Оценка эффективности пероральных холерных вакцин в RITARD модели на этапе доклинических испытаний

Актуальность проблемы. Необходимость создания более современных и надежных национальных средств и методов профилактики особо опасных инфекционных заболеваний обусловлена реально существующей вероятностью их завоза из стран ближнего и дальнего зарубежья, угрозой применения биологических агентов в террористических актах, возникновения стихийных бедствий и катастроф, способных привести к эпидемическим осложнениям чрезвычайного характера. На основании оценки эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ и России прогноз по этой инфекции на ближайший период остается неблагоприятным [Москвитина Э.А. и др., 2005; Онищенко Г. Г., 2002, 2004; Онищенко Г. Г. и др., 2005].

Официальная стратегия ВОЗ предполагает использование холерных вакцин в качестве дополнительных мер предотвращения возникновения эпидемий холеры вне эндемичных территорий и рекомендует их применение для вакцинации контингента с повышенным риском заражения (население лагерей беженцев, лиц без определенного места жительства и т. д.), а также путешественников и туристов [International Travel and Health, WHO, 2000; Weekly Epidemiological Record, 2001]. Вакцинация против холеры при определенных ситуациях включена в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям (Приказ Минздрава России от 27.07.2001 № 229).

С внедрением в практику современных биотехнологий появилась возможность конструирования холерных вакцин нового поколения перорального применения, для оценки иммунологической эффективности и безопасности которых на этапе доклинических испытаний требуется адекватная биологическая модель.

Наиболее подходящей моделью холерной инфекции с диареей, по своей интенсивности и продолжительности близкой к развивающейся в организме человека, является метод заражения взрослых кроликов RITARD (removable intestinal tie adult rabbit diarrhea). Данный метод основан на внутрикишечном заражении вирулентными штаммами V., cholerae Ol взрослых кроликов с предварительным наложением постоянной лигатуры на слепую кишку и особой скользящей временной лигатуры на подвздошную кишку в области мезоаппендикса на срок, необходимый для адгезии и ранней колонизации тонкого кишечника холерными вибрионами, и последующем мониторинге инфекционного процесса [Spira W.M. et al., 1981].

Взрослые кролики, зараженные методом RITARD, по своей инфекционной чувствительности к вирулентным холерным вибрионам становятся аналогичными кроликам-сосункам в модели холерной инфекции Датта и Хаббу (Dutta N. K, Habbu М.К., 1955]. Использование же взрослых животных со зрелой иммунной системой и окончательно сформированным желудочно-кишечным трактом позволяет наиболее полно оценить как вирулентность испытуемых штаммов холерного вибриона, так и напряженность поствакцииального противохолерного иммунитета, индуцированного пероральными холерными вакцинами нового поколения.

Подавляющее большинство работ с применением модели RITARD посвящено изучению возбудителей, вызывающих заболевания с диарейным синдромом, таких как Campylobacter jejuni [Pang Т. et al., 1987; Burr D.H. et al., 1988; Logan S.M. et al., 1989; Pavlovskis O.R. et al., 1991; Guerry P. et al., 1994], E. coli [Ahren C.M. et al., 1985; Lopez-Vidal Y. et al., 1987; Sack R.B. et al., 1988; Svennerholm A.-M. et al., 1988, 1990, 1992; Greenberg R.N. et al., 1991; Mynott T.L. et al., 1991; Tickoo S.K. et al., 1992; Elliott S.J. et al., 1998], Aeromonas [Pazzaglia G. et al., 1990; Kirov S.M. et al., 2000], Providencia alcalifaciens [Mathan M. et al., 1993], Enterobacteriaceae [Penny M.E., 1992], Hafnia alvei [Albert M.J. et al., 1991], Plesiomonas shigelloides [Herrington D.A. et al., 1987].

В отечественной и зарубежной литературе имеются лишь единичные сообщения о применении модели RITARD для оценки действия вирулентных штаммов холерного вибриона на макроорганизм [Глянько Е.В., Король В. В., 1994; Бугоркова С. А. и др., 2000; Spira W. et al., 1982; Richardson К. et al., 1991; Russel R.G. et al., 1992], исследования протективных свойств рекомбинантных штаммов V. cholerae OI [Lycke N. et al, 1986; Tocunaga E. et al., 1984; Pierce N. et al., 1988]. Отсутствуют сведения о проведении сравнительного анализа мониторинга инфекционного процесса и состояния иммунной системы в условиях моделирования холерной инфекции методом RITARD на фоне иммунизации.

Одним из показателей, характеризующих изменения, происходящие в иммунной системе организма при воздействии инфекционного агента, является соотношение количества иммупокомпетентных клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, включая программируемую гибель клеток (апоптоз). Индукция гибели клеток бактериальными патогенами может приводить к нарушению баланса между процессами пролиферации и апоптоза, развитию вторичных иммунодефицитных состояний и инфекционных осложнений [Зигангирова H.A., Гиицбург А. Л., 2004].

Современным высокотехнологичным методом, позволяющим выявлять клетки на всех стадиях клеточного цикла, является метод проточной цитофлюориметрии, применяющийся в мировой практике как для научных исследований, так и в клинической лабораторной диагностике [Telford W. et al., 1994; Carulli G., 1996; AlvarezBarrientos A. et al., 2000].

В настоящее время в доступной нам отечественной и зарубежной литературе отсутствуют сведения об унификации и детализации технологии моделирования холерной инфекции методом RITARD и информативности этой модели в схеме оценки иммунологической эффективности пероральных живых и неживых холерных вакцин нового поколения, а также для мониторинга инфекционного процесса, вызываемого эпидемически значимыми штаммами холерного вибриона Ol и 0139 серогрупп с использованием современных автоматизированных (проточно-цитофлуориметрических) методов цитологического анализа.

Кроме того, в соответствии с методическими указаниями «Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона» (1995), на стадии доклинических испытаний штамма — кандидата в живую холерную вакцину, необходима титрация LD50 заражающего высоковирулентного токсигенного штамма V. cholerae Ol методом RITARD на больших группах контрольных и вакцинированных взрослых кроликов с применением восьми заражающих доз, что требует значительных экономических и временных затрат, повышает трудоемкость данного этапа доклинических испытаний. За рубежом используют одну стандартную большую заражающую дозу вирулентных штаммов холерных вибрионов и других возбудителей диарейных инфекций (10 000 ЛД50 или 109-Юи КОЕ в 1 мл) [Cray W.C. et al., 1983; Russel R.G. et al., 1992; Elliott S. J. et al., 1998]. С учетом этих сведений и с целью снижения экономических затрат на этапе доклинических испытаний необходимо провести оптимизацию заражающих доз и количества биомодельных животных.

На основании вышеизложенного изучение информативности и адекватности оценки эффективности пероральных холерных вакцин нового поколения в RITARD модели на этапе доклинических испытаний является актуальным и имеет большое научно-практическое значение.

Цель исследования. — Оценка эффективности пероральных холерных вакцин нового поколения в RITARD модели на этапе доклинических испытаний.

Основные задачи исследования.

1) Разработать в соответствии с требованиями биологической безопасности унифицированную технологию моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели, обеспечивающую высокую воспроизводимость и информативность.

2) Изучить в RITARD модели патогенные свойства штаммов V. cholerae el tor Ogawa P-3122, V. cholerae eltor Ogawa M-698, V. cholerae eltor Inaba M-899, V. cholerae 0139 P-16 064 по их способности индуцировать развитие диарсйного синдрома и гибель биомодели, колонизировать кишечник взрослых кроликов. Изучить влияние сезонности па воспроизводимость холерной инфекции в RITARD модели.

3) Оценить в RITARD модели эффективность ряда вакцинирующих против холеры препаратов (как конструируемых, так и коммерческих): авирулентного рекомбинантного штамма V. cholerae eltor KM-184, продуцирующего протективные антигены (В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA1) — препарата «теней» клеток V. cholerae 01 eltor — (VCG/01) с пилями адгезии — (TCP) — препарата VCG/01 без TCPпрепарата «теней» клеток V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCPпрепарата VCG/0139 без TCPтаблетированной бивалентной холерной химической вакцины производства РосНИПЧИ «Микробхолерной вакцины Cholera-Impstoff (Институт сывороток, Швейцария);

4) Провести цитофлюориметрический мониторинг баланса пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток в динамике холерной инфекции на модели RITARD у ингактных и вакцинированных против холеры биомодельных животных.

Научная новизна. Впервые с применением разработанной унифицированной технологии моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели проведено сравнительное изучение эффективности ряда как имеющихся, так и вновь конструируемых пероральных холерных вакцин нового поколения: таблетированной бивалентной холерной химической вакциныхолерной вакцины Cholera-Impstoffпрепаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP и без нихавирулентного рекомбинантного штамма V. cholerae eltor KM-184.

Показана высокая информативность, адекватность и перспективность использования модели R1TARD в схеме оценки эффективности пероральных живых и неживых холерных вакцин нового поколения па этапе доклинических испытаний. Установлено отсутствие влияния сезонности на воспроизводимость и течение холерного инфекционного процесса в RITARD модели. Показана целесообразность применения четырех заражающих доз вместо восьми, рекомендованных ранее ["Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона", 1995], что значительно сокращает временные и материальные затраты при проведении доклинических испытаний.

Впервые в результате проведенного цитофлуориметрического мониторинга апоптоза и пролиферативной активности иммунекомпетентных клеток определены параметры данных показателей в зависимости от исхода холерного инфекционного процесса в вакцинированном и невакцинированпом организме. Обнаружено, что увеличение в крови инфицированных V. cholerae животных относительного количества апоптозных клеток свыше 40% является неблагоприятным прогностическим признаком.

Установлена возможность использования показателей изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации для оценки степени повреждающего действия вакцин на организм.

Впервые с использованием модели RITARD и больших заражающих доз (2×109 КОЕ) вирулентного штамма V. cholerae eltor Ogawa PS 122 (cixA+, tep A+, tox R+) показано, что отечественная коммерческая холерная бивалентная таблетированная вакцина при иммунизации per os защищает 100% взятых в опыт животных при отсутствии развития у них диарейного синдрома и колонизации кишечника V. cholerae, способствует формированию устойчивости клеток костного мозга, селезенки к развитию индуцированного возбудителем холеры апоптоза, в отличие от вакцины Cholera-Impstoff (защита 33,3% животных).

Практическая значимость. Результаты исследований были использованы при проведении Государственных доклинических испытаний штамма V. cholerae eltor KM 184 — кандидата в живые вакцины против холеры и включены в МУ 3.3.1.

Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона", которые рекомендованы комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека к утверждению (Протокол № 3 от 06.10.05r).

По материалам работы составлено пособие для врачей, научных работников «Моделирование холерной инфекции методом RITARD», которое утверждено директором РосНИПЧИ «Микроб» 01.02.02 г. и используется в практической деятельности лаборатории иммунологии с сектором патоморфологии, лаборатории патогенных вибрионов РосНИПЧИ «Микроб», лаборатории препаратов против чумы и особо опасных инфекций ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Получено положительное решение по заявке № 2 002 118 939/20 о выдаче свидетельства РФ на полезную модель «Устройство для регулируемой подачи жидких препаратов для ингаляционного наркоза лабораторным животным».

Материалы исследований используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Штаммы V. cholerae eltor Ogawa Р-3122, V. cholerae eltor Ogawa M-698, V. cholerae 0139 P-16 064, имеющие основные структурные гены вирулентности tcpA, ctxA и гены-регуляторы toxR и toxT, в дозе 2×109 м.к. вызывают у 100% взрослых кроликов развитие холерной инфекции в RITARD модели.

2. Унифицированная технология моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели обеспечивает её- высокую воспроизводимость и информативность. Сезонность не влияет на воспроизводимость и течение холерного инфекционного процесса в RITARD модели.

3. Показана высокая информативность, адекватность и перспективность использования модели RITARD в схеме оценки эффективности пероральных живых и неживых холерных вакцин нового поколения на этапе доклинических испытаний.

4. Установлено, что увеличение в крови инфицированных V. cholerae животных относительного количества апоптозных клеток свыше 40% является неблагоприятным прогностическим признаком. Показатели изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпегентных клеток отражают уровень защитного действия холерных вакцин от развития при холерной инфекции индуцированного апоптоза.

Апробация работы.

Исследования проведены в рамках плановых НИР: 025−99 «Изучение иммунобиологических свойств потенциально вакцинных рекомбинаптных штаммов холерного вибриона, несущих гетерологические антигены» № госрегистрации 01.99.8 392- 006−3-01 «Разработка и усовершенствование унифицированных метод оценки безопасности вакцинирующих иммунобиологических препаратов против особо опасных инфекций» № госрегистрации 01.200.111 501- 21−4-4 «Патоморфологические аспекты изучения нейроэндокринных механизмов в становлении противохолерного иммунитета» № госрегистрации 0120.504 666- МНТП «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего», НИОКР «Разработка, испытания рекомбинантной живой холерной вакцины и её- совершенствование» 1998;2000; Исследование иммуногенных и протективных свойств препаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor с пилями адгезии (VGG/01 с TCP) и VGG/01 без TCP, VGG/139 с TCP и VGG/139 без TCP, убитой холерной вакцины (Швейцария) по Договору РосНИПЧИ «Микроб» с Институтом микробиологии и генетики, Университета Вены, Австрия (1999;2000) — ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002;2006 годы, Блок I «Ориентированные фундаментальные исследования», раздел «Технологии живых систем», подраздел «Защита от патогенов», НИР «Изучение роли биомолекул возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чумы и холеры) в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток», являющейся составной частью НИОКР «Изучение роли биомолекул возбудителей опасных инфекционных заболеваний в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток» (ОФИ-6).

Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на: Ш-ем съезде иммунологов и аллергологов СНГ, 17−21 сентября 2000 г., Сочи, ДагомысМеждународном симпозиуме «New Approaches in Molecular Biotechnology for Biomedicine» (NAMBB 2001), 24−27 мая 2001, Вена, АвстрияМеждународной конференции «Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine IV», 1−4 октября 2002, СаратовVI Всероссийской научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002», 20−23 мая 2002, Санкт-ПетербургВсемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии 2−6 декабря, 2002, СингапурVIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», 4−5 июня 2003, Ростов-на-ДонуПроблемной комиссии 50.04. «Холера и патогенные для человека вибрионы» Научного совета rio санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (50.00). 2001 — 2005 г.г.;

— Научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» 2001;2004 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях — 3, в зарубежной печати — 2.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 99 отечественных и 225 зарубежных источников. Объем диссертации составляет 165 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 22 таблицами.

Выводы.

1. Штаммы V. cholerae eltor Ogawa Р-3122, М-698, V. cholerae eltor Inaba M-899, V. cholerae 0139 P-16 064, имеющие основные структурные гены вирулентности tcpA, ctxA и гены-регуляторы toxR и toxT, патогенны для взрослых кроликов в RITARD модели (вызывают гибель в период до 30 часов с момента заражения, индуцируют развитие диареи, колонизируют кишечник). Значения заражающих доз вирулентных штаммов V. cholerae, которые вызывают холерную инфекцию в RITARD модели у 100% о II взрослых кроликов, составляют от 2×10 м.к. до 2×10 м.к.

2. Унифицированная технология моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели обеспечивает её- высокую воспроизводимость и информативность. Сезонность не влияет на воспроизводимость и течение холерного инфекционного процесса в RITARD модели, что позволяет рекомендовать применение модели RITARD в течение всего календарного года.

3. Выявленные различия в развитии и течении холерного инфекционного процесса при RITARD моделировании у контрольных (получивших плацебо) и иммунизированных конструируемыми пероральными холерными вакцинами нового поколения (рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor KM-184- препаратами «теней» клеток V. cholerae 01 eltor с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139 с TCP и без них), коммерческими холерными вакцинами (таблетированной бивалентной холерной химической вакцины, холерной вакцины Cholera-Impstoff) позволяют дать объективную оценку протективной эффективности вакцинирующих против холеры препаратов.

4. Для определения в RITARD модели LD50 вирулентных штаммов V. cholerae 01 и 0139 серогрупп у контрольных, получивших плацебо, и иммунизированных холерными вакцинами нового поколения животных.

6 8 10 1 ^ предложено использование четырех заражающих доз (10, 10, 10, 10″ м.к.) вместо применяемых восьми, что значительно сокращает временные и материальные затраты при проведении доклинических испытаний.

5. В результате проточноцитофлуориметрического мониторинга апоптоза и пролиферативной активности иммунокомпетенгных клеток в RITARD модели установлено, что увеличение в крови инфицированных V. cholerae животных относительного количества апоптозных клеток свыше 40% является неблагоприятным прогностическим признаком. Показатели изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток отражают уровень защитного действия холерных вакцин от развития при холерной инфекции индуцированного апоптоза.

6. Однократная внутрижелудочная иммунизация кроликов одной человеко-дозой коммерческой бивалентной таблетированной холерной вакциной в условиях заражения 2×109 м.к. V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 (ctxA+, tcp A+, tox R+) методом RITARD защищает 100% биомодельных животных от гибели при отсутствии развития у них диарейного синдрома и колонизации кишечника V. cholerae, способствует формированию устойчивости клеток костного мозга, селезенки к развитию индуцированного возбудителем холеры апоптоза, в отличие от убитой коммерческой вакцины Cholera-Impstoff (защита 33,3% животных).

7. Внутрижелудочная иммунизация кроликов рекомбинантным штаммом V. сИо1егае еНог ЬгаЬа КМ-184, коммерческой бивалентной таблетированной холерной вакциной по изучаемым показателям (количество Ти В-лимфоцитов, уровень пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток, поликлональная стимуляция В-лимфоцитов, иммунореактивность на гетерологичный антиген) не вызывает формирование вторичного иммунодефицитного состояния, индуцирует развитие положительной сероконверсии и напряженного противохолерного иммунитета, определяемого в ЫТАЯБ модели.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В связи с сохраняющейся в мире сложной эпидемической ситуацией по холере специфическая профилактика данной инфекции продолжает оставаться актуальной, а создание пероральных холерных вакцин нового поколения на основе новых биотехнологий против эпидемически значимых штаммов V. cholerae, в том числе 0139 серогруппы, совершенствование оценки их эффективности имеет важное научно-практическое значение [International Travel and Health, WHO, 2000; Weekly Epidemiological Record, 2001; Кутырев B.B., Куличенко A.H., 2004].

Одной из основных качественных характеристик медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), предназначенных для специфической профилактики, является их специфическая активность. Получение объективной информации о специфической активности МИБП возможно лишь при наличии достаточно информативных лабораторных методов оценки этого показателя, позволяющих получить данные, коррелирующие с результатами применения их у людей.

Программа испытаний новых вакцин включает доклиническое изучение препарата на лабораторных животных и исследование на ограниченной и расширенной группах людей на основе существующих нормативных документов: СП 3.3.2.561−96 «Государственные испытания регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов" — «Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. РД 42−28−10−90" — «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения. РД 42−28−8-89» и других.

Информация о специфической активности новых препаратов, получаемая в опытах на лабораторных животных, является достаточно надежной и достоверной. При выборе вида лабораторных животных и методов их заражения необходимо стремится к тому, чтобы степень восприимчивости животных к инфекционному агенту и патогенез инфекционного процесса были максимально близки к таковым у человека [Медуницын Н.В., 2004]. В этой связи, для оценки иммунологической эффективности холерных вакцин нового поколения на этапе доклинических испытаний требуется адекватная биологическая модель [Щуковская Т.Н. и др., 2003].

Как известно, холера является антропонозной инфекцией, вызываемой эпидемически значимыми штаммами V. cholerae Ol и 0139 серогрупп. Вследствие этого экспериментальное моделирование холерной инфекции представляет определенную сложность. Все биомодели, применяемые в настоящее время с целью изучения вирулентности штаммов V. cholerae, механизмов патогенеза холеры, подразделяют на новорожденных и взрослых животных различных видов. При изучении патогенных свойств V. cholerae для моделирования холерной инфекции на новорожденных животных используют кроликов-сосунков массой 10−12 г [Dutta N.K., Habbu М.К., 1955], мышей в возрасте 5−7 дней [Bougoudogo F. et al., 1995; Crean T.I. et al., 2000; Faruque S.M. et al., 2003], «опечатанных» 5- дневных мышей [Angelichio M.J. et al., 1999], 4−9 дневных гнотобиотических мини-поросят [Назарова JT.C. и др., 1986], 15−20 дневных поросят [Платонов А.И. с соавт, 1978]. Способность к развитию холерного инфекционного процесса у новорожденных животных связана с отсутствием сформировавшейся микрофлоры кишечника, функциональной и морфологической незрелостью слизистой тонкого кишечника. Иммунная система у новорожденных биомоделей также является функционально неполноценной, что делает непригодным их применение для оценки эффективности холерных вакцин.

Моделирование холерного инфекционного процесса на взрослых животных с развитой иммунной системой и полноценно функционирующим желудочно-кишечным трактом позволяет оценить формирование постинфекционной резистентности при заражении вирулентными и сконструированными штаммами V. cholerae [Бугоркова С.А. с соавт., 2000; Lycke N. et al., 1986; Pierce N.F. et al., 1988; TokunagaE. et al., 1984].

Многие исследователи для изучения колонизации и факторов вирулентности V. cholerae используют модель лигированных петель кишечника взрослых кроликов, модель взрослых «опечатанных» мышей [Richardson К., 1991; Ryan Е.Т. et al., 1999; Faruque S.M. et al., 2003; Liang W. et al., 2003].

Наиболее подходящей моделью холерной инфекции с диареей, по своей интенсивности и продолжительности близкой к развивающейся в организме человека, является RITARD (removable intestinal tie adult rabbit diarrhea) метод заражения взрослых кроликов [Spira W.M. et al., 1981]. Взрослые кролики, зараженные методом R1TARD, по своей инфекционной чувствительности к вирулентным холерным вибрионам становятся аналогичными кроликам-сосункам в модели холерной инфекции Датта и Хаббу [БиНа Ы. К, НаЬЬи М.К., 1955]. Использование взрослых животных со зрелой иммунной системой и окончательно сформированным желудочно-кишечным трактом позволяет наиболее полно оценить как вирулентность испытуемых штаммов холерного вибриона, так и напряженность поствакцинального противохолерного иммунитета, индуцированного пероральными холерными вакцинами нового поколения, изучить возможность развития и особенности течения инфекционного процесса в иммунном организме.

В настоящее время нет сведений об информативности и адекватности применения ЮТА1Ш модели в схеме оценки иммунологической эффективности пероральных холерных вакцин нового поколения. Отсутствуют данные об унификации и детализации технологии моделирования холерной инфекции методом ЮТАИГ), а также мониторинге инфекционного процесса, вызываемого эпидемически значимыми штаммами холерного вибриона с использованием современных автоматизированных (проточно-цитофлуориметрических) методов цитологического анализа.

Цель настоящей работы состояла в оценке эффективности живых и неживых пероральных холерных вакцин нового поколения в И1ТА1Ш модели на этапе доклинических испытаний.

Одним из условий качественной оценки эффективности вакцин в условиях моделирования инфекционного процесса на лабораторных животных является высокая воспроизводимость и информативность используемой биомодели, обеспечиваемая в первую очередь стандартной технологией моделирования, доступной для выполнения большинству исследователей.

Важным этапом в моделировании холерной инфекции методом ШТАШЗ является отбор и подготовка ш таммов V. ско1егае к использованию для заражения.

Нами, в отличие от оригинального метода У. М 8рта с соавторами (1981), который предусматривает заражение 4-х часовой бульонной культурой V. с/го1егае, выращенной при температуре 37±-1°С, и не подходит для одновременного выполнения в течение рабочего дня большого количества операций в блоке для работы с инфицированными животными, обосновано применение в ИТАИГ) модели агаровой культуры холерных вибрионов, полученной при культивирования иа щелочном агаре рН 8,0 при температуре 37±-0,5°С в течение 16±0,5 часов, для внутрикишечного заражения кроликов.

Принимая во внимание, что в соответствии с Фармакопейной статьей предприятия ФСГ1 42 0020−0020−00 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетировапную и Регламентом производства № 479−94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированпую штамм V. ско1егае 01 еНог Ogawa Р-3122 используется при определении иммуногенной активности в тесте активной защиты белых беспородных мышей, нами впервые в условиях моделирования и мониторинга холерной инфекции в ШТА1Ю модели охарактеризованы штаммы V. с1го1егае еНог Ogawa Р-3122, а также V. ско1егае 0139 Р-16 064, имеющие основные структурные гены вирулентности (срА, с1хА и ген-регуляторы 1охЯ и (охТ, по их способности индуцировать развитие диарейпого синдрома и гибель биомодели, колонизировать кишечник взрослых кроликов.

Установлено, что гибель кроликов при заражении V: ско1егае еког Ogawa Р-3122 в дозе п х 109 м.к., п х 10 м м.к., V. с1го1егае 0139 Р-16 064 в дозе п х 109 м.к. методом ШТАШЭ наступает в пределах 30 часов. Объем суммарного количества жидкого содержимого тонкого и толстого кишечника достигает 300−400 мл у зараженных V. с/го1егае еНог Ogawa Р-3122, V. с! ю1егае 0139 Р-16 064 биомодельных кроликов, что свидетельствует о высокой вирулентности и диареегенности данных штаммов в ЫТАК1) модели. Определено значительное количество жизнеспособных о холерных вибрионов, прикрепившихся к стенке тонкого кишечника (п х 10° КОЕ/г ткани кишечника).

Проведенный нами мониторинг длительности выделения из ректального материала холерных вибрионов инфицированными кроликами показал, что продолжительность выделения холерных вибрионов в ЮТАИХ) модели свидетельствует о колонизации кишечника кроликов V. ско1егае и согласуется с исследованиями Б. М. Бающие с соавторами [2003].

Важным результатом работы является оптимизация заражающих доз V. ско1егае. Показана целесообразность применения для определения ЬЛ^о вирулентных штаммов V. скокгае четырех заражающих доз вместо восьми (104 — 10й м.к.), рекомендованных ранее ["Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона, 1995"], что значительно сокращает временные и материальные затраты при проведении доклинических испытаний. Предложенные дозы V. cholerae Ol и 0139 серогрупп (106, 108, 10ю, 1012 м.к.) для внутрикишечпого заражения взрослых кроликов в RIT ARD модели включены в новые МУ 3.3.1. «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», которые рекомендованы комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека к утверждению (Протокол № 3 от 06.10.05г).

Нами впервые проведено изучение влияния сезонности на воспроизводимость и течение холерного инфекционного процесса в RITARD модели. Установлено, что время года не влияет на развитие и проявления моделируемой у взрослых кроликов методом RITARD холерной инфекции в условиях заражения V. cholerae eltor Ogawa: Р-3122, V. cholerae 0139 Р-16 064.

Таким образом, показана перспективность применения штаммов V. cholerae eltor Ogawa Р-3122, V. cholerae 0139 Р-16 064 в качестве заражающих при оценке в RITARD модели эффективности пероральных холерных вакцин нового поколения.

Нами также проведена стандартизация и унификация приемов при воспроизведении модели RIT ARD на взрослых кроликах.

Показано, что особенностями работы при моделировании холерной инфекции методом RITARD являются соблюдение требований биологической безопасности при работе с инфекционным материалом в сочетании с требованиями асептики и антисептики, необходимыми для выполнения полостной хирургической операции, определение топографии внутренних органов кролика, основ оперативной хирургии и анестезиологии. >

Разработано анестезиологическое пособие, модернизирован аппарат для дозированной подачи эфира (свидетельство РФ по заявке № 2 002 118 939/20 на полезную модель «Устройство для регулируемой подачи жидких препаратов для ингаляционного наркоза лабораторным животным»). Обезболивание рекомендовано проводить комплексно препаратом рометар (2% раствор в/м из расчета 0,2−0,3 мл/кг) с введением в/к 2−3 мл 1% раствора лидокаина по линии будущего кожного разреза.

В связи с отсутствием в оригинальном описании метода [Spira W.M. et al., 1981] способа наложения легко развязывающегося узла лигатуры нами разработаны: последовательность завязывания нити при наложении временной лигатуры на подвздошную кишку, способ снятия временной лигатуры с подвздошной кишки у зараженных животных в соответствии с требованиями биологической безопасности, способ завершения хирургического вмешательства, облегчающие выполнение метода RITARD и предупреждающие развитие осложнений после его проведения. Преимуществами предложенного подхода являются: отсутствие необходимости повторного наложения швов на кожу и брюшину, минимальная контаминация брюшной полости и щадящее отношение к поверхности кишечника.

При правильном выполнении технологии метода RITARD кролики без какого-либо антигенного или лекарственного воздействия, которым вместо культуры холерных вибрионов внутрикишечно введен 0,9% раствор натрия хлорида, имеют продолжительность жизни свыше 120 ч (5 суток). У них отсутствуют клинические (в том числе диарея) и патоморфологические проявления холерного инфекционного процесса.

Унифицированная технология моделирования холерной инфекции методом RITARD в соответствии с требованиями биологической безопасности при работе с инфекционным материалом включена в пособие для врачей, научных работников «Моделирование холерной инфекции методом RITARD», утвержденное директором РосНИПЧИ «Микроб» 01.02.02 г., и в МУ 3.3.1. «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», которые рекомендованы комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека к утверждению (Протокол № 3 от 06.10.05г).

В соответствии с поставленной целыо, следующим этапом нашей работы было изучение с применением разработанной унифицированной технологией моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели эффективности ряда конструируемых пероральных холерных вакцин нового поколения (рекомбинапгного штамма V. cholerae eltor KM-184, продуцирующего протективные антигены В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA1- препаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP и без них в сравнении с коммерческими (таблетированной бивалентной холерной химической вакциныхолерной вакцины Cholera-Impstoff).

При определении в ШТАМ) модели на этапе доклинических испытаний профилактической эфективности рекомбипантного штамма V. с1ю1егае КМ-184, ЛД50 заражающего штамма V. ско1егае еког О^сша Р-3122 для кроликов, иммунизированных 5×109 м.к. V. ско1егае КМ-184, имела значение 1. x Ю10 м.к., для конрольных- 5,6×109.

Гибель от холерной инфекции в МТАМЭ-модели была зарегистрирована у 21,0±1,0% кроликов, иммунизированных V. сИо1егае КМ-184. У павших животных наблюдались проявления диареи отнезначигельной, до средней степени выраженности, сопровождающейся выделением клеток V. ско1егае еког Ogawa, использованного для заражения в ЮТАКО-модсли. Средняя продолжительность жизни этих кроликов составила 40+5,9 часов при средней продолжительности жизни в группе контрольных (плацебо) биомодельных кроликов 26,2+3,4 часов.

Доля выживших животных, иммунизированных испытуемым штаммом V. с1ю1егае КМ-184 в дозе 5×109 м.к. V. с/го1егае еког О^сша Р-3122, составила 79,5+1,1%.

Среди выживших животных лишь только у 20,0±5,0% кроликов наблюдали: проявления холерного инфекционного процесса, в легкой форме. У этих животных продолжительность экскреции холерных вибрионов, как правило, не превышала в среднем 53±3,4 часов при сроке наблюдения 120 часов.

Индекс иммунитета, обеспечиваемого рекомбинантным штаммом V. с1ю1егае еког 1паЪа КМ 184, имел значение 17,8, что свидетельствовало о формировании антибактериального иммунного ответа у иммунизированных животных [Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона, 1995].

Моделирование холерной инфекции методом ШТАХШ у иммунизированных взрослых кроликов рекомбинантным штаммом V. с! ю1егае еког 1паЬа КМ 184 в дозе 5×109 м.к. проводилось на фоне выраженнной иммунобиологической перестройки, что подтверждено наличием положительной сероконверсии: увеличение титров вибриоцидных антител в сыворотке крови в 2,3−2,6 раза и секретируемых антител в кишечном содержимом.

Показано также, что иммунизация взрослых кроликов авирулентным рекомбинантным штаммом V. с1го1егае еког 1паЬа КМ-184 не индуцировала развитие вторичного иммунодефицитного состояния: отсутствие уменьшения относительного содержания в крови Ти В-лимфоцитовповышение индекса поликлональной стимуляции и иммунного ответа на гетерологичпый антиген по сравнению с контролем, нормализация которых наблюдалась на 28 сутки после вакцинации, что соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам холерных вибрионов [Методические указания «Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона», 1995].

Таким образом, выявленные различия в развитии и течении холерного инфекционного процесса при моделировании RITARD у интактных и иммунизированных рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor Inaba KM 184 экспериментальных животных, позволяют дать объективную оценку протективной эффективности кандидатов в живые вакцины против холеры.

За рубежом разработана технология получения так называемых «теней», то есть пустых клеток грамотрицатсльных бактерий путем контролируемой экспрессии гена Е фага срХ174, кодирующего синтез мембранного протеина Е. Протеин Е формирует в бактериальной клетке трансмембранный туннель, что приводит к последующему выходу всего цигоплазматического содержимого и образованию «теней» (пустых) клеток с полностью сохраненными поверхностными структурами, в том числе пилями адгезии [Lubitz W. et al., 2001; Jelinger W. et al., 2002]. Препараты «теней» клеток V. cholerae рассматриваются в качестве кандидатов в холерные вакцины [Eko F.O. et al., 2002].

В следующей серии экспериментов нами проводился мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов препаратами «теней» клеток V. cholerae (VCG).

С целью снижение экономических затрат скрининг профилактической эффективности большого числа иммунизирующих против холеры препаратов, как усовершенствованных, так и вновь конструируемых, на этапе доклинических испытаний возможно проводить при использовании одной большой заражающей дозы высоковирулентных эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов. Этот подход был нами использован в данной серии экспериментов для заражения в RITARD модели.

Изучение протективных свойств нежизнеспособных препаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139.

VCG/0139) с TCP и без них проводили путем двухкратной иммунизации кроликов перорально с интервалом 2 недели в дозах 4 мг, 20 мг и внутримышечно в дозе 4 мг. Иммунизацию препаратом, состоящим из «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с TCP и «теней» клеток V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP (по 2 мг каждого), а также препаратом, состоящим из «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) без TCP и «теней» клеток V. cholerae 0139 (VCG/0139) без TCP (по 2 мг каждого) проводили двухкратно внутрижелудочно.

Через 2 недели после введения бустерной дозы имунизирующего препарата, кроликов заражали внутрикишечно методом RITARD эпидемически значимыми штаммами V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 и V. cholerae 0139 Р-16 064 в дозе 2×109 м.к., вызывающей выраженную диарею и летальный исход у 100% неиммунных кроликов.

Препараты теней клеток V. cholerae (VCG), примененные для внугрижелудочной иммунизации, защищали большинство биомодсльных взрослых кроликов от впутрикишечного заражения вирулентными штаммами V. cholerae в RITARD модели.

Высокий уровень защиты от холерной инфекции был отмечен при внутрижелудочной иммунизации кроликов в дозе 20 мг препаратом VCG Ole TCP (100% животных при продолжительности жизни свыше 120 ч), препаратами VCG 01 без TCP и VCG 0139 с TCP (60% животных при средней продолжительности жизни 96 ч) по сравнению с зараженными кроликами, получившими в качестве плацебо 0,9% раствор натрия хлорида и имевшими продолжительность жизни менее 30 ч. В опытных группах животных (кроме группы кроликов, иммунизированных смесью препаратов VCG 01 без TCP и VCG 0139 без TCP по 2 мг каждого) не было отмечено значительных проявлений диареи.

Различные препараты VCG (кроме препарата из смеси VCG 01 без TCP и VCG 0139 без TCP) ингибировали колонизацию кишечника вирулентными штаммами V. cholerae, примененными для заражения и предотвращали экскрецию вибрионов в окружающую среду. Отмечали пложительную сероконверсию.

Несмотря на то, что имеются сведения о слабой иммуногенности TCP для человека [Hall R. et al., 1991], было высказано предположение, что включение их в состав вакцины может повысить эффективность вакцинных препаратов [Attridge S. et al., 2000; Herrington D. et al., 1988; Sun D. et al., 1990; Taylor R. et al., 1987].

Полученные нами результаты свидетельствуют о положительном влиянии присутствия TCP в изученных препаратах «теней» клеток холерных вибрионов на их иммунологическую эффективность, которое было наиболее выражено при иммунизации биомодельных кроликов дозой 20 мг.

Таким образом, иммунизация различными препаратами нежизнеспособных препаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP и без них защищала кроликов от гибели после заражения штаммами V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 и V. cholerae 0139 Р-16 064 в RITARD модели, увеличивала продолжительность жизни инфицированных животных, ингибировала процесс колонизации кишечника V. cholerae и предотвращала экскрецию холерных вибрионов, индуцировала развитие положительной ссроконвсрсии.

Нами впервые с использованием модели R1TARD и больших заражающих доз (2×109 КОЕ) вирулентного штамма V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 (ctxA+, tcp A tox R+) показано, что в отличие от вакцины Cholera-Impstoff (Швейцария) отечественная коммерческая холерная бивалентная таблетированная вакцина при иммунизации per os защищает 100% взятых в опыт животных при отсутствии развития у них диарейного синдрома и колонизации кишечника V. cholerae, способствует формированию устойчивости клеток костного мозга, селезенки к развитию индуцированного возбудителем холеры апоптоза.

Впервые в результате проведенного цитофлуориметрического мониторинга апоптоза и пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток определены параметры данных показателей в зависимости от исхода холерного инфекционного процесса в вакцинированном и невакцинированном организме. Обнаружено, что увеличение в крови холерных инфекционных животных относительного количества апоптозных клеток свыше 40% является неблагоприятным прогностическим признаком.

Установлена возможность использования показателей изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации для оценки степени повреждающего действия вакцин на организм.

По результатам морфологического исследования показано, что заражение 2×109 м.к. V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 методом RITARD иммунизированных против холеры животных, не вызывало у них развития клинико-морфологических проявлений болезни, не приводило к формированию грубых гистологических изменений во внутренних органах, что свидетельствовало о достаточной эффективности изучаемых препаратов.

Сочетанное использование иммунологических методов исследования с технологией моделирования холерной инфекции методом RITARD позволяет с большей объективностью оценить формирование специфического иммунитета в организме иммунизированных животных.

Таким образом, в результате выполненных исследований нами показана высокая информативность, адекватность и перспективность использования модели RITARD в схеме оценки эффективности пероральных живых и неживых холерных вакцин нового поколения на этапе доклинических испытаний.