и конфокальная микроскопия.39.

2.8 Выделение клеточных популяций KM Gr-lhl CDllb+ и Gr-ldim CDllb+ методом магнитной сортировки.39.

2.9 Оценка супрессорной активности клеток КМ.40.

2.10 Иммуноферментный анализ содержания ИФН-у в лёгочной ткани и культуральных супернатантах.42.

2.11 Измерение количества оксида азота (II).42.

2.12 Адоптивный перенос клеток Gr-ldim.43.

2.13 Статистическая обработка результатов.43.

Глава 3. Результаты исследований.44.

3.1 Динамика появления клеток Gr-ldim CDllb+ при инфекции М. tuberculosis у мышей I/St.44.

3.2 Накопление клеток Gr-ldim при прогрессирующей ТБ инфекции у мышей различных линий.48.

3.3 Характеристика поверхностного фенотипа клеток Gr-ldim и Gr-lhl.50.

3.4 Анализ морфологии ядер клеток Gr-1 1 и Gr-lhl.60.

3.5 Супрессия Т-клеточного ответа клетками КМ инфицированных мышей.63.

3.6 Супрессия Т-клеточного ответа клетками Gr-ld, m.67.

3.7 Анализ механизмов супрессорной активности клеток Gr-ldim.69.

3.8 Влияние адоптивного переноса клеток Gr-ldim на продукцию ИФН-у в лёгочной ткани.72.

Заключение

74.

Глава 4. Обсуждение результатов.75.

4.1 Накопление Gr-1-экспрессирующих клеток при ТБ.75.

4.2 Субпопуляции МС.77.

4.3 Подавление Т-клеточного ответа при ТБ инфекции.77.

4.4 Факторы, индуцирующие накопление МС.79.

4.5 Роль МС при ТБ инфекции.81.

Выводы.84.

Список цитируемой литературы.87.

Список условных сокращений:

АФА — активные формы азота;

АФК — активные формы кислорода;

БСА — бычий сывороточный альбумин.

ИФН-у — интерферон-у.

КМ — костный мозг;

КОЕ — колониеобразующие единицы;

КС — клетки селезёнки;

МЛУ — множественная лекарственная устойчивость;

МС — миелоидные супрессоры;

ПАФ — параформальдегид;

СОД — супероксид-дисмутаза;

ТБ — туберкулёз;

ФСБ — фосфатно-солевой буфер;

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЭТС — эмбриональная телячья сывороткаa-CD3 — антитела анти-СБЗ;

CCL — СС ligand — хемокины класса СС;

CXCL — СХС ligand — хемокины класса СХС;

CFSE — carboxyfluorescein succinimidyl ester — сукцинимидный эфир карбоксифлуоресцеинаCFDA-SE — carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester — сукцинимидный эфир карбоксифлуоресцеинаFSC — прямое светорассеяние;

G-CSFгранулоцитарный колониестимулирующий факторGM-CSFгранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий факторHEPES — М-2-гидроксиэтил-пиперазин-1Ч-2-этансульфоновая кислота IL — interleukin — интерлейкинiNOS — inducible NO-syntahse — индуцибельная синтаза оксида азота (II) — L. monocytogenes — Listeria monocytogenesL-NMMA — моноацетат №-монометил-Ь-аргинина.

L-NOHA — моноацетат Nгидрокси-Ь-аргинина.

MDSC — myeloid-derived suppressor cell — супрессорные клетки миелоидного происхождения;

MFI — mean fluorescence intensity — среднее значение флуоресценции.

М. tuberculosis — Mycobacterium tuberculosis;

NK-клетки — клетки натуральные киллеры;

NKT-клетки — Т-клетки натуральные киллеры;

N0 — оксид азота (II);

SSC — боковое светорассеяние;

TGF-? — transforming growth factor? — трансформирующий фактор роста ?- Treg — T-regulatory cell — Т-регуляторные клеткиVEGF — фактор роста сосудистого эндотелия.

Нормативные ссылки.

ГОСТ 7.1—84 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Библиографическое описание документа. Общие требования и правила составления.

ГОСТ 7.9—95 (ИСО 214—76) Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Реферат и аннотация. Общие требования.

ГОСТ 7.32—2001 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления.

Актуальность проблемы.

Туберкулёз (ТБ) является одним из наиболее распространённых инфекционных заболеваний в мире и наиболее распространённой причиной гибели населения от инфекционного бактериального заболевания (WHO, 2011; Андрюхина Г. Я., 2000; Шевченко Ю. JL, 2000). Предупреждение распространения ТБ требует разработки новых методов его диагностики, лечения и профилактики. Решение этих задач невозможно без понимания клеточных и молекулярных механизмов, обеспечивающих иммунологический контроль над развитием заболевания, и выяснения патогенетических путей его прогрессирования.

Изучению патогенеза ТБ посвящено большое количество исследований. Эти исследования позволили установить роль Т-лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов в инициации и развитии противотуберкулёзного иммунного ответа, в формировании гранулёмвыявили ключевые цитокины, необходимые для эффективной противотуберкулёзной защиты (ИФН-у, TNF-a и др.), основные медиаторы антимикобактериальной активности фагоцитов (активные формы азота, кислорода и др.) (Flynn J. L., 2001). Было показано, что дефекты в этих звеньях иммунного ответа приводят к развитию тяжёлых форм ТБ, что связано с нарушениями иммунологического контроля уже на начальных этапах инфекции М. tuberculosis. Заболевание ТБ, однако, встречается и у лиц без выраженных признаков иммунодефицитов. При этом течение заболевания и скорость его прогрессирования могут быть различными. Факторы, определяющие особенности течения ТБ и скорость его прогрессирования у иммунокомпетентных хозяев остаются не до конца понятными.

Недавние исследования, проведённые в ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН на модели экспериментальной ТБ инфекции у мышей, показали, что быстрое прогрессирование ТБ характеризуется развитием сильного воспалительного ответа, а также накоплением в лёгочной ткани инфицированных мышей необычной популяции клеток с фенотипом Gr-ldim (Lyadova I. V., 2010). Основной особенностью этих клеток являлась экспрессия маркёров, характерных для нейтрофилов (Gr-1, Ly-6G), но на уровне, существенно более низком, чем это свойственно нейтрофилам. Природа клеток Gr-ldim, их присутствие в других органах инфицированных мышей (в частности, в органах кроветворения), а также их вклад в прогрессирование ТБ оставались непонятными. В то же время, в литературе имеется большое количество работ, посвященных изучению подобных клеток (клеток с фенотипом Gr-ldim) при других патологических состояниях. Показано, что клетки Gr-ldim экспрессируют маркёр миелоидных клеток CDllb, образуются и в больших количествах накапливаются при опухолевых заболеваниях, травмах, некоторых инфекциях (Gabrilovich D. I., 2009). При этих патологиях клетки Gr-ldim, как правило, представляют собой незрелые миелоидные клетки (предшественники гранулоцитов, моноцитов, дендритных клеток), которые образуются под воздействием воспалительных факторов, обладают способностью подавлять Т-клеточный ответ и за счёт этого вносят вклад в патогенез основного заболевания. Такие клетки в англоязычной литературе принято называть супрессорными клетками миелоидного происхождения (от английского myeloid-derived suppressor cells, MDSCв настоящей работе — МС — миелоидные супрессоры (Gabrilovich D. I., 2009).

Известно, что прогрессирование ТБ часто сопровождается снижением количества и функциональной активности Т-лимфоцитов (Bold Т. D., 2011; Pilheu J. А. 1997; Ловачёва О. В., 1993). Причины Т-клеточной анергии при ТБ до настоящего времени остаются не до конца понятными. Нами было предположено, что клетки Gr-ldim, обнаруженные ранее в лёгких мышей с быстро прогрессирующей ТБ инфекцией, могут представлять собой незрелые миелоидные клетки, обладать супрессорной активностью и за счёт этого вносить вклад в прогрессирование заболевания.

Цель настоящей работы — изучение популяционного состава, фенотипа, супрессорной активности и роли клеток Gr-ldim при экспериментальной туберкулёзной инфекции.

Задачи исследования:

1. Исследовать динамику накопления клеток Gr-ldimCDllb+ в легких, костном мозге и селезёнке мышей в процессе развития экспериментальной ТБ инфекции.

2. Охарактеризовать поверхностный фенотип (экспрессию маркёров Ly-6G, Ly-6C, F4/80, CD49d) и морфологию ядра клеток Gr-ldimCDllb+.

3. Оценить способность клеток Gr-ld, mCDllb+ к супрессии Т-клеточного ответа (пролиферации Т-клеток и секреции ИФН-у).

4. Изучить механизмы супрессорной активности клеток Gr-ldimCDllb+.

5. Исследовать влияние клеток Gr-ld, mCDllb+ на течение туберкулёзной инфекции у мышей.

Научная новизна.

1. Впервые показано, что у мышей прогрессирующая туберкулёзная инфекция сопровождается образованием и накоплением в КМ и селезёнке популяции клеток Gr-ldimCDllb+.

2. Продемонстрировано, что образующиеся в условиях прогрессирующей туберкулёзной инфекции клетки Gr-ldimCDllb+ не являются нейтрофилами, представляют собой незрелые миелоидные клетки и обладают способностью подавлять пролиферацию Т-клеток и секрецию ИФН-у.

3. Обнаружено, что способность клеток с фенотипом Gr-ldimCDllb+ подавлять 1 -клеточный ответ при туберкулёзной инфекции опосредована продукцией оксида азота (II) и не связана с продукцией активных форм кислорода или ферментативной активностью аргиназы I.

4. В экспериментах с адоптивным переносом продемонстрирован вклад незрелых миелоидных клеток в супрессию иммунного ответа при туберкулёзной инфекции.

В целом, в работе получены оригинальные данные о накоплении незрелых миелоидных клеток (клеток с фенотипом Gr-ldimCDllb+) при прогрессирующей ТБ инфекции, показана их роль в супрессии протективного противотуберкулёзного Т-клеточного ответа, продемонстрирован их вклад в прогрессирование ТБ инфекции. До настоящего времени такие сведения в литературе отсутствовали. Кроме того, до настоящего времени считалось, что накапливающиеся при ТБ инфекции Gr-1-экспрессирующие клетки представляют собой гранулоциты и вносят вклад в патогенез ТБ, главным образом, за счёт повреждения тканей (Eruslanov Е. В., 2005; Keller С., 2006). Результаты настоящей работы впервые демонстрируют, что клетки Gr-1+ CDllb+, в больших количествах образующиеся при прогрессирующей ТБ инфекции, характеризуются невысоким уровнем экспрессии маркёра Gr-1, представляют собой не нейтрофилы, а незрелые миелоидные клетки, представлены, главным образом, клетками моноцитарного типа, и могут оказывать влияние на течение ТБ инфекции за счёт супрессорного воздействия на протективный Т-клеточный ответ. Практическая значимость.

Работа проведена на экспериментальной модели и носит, прежде всего, фундаментальный характер: получены новые данные об образовании незрелых миелоидных клеток при прогрессирующей ТБ инфекции и роли этих клеток в супрессии иммунного ответа и прогреесировании ТБ инфекции. Эти результаты расширяют существующие представления о патогенезе ТБ. Практическая значимость работы состоит в том, что создана основа для разработки новых методов патогенетической терапии ТБ, в частности, методов таргетной терапии, направленной на подавление образования или активности незрелых миелоидных супрессорных клеток. Разработка таких методов для комплексного лечения других тяжёлых заболеваний (например, онкологических) в настоящее время активно ведётся (Gabrilovich D. I., 2009). Полученные в работе результаты могут найти применение и для мониторинга течения ТБ — результаты, полученные на экспериментальной модели, свидетельствуют о том, что определение содержания миелоидных супрессорных клеток при ТБ позволяет судить о тяжести инфекционного процесса. Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, в лекциях для клинических иммунологов.

Внедрение результатов исследования.

Материалы диссертационного исследования используются в курсе лекций для ординаторов и аспирантов ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, а также в курсе лекций по клинической иммунологии «Иммунология для врачей».

Положения, выносимые на защиту:

1. У мышей прелетальная стадия ТБ инфекции сопровождается накоплением в лёгких, костном мозге и селезёнке клеток Gr-ldimCDllb+ и одновременным уменьшением содержания в указанных органах зрелых нейтрофилов — клеток Gr-1 CDllb .

2. Клетки Gr-ldimCDllb+, накапливающиеся при ТБ, представляют собой незрелые миелоидные клетки, преимущественно моноцитарного типа, обладают способностью супрессировать Т-клеточный иммунный ответ и за счёт этого могут вносить вклад в прогрессирование инфекции.

Апробация диссертации состоялась 25 марта 2013 года на научной конференции отделов иммунологии и микробиологии ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН.

Основные положения диссертации были представлены на конференциях молодых учёных «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулёза взрослых и детей» в 2010 и 2012 годах (г. Москва), на XIV Международном иммунологическом конгрессе в 2010 г. (г. Кобэ, Япония), конференции «Keystone Symposia: Hematopoiesis» в 2011 году (г. Биг-Скай, США), конференции «Актуальные вопросы борьбы с туберкулёзом» в 2011 году (г. Москва), Конгрессе международного общества аналитической цитометрии в 2012 году (г. Лейпциг, Германия), X конференции иммунологов Урала в 2012 году (г. Тюмень), конференции «Keystone Symposia: Host Response in Tuberculosis» в 2013 г. (г. Вистлер, Канада). По результатам работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 научные статьи, опубликованные в изданиях рецензируемых ВАК.

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований (8 глав), обсуждения полученных результатов и выводов.

Список литературы

включает 192 источника, из них 11 отечественных и 181 иностранная работа. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами и 17 рисунками.

Выводы.

1. У мышей прогрессирование туберкулёзной инфекции сопровождается накоплением в лёгких, костном мозге и селезенке клеток, имеющих фенотип Gr-ldimCDllb+. Увеличение содержания клеток Gr-ldimCDllb+ является характерным признаком прелетальной стадии инфекции и достигает в лёгких 29 ± 4%, в КМ — 34 ± 2%, в селезёнке — 7 ± 1%.

2. Появление и увеличение содержания клеток Gr-ldimCDllb+ в легких, костном мозге и селезёнке мышей, инфицированных М. tuberculosis, сопровождается уменьшением содержания в этих органах клеток Gr-lhl CDllb+ (гранулоцитов).

3. Клетки Gr-ldimCDllb+, накапливающиеся в легких и других органах мышеи с прогрессирующей ТБ инфекцией, имеют фенотип Ly-6GdimF4/80+Ly-6Chl CD49dhl, т. е. характеризуются одновременной экспрессией маркёров нейтрофилов (Ly-6G, Gr-1) и моноцитов (F4/80).

4. Особенности морфологии ядер клеток Gr-ldimCDllb+ (ядра моноцитарного типа) свидетельствуют о принадлежности этих клеток к незрелым миелоидным клеткам, преимущественно моноцитарного типа.

5. Клетки Gr-ldimCDllb+ проявляют супрессорную активность: подавляют пролиферацию Т-лимфоцитов CD4+ и CD8+ и продукцию ИФН-у.

6. Супрессорная активность клеток Gr-ldimCDllb+ опосредована продукцией оксида азота и требует установления межклеточных контактов с клетками-мишенями.

7. Особенности поверхностного фенотипа, морфологии ядер и наличие супрессорной активности у клеток Gr-ldimCDllb+ позволяют отнести эти клетки к популяции клеток МС (супрессорных клеток миелоидного происхождения).

8. Адоптивный перенос клеток Gr-ldim CDllb+ мышам, инфицированным М tuberculosis, вызывает подавление продукции ИФН-у в лёгочной ткани, что свидетельствует о вероятном вкладе клеток Gr-ldimCDllb+ в патогенез прогрессирующей туберкулёзной инфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Lyadova I., Kapina M., Shepelkova G., Sosunov V., Majorov К., Tsiganov E. Shmitova N., Winslow G. 2009. The pattern of pro-inflammatory gene expression in phagocytes determines the outcome of Mtb infection. Keystone Symposia: Tuberculosis — BiologyPathology and Therapy, p. 115.

2. Цыганов E. H. 2009. Анализ экспрессии факторов воспаления в макрофагах мышей, чувствительных и резистентных к туберкулёзной инфекции. Конференция молодых учёных Ломоносов — 2009. стр. 41 — 42. Издательство МГУ, Москва.

3. Lyadova I., Tsiganov Е&bdquoShmitova N. 2010. A role for macrophages and granulocytes in lung tissue inflammation and tuberculosis progression. 14th International Congress of Immunology.

4. Lyadova I.V., Tsiganov E.N., Kapina M.A., Shepelkova G.S., Sosunov V.V., Radaeva T.V., Majorov K.B., Shmitova N.S., van den Ham H.J., Ganusov V.V., De Boer R.J., Racine R., Winslow G.M. 2010. In mice, tuberculosis progression is associated with intensive inflammatory response and the accumulation of Gr-1 cells in the lungs. PLoS One. 5(5):el0469, стр.: 1 — 16.

5. Цыганов E. H. Изучение экспрессии факторов воспаления в фагоцитах мышей, чувствительных и резистентных к туберкулёзной инфекции. 2010. Инновационные технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулёза у взрослых и детей стр. 135 — 137. Издательство ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН, Москва.

6. Tsiganov E., Razinkova A., Lyadova I. 2011. Hematopoietic shifts during experimental tuberculosis infection. Keystone Symposia: Hematopoiesis.

1. Цыганов E. H., Разинкова A. M., Лядова И. В. 2012. Появление незрелых миелондных клеток в лёгочной ткани мышей при инфекции М. tuberculosis. Вестник Уральской Медицинской Академической Науки. № 4, стр.: 180.

8. Лядова И. В., Цыганов E. Н., Костюкевич М. В. 2012. Нейтрофилы при туберкулёзе: протекция или патология. Туберкулёз и болезни лёгких. № 7, стр.: 12−21.

9. Lyadova I.V., Tsiganov E.N. 2012. Phenotypic and morphological analysis of Gr-ldim/Ly-6Gdim cells, a marker of severe rapidly progressing tuberculosis infection in mice. CYTO 2012.

10. Nikitina I.Y., Tsiganov E.N. Vasilyeva I.A., Lyadova I.V. 2012. The degree of CD4 T cell differentiation as marker of tuberculosis severity and progression. The Journal of Immunology: abstracts of the European Congress of Immunology. — Glasgow, 2012. — P.600.

11. Tsiganov E.N. Razinkova E.V., Radaeva T.V., Nikitina I.Yu., Sosunov V.V., Lyadova I.V. 2013. Gr-ldim cells accumulating at advanced stage of Mtb infection represent immature myeloid cells with immune suppressor activity. Host Response in Tuberculosis, Keystone Symposia. i.

Заключение

.

Таким образом, проведённые нами исследования показали, что прогрессирующая ТБ инфекция сопровождается образованием и накоплением в лёгочной ткани, КМ и селезёнке незрелых миелоидных клеток Gr-ldim. Фенотипические и морфологические характеристики этих клеток позволяют отнести их к миелоидным супрессорным клеткам. Способность клеток Gr-ldim к супрессии Т-клеточного ответа, особенности образования этих клеток у мышей чувствительных и резистентных линий (клетки образуются и накапливаются в периферических органах как чувствительных, так и резистентных мышей, однако, у резистентных мышей накопление происходит на более поздние сроки), а также влияние переноса клеток Gr-ldim на течение ТБ инфекции и продукцию in vivo, позволяют заключить, что образование клеток Gr-ldim вносит существенный вклад в прогрессирование ТБ инфекции (является одним из механизмов прогрессирования ТБ).

Глава 4. Обсуждение результатов.

Настоящая работа посвящена изучению прогрессирования экспериментальной туберкулёзной инфекции у мышей. В настоящей работе показано, что экспериментальная туберкулёзная инфекция сопровождается накоплением необычной популяции клеток Gr-ldim. Особенности фенотипа и клеточной морфологии этой популяции свидетельствуют о том, что эти клетки представляют собой незрелые миелоидные клетки, а анализ их функциональной активности выявил способность этих клеток супрессировать иммунный ответ Т-клеток, в частности, их пролиферацию и продукцию ИФН-у. При адоптивном переносе клеток Gr-ldim инфицированным мышам мы наблюдали подавление продукции ИФН-у в лёгочной ткани. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данные клетки представляют собой клетки МС и могут оказывать влияние на течение ТБ инфекции.

4.1 Накопление Gr-1-экспрессирующих клеток при ТБ.

Накопление клеток Gr-1+ в лёгочной ткани при ТБ инфекции описано во многих работах (Eruslanov Е. В., 2005; Eum S.-Y., 2010; Keller С., 2006). В этих исследованиях клетки Gr-1+ обычно классифицируются авторами как нейтрофилы (по характеристикам морфологии клеток и/или экспрессии маркёра Gr-1+). В настоящей работе, мы оценивали не только количество клеток, экспрессирующих маркёр Gr-І, но и уровень экспрессии этого маркёра. Такой подход позволил выявить, что при прогрессировании инфекции накапливается популяция, экспрессирующая маркёр Gr-І на невысоком уровне (фенотип Gr-ldim), а популяция Gr-lhl, представляющая собой по данным литературы зрелые нейтрофилы (Hestdal К., 1991), напротив, становится немногочисленной и постепенно исчезает.

Установленный в работе фенотип и морфологические характеристики клеток Gr-ldim (несегментированная форма клеточного ядра, коэкспрессия моноцитарного маркёра F4/80 и нейтрофильного маркёра Ly-6G — фенотип F4/80+Ly6Gdim) говорят о том, что клетки Gr-ldim не относятся к гранулоцитам, а, скорее, представляют собой незрелые миелоидные клетки. Такой вывод согласуется с данными Hestdal и соавт., которые показали, что клетки Gr-ldim в КМ здоровых мышей являются незрелыми миелоидными предшественниками с количественным преобладанием миелоцитов (Hestdal К., 1991), а также с результатами исследований Satake и соавт. В последней из упомянутых работ авторы исследовали клетки Ly-6Glow/dim, присутствующие в КМ здоровых мышей, и показали, что они представляют собой, главным образом, промиелоциты, миелоциты и метамиелоциты (Satake S., 2012). Satake и соавт. также показали, что при инфекции Candida albicans в КМ уменьшается число зрелых нейтрофильных клеток Ly-6Ghl и накапливаются незрелые миелоидные клетки Ly-gQiow/dim данные5 которые соответствуют результатам нашего исследования. Авторы объясняют полученные результаты мобилизацией зрелых нейтрофилов в ответ на инфекцию и активацией процессов «экстренного» гемопоэза, при котором индуцируется продукция большого количества незрелых миелоидных предшественников. Аналогичным образом могут быть интерпретированы и результаты настоящей работы: можно предположить, что увеличение количества клеток Gr-lhl в лёгких и селезёнке на 17 день инфекции и их одновременное уменьшение в КМ связано с мобилизацией и миграцией зрелых нейтрофилов из КМ в очаг инфекции. Постепенное накопление незрелых миелоидных предшественников Gr-ldim, очевидно, связано с активацией процессов «экстренного» гемопоэза.

Следует отметить, что в отличие от работы Satake и соавт., при ТБ инфекции мы наблюдали «истощение» пула зрелых нейтрофилов Gr-lhl. По-видимому, это связано с более сильными сдвигами гемопоэза и нарушением образования зрелых нейтрофилов, поскольку ТБ инфекция протекает тяжелее, чем инфекция Candida albicans. В настоящей работе нами было установлено, что клетки, которые формально попадали на цитометрических графиках в регион «Gr-lhl» отличались от клеток Gr-lhl здоровых мышей меньшим боковым светорассеянием, меньшим уровнем экспрессии маркёров Gr-1 и Ly-6G и более высоким уровнем экспрессии маркёра CD49d. Учитывая данные литературы о характере экспрессии данных маркёров, можно заключить, что по сравнению с клетками Gr-lhl здоровых мышей популяция Gr-lhl инфицированных мышей содержала менее зрелые клетки. Полученные результаты согласуются с наблюдениями других авторов, исследовавших процессы накопления МС при различных патологиях. Так, ранее Youn и соавт. отмечали, что у мышей с опухолями различных типов (тимома, меланома, карцинома) накапливающиеся МС «гранулоцитарного» типа представляли собой менее зрелые клетки, чем гранулоциты нормальных мышей (судя по сниженному уровню экспрессии маркёра Ly-6G, пониженному уровню лизосомальных и протеосомных белков и сниженной функциональной активности (Youn J. I., 2012). В нашей работе при прогрессирующей ТБ инфекции эта популяция уменьшала уровень экспрессии маркёра Ly-6G и приобретала способность супрессировать иммунный ответ Т-клеток.

Таким образом, по нашим данным, характерной чертой ТБ инфекции являлось смещение процессов миелопоэза «влево» (в сторону образования менее зрелых клеток), характеризующееся накоплением незрелых миелоидных клеток, обладающих способностью подавлять иммунный ответ Т-клеток.

4.2 Субпопуляции MC.

Из литературы известно, что клетки MC гетерогенны по своему составу. Принято выделять две основные субпопуляции MC, называемые в соответствии с их морфологией «гранулоцитарной» и «моноцитарной» субпопуляциями. Клетки каждой субпопуляции могут отличаться по степени зрелости. Клетки Gr-ldim, изучавшиеся в настоящей работе, экспрессировали маркёр макрофагов/моноцитов F4/80 и имели ядро по морфологии близкое клеткам-предшественникам моноцитарного миелопоэтического ряда. Кроме того, данная популяция экспрессировала на высоком уровне маркёр CD49d, что, по данным Haile и соавт., является признаком «моноцитарной» природы исследованных клеток (Haile L. А., 2010). Стоит, однако, отметить, что клетки Gr-ldim на низком уровне экспрессировали также и нейтрофильный маркёр Ly-6G, хотя и на низком уровне, что по данным литературы характерно для «гранулоцитарной» субпопуляции MC (Gabrilovich D. I., 2012). В целом, исходя из полученных данных о морфологии ядра и поверхностного фенотипа, можно заключить, что исследованные клетки Gr-ldim по свойствам были ближе к «моноцитарной» субпопуляции MC. Клетки Gr-lhl инфицированных мышей по фенотипу и морфологии ядра можно отнести к гранулоцитам. Однако, сравнение их с аналогичной популяцией здоровых мышей (сниженный уровень экспрессии маркёров Ly-6G и Gr-1, повышение уровня экспрессии маркёра CD49d) также указывало на их менее зрелое состояние. Таким образом, можно полагать, что клетки Gr-lhl инфицированных мышей представляют собой незрелые гранулоцитарные предшественники.

4.3 Подавление Т-клеточного ответа при ТБ инфекции.

Уменьшение количества Т-клеток и их функциональной активности при тяжёлых формах ТБ было давно описано разными группами исследователей (Beck J. S., 1985; Bernal-Fernandez G., 2010; Bold T. D., 2011; Pilheu J. A., 1997; Turett G. S., 1994). Однако механизмы подавления Т-клеточного ответа при тяжёлых формах ТБ до сих пор остаются не до конца понятными.

В настоящей работе мы выявили способность клеток цельного (неразделённого) КМ инфицированных мышей супрессировать Т-клеточный ответ in vitro. При этом клетки, полученные от здоровых мышей, такой способностью не обладали. Используя обогащение клеток КМ популяциями клеток Gr-ldim и Gr-lhl методом магнитной сепарации, нам удалось показать, что супрессировать иммунный ответ Т-клеток способны популяции Gr-ldim от здоровых и инфицированных мышей и популяция Gr-lhl инфицированных мышей. Таким образом, мы впервые показали образование клеток MC при ТБ инфекции и их возможную роль в супрессии иммунного ответа Т-клеток при ТБ.

Известно, что популяции гранулоцитарных и моноцитарных MC различаются по выраженности супрессорной активности и её механизмам. Так, различными группами исследователей было показано, что «моноцитарная» субпопуляция подавляет Т-клеточный ответ, преимущественно, за счёт продукции оксида азота (Gabrilovich D. I., 2012). Другими исследователями установлено, что супрессорная активность «гранулоцитарной» субпопуляции MC связана, как правило, с продукцией активных форм кислорода (Gabrilovich D. I., 2009; Kusmartsev S., 2004). В нашей работе супрессорная активность клеток Gr-ld, m была опосредована продукцией NO, что свидетельствует о принадлежности этой популяции к «моноцитарному», а не «гранулоцитарному» типу MC. Интересно, что и популяция клеток, обогащённая клетками Gr-lhl подавляла Т-клеточный ответ за счёт продукции NO. Это может объясняться особеностями этой субпопуляции при ТБ инфекции или наличием в ней примеси клеток Gr-ldim.

Данные о роли NO в регуляции количества активированных Т-лимфоцитов в очаге инфекции Mycobacterium avium были получены прежде Pearl и соавт. В ней исследователи продемонстрировали, что делеция гена синтазы NO у мышей, а также ингибирование этого фермента приводили к накоплению активированных Т-лимфоцитов (CD69+) в очаге инфекции (Pearl J. Е., 2012). В настоящей работе выявлены клетки-продуценты оксида NOклетки-супрессоры, подавляющие ответ Т-лимфоцитов при ТБ инфекции.

Обращает на себя внимание тот факт, что в нашей работе супрессорной активностью обладала популяция Gr-ldim, выделенная из КМ здоровых мышей, в то время как клетки цельного неразделённого КМ такой способностью не обладали. Содержание клеток Gr-ldim в КМ здоровых мышей низкое (6%), в лёгких и селезёнке здоровых мышей они практически отсутствуют. Можно предположить, что отсутствие супрессорной активности у клеток здорового КМ объясняется низким содержанием клеток Gr-ldim, а появление супрессорной активности у клеток КМ инфицированных мышей — увеличением содержания популяции Gr-ldrm. На вопрос о том, присутствуют ли МС в здоровом организме, различные группы исследователей дают различный ответ. Исследования на эту тему, в основном, посвящены сравнению супрессорной активности клеток Gr-1+ CDllb+ у мышей в норме и при патологии. Сложность интерпретации результатов таких работ состоит в том, что фенотип Gr-1+ CDllb+ могут иметь и МС, и зрелые нейтрофилы. Поэтому, при анализе не всегда очевидно, являются ли у здоровых мышей клетки с фенотипом Gr-1+ CDllb+ типичными нейтрофилами или же представляют собой клетки МС. Проверить это можно, оценивая супрессорную активность исследуемых клеточных популяций. Yamamoto и соавт. изучали влияние популяций селезёнки Gr-lint и Gr-lhl здоровых мышей на внутриклеточное содержание IFN-y в активированных Т-клетках. Авторы обнаружили, что эти популяции не обладали супрессорной активностью (Yamamoto Y., 2008). Gabrilovich и соавт., исходя из экспериментальных данных, сообщили о том, что в крови здоровых мышей встречаются незрелые миелоидные клетки, однако для приобретения супрессорной активности они должны пройти активацию провоспалительными и другими факторами (Gabrilovich D. I., 2009; Kusmartsev S., 2002). Два других исследования говорят о том, что клетки МС (с фенотипом Gr-lml CDllbhl и Gr-lhl CDllbint) встречаются у здоровых мышей в небольшом количестве, они обладают супрессорной активностью и способны подавлять Т-клеточную пролиферацию in vitro (Greifenberg V., 2009; Ribechini E., 2009). Результаты нашей работы согласуются с результатами двух последних исследований, подтверждая наличие в здоровом организме небольшого количества МС.

4.4 Факторы, индуцирующие накопление МС.

Одним из характерных факторов, сопутствующих появлению клеток МС, является сильная воспалительная реакция. Как обсуждалось ранее, туберкулёз — заболевание, характеризующееся сильной воспалительной реакцией. Ранее проведённые исследования в ФГБУ ЦНИИ Туберкулёза РАМН показали, что прогрессирование ТБ инфекции у мышей коррелировало с высоким уровнем экспрессии провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-6 и др.) (Lyadova I. V., 2010). Можно предположить, что воспалительные цитокины индуцируют накопление клеток Gr-ldim. Данное предположение полностью согласуется с результатами исследований, полученными на других экспериментальных моделях. Показано, что при раке и других патологиях в образовании и модулировании свойств МС ключевую роль играют провоспалительные цитокины (IL-ip, IL-6) и медиаторы (белки S100A8/9, компонент комплемента С5а, простагландин PGE2 и другие) (Cuenca A. G., 2011; Ostrand-Rosenberg S., 2009).

Интенсивность воспалительного ответа определяет тип субпопуляции МС. Так, Bunt и соавт. показали, что IL-ip усиливал супрессорную активность МС у мышей (Bunt S. К., 2006). Cuenca и соавт. показали, что усиление воспалительной реакции при патологии сопровождается уменьшением количества гранулоцитарных клеток и увеличением количества клеток с морфологией ядра незрелых и/или «моноцитарных» клеток (Cuenca А. G., 2011). Последнее наблюдение соответствует результатам настоящей работы: при прогрессировании инфекции происходило уменьшение содержания типичных гранулоцитарных клеток Gr-lhl, изменение их поверхностного фенотипа на менее зрелый (сниженный уровень экспрессии маркёров Ly-6G и Gr-1, повышенный уровень экспрессии маркёра CD49d) и накопление «моноцитарных"/незрелых миелоидных клеток Gr-ldim.

На сегодняшний день остаётся неясным, представляют ли собой клетки МС промежуточные незрелые клеточные формы, принадлежащие одному общему пути миелопоэза, или же образуются по «ответвлению» от основного пути и являются самостоятельными клеточными формами, отличными от типичных клеток гранулоцитарного и моноцитарного ряда. Несколько исследований указывает на то, что выделенные клетки МС способны дифференцироваться в соответствующие зрелые клетки (нейтрофилы, макрофаги и/или дендритные клетки) при культивировании in vitro, например, под воздействием транс-ретиноевой кислоты (Kusmartsev S., 2003). Можно предположить, что такую способность они приобретают благодаря выходу из условий патологии и удалению провоспалительного микроокружения. Морфологически и фенотипически МС напоминают незрелые клетки, находящиеся на промежуточной стадии дифференцировки и образующиеся в процессе «экстренного» гемопоэза. Однако, сами по себе незрелые миелопоэтические клетки неспособны к иммуносупрессии. Так Solito и соавт. недавно показали, что клетки МС в крови пациентов с раком груди или толстой и прямой кишки морфологически аналогичны промиелоцитам костного мозга. Однако в отличие от нормальных промиелоцитов, эти клетки могли супрессировать Т-клеточный иммунный ответ (Solito S., 2011). Gabrilovich и соавт. выдвинули предположение, что существует определённый порог интенсивности воспалительной реакции. При превышении этого порогового значения происходит «активация», в результате которой образуются иммуносупрессирующие миелоидные клетки. Кроме того, «чрезмерное» воспаление блокирует дифференцировку этих клеток (Gabrilovich D. I., 2009). С другой стороны, данные, свидетельствующие о наличии в здоровом организме небольшого количества активных миелоидных клеток с иммуносупрессирующей способностью, могут означать, что клетки МС — самостоятельная клеточная популяция, присутствующая и функционирующая в здоровом организме, возрастающая в количестве в ответ на инфицирование М. tuberculosis.

4.5 Роль МС при ТБ инфекции.

В научных работах, посвящённых изучению роли клеток МС при различных патологических состояниях (главным образом — при канцерогенезе) показано, что накопление клеток МС сопутствует развитию патологии (Bunt S. К., 2006; Bunt S. К., 2007), а их элиминация при помощи специфических антител (у мышей — антител анти-Gr-l) или химических агентов, блокирующих их образование (ингибиторов сигнальных путей факторов роста SCF, VEGF (Kusmartsev S., 2008; Pan Р. Y., 2008)) или супрессорные механизмы (ингибирование факторов индуцирующих активность аргиназы I, продукцию АФК (Serafini Р., 2006; Sinha Р., 2007; Talmadge J. Е., 2007; Zea А. Н., 2005)) улучшает исход патологии. С другой стороны, в последнее время появляются данные о том, что МС могут оказывать положительное влияние при патологии, в особенности, при заболеваниях, характеризующихся сильной воспалительной реакцией: например, при травмах и сепсисе. Элиминация клеток МС в данных работах приводила к ухудшению исхода патологии.

Так, на модели полимикробного сепсиса Delano et al. показали, что накапливающиеся клетки с фенотипом Gr-1+ CDllb+ супрессируют Т-клеточный ответ и поляризуют его в направлении типа иммунного ответа Th2, нейтрализация этих клеток антителами анти-Gr-l приводила к отмене этих эффектов. На основании полученных данных был сделан вывод о иммунносупрессорной и, следовательно, патологической активности клеток с фенотипом Gr-1+ CDllb+ (Delano М. J., 2007). Однако, в дальнейшем, изучая эффекты нейтрализации этих клеток (нейтрализующими антителами, гемцитабином и другими препаратами) авторы обнаружили, что их элиминация не улучшала исхода патологии, а, напротив, значительно понижала выживаемость экспериментальных животных. Авторы отмечают, что такой эффект мог быть вызван побочным влиянием нейтрализующих препаратов, но также и усилением воспалительного ответа в отсутствие клеток МС (Cuenca A. G., 2011). В другой работе Sander et al. показали, что в модели полимикробного сепсиса образование МС опосредовано внутриклеточными сигнальными путями, запускаемыми через трансмембранную рецепторную белковую субъединицу gpl30. Однако, исследователи обнаружили, что при экспериментальном полимикробном сепсисе, несмотря на эффективный «киллинг» бактерий, смертность мышей с генотипом gpl30/~ примерно в 3 раза превышала смертность мышей с нормальным генотипом. При этом, уровень продукции провоспалительных цитокинов IL-6, TNF-a, а также IFN-y был значительно выше у мышей с генотипом gpl30/~. Нейтрализация клеток Gr-1+ CDllb+ с использованием антител анти-Gr-l у мышей с генотипом gpl30+/+ приводила к повышению смертности в группе до уровня мышей с генотипом gpl30-/~. А вот адоптивный перенос клеток Gr-1+ CDllb+ от контрольных мышей (с генотипом gpl30+/+) мышам с дефектом в гене gpl30 (gpl30-/~) понижало показатели смертности последних до уровня контроля. В соответствие с этим, исследователи наблюдали понижение уровня продукции цитокинов IL-6, TNF-a и IFN-y в крови мышей, которым были перенесены клетки с фенотипом Gr-1+ CDllb+. На основании полученных результатов исследователи заключили, что при полимикробном сепсисе клетки МС осуществляют защитные антивоспалительные функции в организме хозяина (Sander L. Е., 2010).

Неоднозначная роль клеток МС при различных патологиях указывает на их общую биологическую роль — регуляция иммунного ответа, осуществление которой может по разному влиять на исход заболевания в разных случаях.

Роль МС при ТБ до настоящего времени не изучалась. Известно, что ТБ является иммунопатологическим заболеванием, при котором серьёзный вред организму хозяина может нанести неконтролируемая воспалительная реакция (Bloom В. R., 1994; Lyadova I. V., 2012; Sasindran S. J., 2011). Кроме того, установлено, что при тяжёлых формах ТБ имеет место подавление Т-клеточного ответа (уменьшение количества Т-клеток и их функциональной активности) (Beck J. S., 1985; Bold Т. D., 2011; Pilheu J. A., 1997; Turett G. S., 1994). Стоит отметить, что сильный воспалительный ответ и подавление ответа Т-клеток наблюдаются, как правило, одновременно при тяжёлых формах ТБ. Взаимосвязь между двумя этими процессами на сегодняшний день плохо изучена. Полученные результаты в настоящем исследовании предлагают механизм этой взаимосвязи.

В данной работе нами было обнаружено, что адоптивный перенос клеток Ог-1с|1П1 инфицированным мышам приводил к подавлению продукции ИФН-у в лёгочной ткани, кроме того, при этом была выявлена тенденция к более быстрому прогрессированию ТБ инфекции. Можно заключить, что подавление Т-клеточного ответа негативно влияло на исход инфицирования.

Полученные результаты позволяют предложить следующую схему прогрессирования ТБ инфекции у мышей (см. Рис. 17). Высокая реактивность макрофагов к антигенам микобактерий приводит к гипертрофированному воспалительному ответу. Провоспалительные цитокины влияют на процессы миелопоэза и индуцируют образование и накопление незрелых миелоидных клеток Сг-1(11т, обладающих супрессорной активностью. Эти клетки мигрируют в очаг туберкулёзной инфекции и подавляют Т-клеточный ответ, что ослабляет иммунный ответ организма-хозяина и способствует дальнейшему прогрессированию инфекции по принципу положительной обратной связи.

Описанное в настоящей работе накопление клеток МС при ТБ инфекции и их роль в супрессии протективного противотуберкулёзного Т-клеточного ответа представляет собой дополнительный механизм прогрессирования инфекции. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейших исследований роли клеток МС в прогрессировании ТБ, а также для разработки новых методов мониторинга и терапии этого заболевания.

Реактивность Сильный макрофагов воспалительный ответ ^.

Провоспалительн. цитокины.

Рост (11−1ридр.).

М. tuberculosis 6 /.

Образование Супрессия ,. MDSC.

Т-клеток (клеток Gr-1dlm).

Рисунок 17. Предполагаемая схема прогрессирования ТБ инфекции и роль клеток МС в этом процессе.