Очистка, характеристика, расщепление оксоглута-ратдегидрогеназного комплекса из надпочечников быка и свойства его периферических ферментов

Окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата является одним из важнейших этапов функционирования цикла Кребса и происходит в месте пересечения нескольких метаболических путей, так как 2-оксоглутарат является общим интермедиатом обмена белков и углеводов. Известно, что оксоглутаратдегидрогеназный комплекс, состоящий из трех ферментов, катализирует сложный процесс превращения 2-оксоглутарата. Оксоглутаратдегидрогена-за, являющаяся первым компонентом комплекса, при участии ТДФ осуществляет окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата, в результате чего образуется сукцинил производное липоевой кислоты, ковалентно связанное с липоатсукцинилтрансферазой, которая катализирует перенос ацила на КоА. Липоамиддегидрогеназа окисляет образовавшуюся дигидролипоевую кислоту при участии ФДД и НДД+ .

Данная многоступенчатая реакция приводит к образованию важных в энергетическом аспекте продуктов — НДЦН и сукцинил-КоА. Ключевая роль комплекса заключается в том, что он катализирует единственную в цикле Кребса реакцию, приводящую к образованию богатой энергией связи на субстратном уровне. К тому же это единственный путь биодеградации 2-оксоглутарата .

Именно такая важная позиция оксоглутаратдегидрогеназного комплекса в обмене веществ предопределяет возрастающий интерес к изучению его структуры, функции и регуляции. К настоящему времени фермент выделен из дрожжей, бактерий, цветной капусты и нескольких тканей животного происхождения. Имеющиеся литературные данные говорят об органоспецифичности ОГДК. Вместе с тем до настоящего времени комплекс из адреналовых желез совершенно не изучался, хотя роль его в обеспечении основной функции коры надпочечников — стероидогенеза вытекает из того, что для данного процесса необходима энергия и внутримитохонд-риальные восстановительные эквиваленты (Lin, Haksar, Peron, 1974) .

В лаборатории биохимии эндокринных желез, где выполнялась настоящая работа, раскрыты некоторые механизмы зависимости функции коры надпочечников от обеспеченности организма тиамином (Островский, Виноградов, 1968), который в фосфори-лированной форме служит кофактором оксоглутаратдегидрогеназ-ного комплекса. Для углубленного изучения роли ОГДК в метаболизме коры надпочечников и обеспечении ее функции ценную информацию даст детальное исследование очищенного комплекса. Это осуществимо только при использовании адреналовых желез крупного животного. Изучение высокоочищенного фермента представит возможность найти особенности ОГДК из надпочечников по сравнению с аналогичными комплексами из других источников, что расширит и углубит знания об этом ферменте вообще. Сделать это тем более необходимо в виду того, что С. А. Струмило, С.Б.Сен-кевич, Э. А. Галицкий и др. (1983) показали важную роль оксо-глутаратдегидрогеназного комплекса в поддержании базального уровня стероидогенеза. Выяснение значения фермента в метаболизме коры надпочечников, возможности раскрытия путей его регуляции явилось целью проведенного исследования. Именно в этом и будет состоять то новое, что внесется проведенной работой в решение актуальной научной задачи современной биохимии. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие основные задачи:

— разработать метод выделения и очистки оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из коры надпочечников до электрофорети-чески гомогенного состояния;

— изучить кинетические параметы оксоглутаратдегидрогеназ-ного комплекса;

— выяснить формальный кинетический механизм реакций ОГДК и его компонентов;

— расщепить комплекс и получить в изолированном виде ок-соглутаратдегидрогеназу и липоамиддегидрогеназу;

— выяснить пути и способы регуляции оксоглутаратдегидро-геназного комплекса из надпочечников .

Научная новизна полученных результатов состоит в том, что впервые: выделен и очищен до гомогенного состояния оксоглута-ратдегидрогеназный комплекс из коры надпочечников быкаизучены его субъединичный состав и ряд общих свойствполучены в изолированном виде оксоглутаратдегидрогеназа и липоамиддегид-рогеназаустановлен формальный механизм реакций комплекса и составляющих его ферментовопределены места и доказана алло-стерическая природа действия эффекторов на комплексвыяснены регуляторные возможности ряда кофакторов и метаболитов в отношении оксоглутаратдегидрогеназного комплекса .

Научно-практическое значение данных заключается в том, что разработан метод очистки, позволяющий получать высокоочи-щенный оксоглутаратдегидрогеназный комплекс из надпочечников, который может быть использован для изучения молекулярных механизмов его функционирования, а также для препаративной наработки ОГДК. Установлена возможность ингибирования комплекса из надпочечников окситиаминдифосфатом и тетрагидротиаминдифос-фатом, что указывает на возможность использования данных анти-коферментов в регуляции метаболизма коры надпочечников .

Новые данные о комплексе, аллостерическом характере его регуляции используются при чтении лекций по биохимии в Гродненском государственном медицинском институте. Высокоочшцен-ный комплекс из надпочечников используется также в научно-исследовательской работе лаборатории коферментов Отдела регуляции обмена веществ АН БССР, лаборатории химии ферментов Института биохимии АН Литовской ССР, лаборатории технической микробиологии Научно-производственного объединения «Витамины» (г. Москва) .

На защиту выносятся следующие положения:

1. Метод выделения и очистки ОГД-комплекса из надпочечников, состоящий из 7 стадий и позволяющий получать гомогенный препарат. Кроме того метод получения в изолированном виде входящих в состав этого комплекса ферментов оксоглутаратде-гидрогеназы и липоамиддегидрогеназы.

2. Оксоглутаратдегидрогеназный комплекс состоит из собственно оксоглутаратдегидрогеназы, липоатсукцинилтрансферазы и липоамиддегидрогеназы и обладает следующими общими свойствами: удельная активность высокоочищенных препаратов ОГДК относительно высокая и составляет 6−9 ед/мг — оптимальными для функционирования ОГДК in vitro условиями являются 25−50 мМ ионная сила буфера, рН равный 7,5- фермент обладает невысокой термостабильностью и в то же время криорезистентен и др .

3. Доказательство того, что кинетические параметры для оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из надпочечников соответствуют модели трехцентрового «пинг-понг» механизма, а его активность зависит от присутствия неорганического фосфата и ионов двухвалентных металлов.

4. Действие АДФ и НАДН на оксоглутаратдегидрогеназу и липоамидцегидрогеназу имеет аллостерическую природу, а взаимодействие указанных ферментов с субстратами и эффекторами носит кооперативный характер, причем такое взаимодействие может осуществляться лишь в определенных условиях.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ .

Одной из главных задач, стоящих перед нами, была разработка метода очистки ОГДК из коры надпочечников быка. Из-за имеющих место особенностей надпочечниковых ферментов оказалось необходимым на некоторых этапах изменить методы очистки, применяемые другими авторами. Были подобраны наиболее современные методические приемы, составившие следующие стадии: получение митохондриального экстракта, осаждение полиэтиленгликолем, фракционирование полиэтиленгликолем, ультрацентрифугирование через слой сахарозы, изоэлектрическое осаждение, гель-фильтрация через сефарозу 4 В или 2 В и концентрирование белка полиэти-ленгликолевым осаждением. Использование этих этапов очистки позволило отделить ОГДК от сопутствующего пируватдегидрогеназ-ного комплекса и получить препарат, гомогенный по данным электрофореза в ДДС-ПААГ. Удельная активность высокоочшценных препаратов ОГДК из надпочечников по величине близка к показателям удельной активности других комплексов. Коэффициент седиментации надпочечникового ОГДК (30 s) также близок по величине S2q w для комплексов из некоторых животных и бактериальных источников.

Высокоочищенный надпочечниковый комплекс, в отличие от ОГДК из грудной мышцы голубя, полнее укомплектован липоамидде-гидрогеназным компонентом. Полученные нами данные о субъединичном строении ОГДК из надпочечников свидетельствуют о том, что каждый из компонентов комплекса состоит из однотипных полипептидных цепей с молекулярным весом 110 000, 56 000 и 51 000 .

Препараты фермента из надпочечников отличаются криоре-зистентностью и высокой стабильностью при хранении в условиях температуры жидкого азота, но обладают относительно низкой термостабильностью. При изучении термоинактивации обнаружено, что альбумин и глицерин способствуют значительному повышению термостабильности фермента.

Найдены оптимальные условия функционирования надпочечни-кового оксоглутаратдегидрогеназного комплекса in vitro (рН, ионная сила буфера, присутствие ионов двухвалентных металлов).

Казалось бы, имея сложное строение, ОГДК должен быть подвержен процессам ассоциации-диссоциации, как это характерно для некоторых ферментных систем, в том числе и для ОГДК мышечной ткани (Северин, Гомазкова, Красовская, Стафеева, 1978). Однако, опыты с разведением растворов ОГДК свидетельствуют против возможности быстрой диссоциации комплекса из надпочечников с образованием молекул с разной удельной активностью. Эф-фекторное влияние ДЦФ и НДЦН, которое направлено на оксоглута-ратдегидрогеназу, сохраняется при различном разведении комплекса в мало изменяющейся степени, что указывает на то, что действие их не носит характер ассоциативно-диссоциативного механизма. Это, очевидно, связано с довольно прочной упаковкой отдельных компонентов комплекса в единое целое. На прочность упаковки ферментов комплекса указывает и сохранение полной активности ОГДК после неоднократного (до 10 раз и более) глубокого замораживания при — 19б°С с последующим оттаиванием. При помощи же замораживания-оттаивания мышечный комплекс удавалось «расшатать» так, что после можно было легко отделить от него липоамиддегидрогеназу (Северин, Гомазкова, 1981). Еще более лабильным является ОГДК из печени свиньи, который распадается на составные компоненты уже в процессе выделения (Татабэ, 1979).

Следует отметить существование различий в четвертичной структуре ОГД и БД из коры надпочечников. Пируватдегидроге-наза построена из двух типов субъединиц об (42 000) и J> (37 000) (Струмило, Сенкевич, Виноградов, 1980). Такое строение ПД связано со свойственным пируватдегидрогеназным комплексам способом регуляции активности первого компонента фосфорилированием-дефосфорилированием. По данным ряда авторов (Devis et al,, 1977, Yeaman et al., 1978, Sugdem et al., 1979) для ПДК из источников животного происхождения центры фосфорилирова-ния локализованы в оС-субъединице пируватдегидрогеназы. Подтверждением этого явилось включение метки с [ f-^Pj-АТФ в субъединицу пируватдегидрогеназы из надпочечников с молекулярным весом 42 000 (Струмило и др., 1981). Для ПД из E. coli, состоящей из идентичных полипептидных цепей (Reed, Oliver, 1968, Perham, Thomas, 1971), регуляция фосфорилированием-дефосфорилированием не характерна. Для ОГДК из тканей животных также не обнаружено этого способа регуляции активности. АТФ не оказывал ингибирующего действия на активность ОГДК из грудной мышцы голубя (Гомазкова, Красовская, 1979). В то же время АТФ ингибирует комплекс из надпочечников по смешанному типу в отношении КоА и конкурентному в отношении НАД4″. Кроме того, мы обнаружили, что АТФ понижает активность комплекса вследствие хелатирующих свойств в отношении, а также путем конкурентного противодействия АДФ.

Задача состояла в том, чтобы несмотря на прочность упаковки компонентов, получить в изолированном состоянии ОГД и ЛДГ из надпочечникового комплекса. Иногда в процессе выделения комплекса происходило отделение части ЛДГ. Но этот препарат липоамиддегидрогеназы не был гомогенным, так как электрофорез в ДДС-ПААГ показывал наличие многочисленных примесей, от которых трудно было избавиться. Поэтому более эффективным оказалось получение и первого и третьего компонентов путем разделения уже очищенного до гомогенного состояния комплекса. Было исследовано несколько способов разделения, применяемых для подобных целей другими авторами, и обнаружено, что полностью перенести их на комплекс из надпочечников, получив при этом чистые изолированные препараты, невозможно .

Термоинактивация не могла привести к ослаблению связей мелщу компонентами, не влияя на их активность. Использование папаина приводило к быстрой потере суммарной активности комплекса с сохранением базальной активности компонентов, но последующее фракционирование сульфатом аммония также не давало полного отделения оксоглутаратдегидрогеназы от липоамиддегидрогеназы. Поэтому использование хроматографии на геле фосфата кальция с целлюлозой помогло решить данную проблему, так как уже на этом этапе липоамиддегидрогеназа оставалась полностью связанной, а ОГД элюировалась с колонки в виде субкомплекса с ЛСГ, о чем свидетельствовали две белковые полосы при электрофорезе в отсутствие липоамидцегидрогеназной активности в таком препарате. При добавлении к субкомплексу изолированной ЛДГ происходило восстановление полной оксоглутаратдегидрогеназ-ной активности. Сам субкомплекс ОГД-ЛСТ расщепляли при помощи протеолиза папаином с последующим фракционированием сульфатом аммония. Данные электрофореза показали, что ОГД и ЛДГ, полученные описанным способом, представляли гомогенные препараты. ОГД-компонент не проявлял диафоразной активности в реакции с 2,6-ДХФИФ, что подтверждает отсутствие примеси в нем липоамидцегидрогеназы.

Исследование зависимости начальной скорости реакции, катализируемой оксоглутаратдегидрогеназным комплексом из коры надпочечников, от концентрации одного из субстратов при практическом насыщении двумя другими показало, что она соот^ ветствует кинетике МихаэлисаМентен в присутствии неорганического фосфата. Это дало возможность провести исследование общего кинетического механизма функционирования ОГДК. Результаты его свидетельствуют в пользу «пинг-понг» механизма. Отклонение от идеального варианта этого механизма при инги-бировании продуктами реакций происходят, вероятно, за счет сближения активных центров ЛДГ и ЛСТ в нативном ОГДК и не противоречат модели трехцентрового «пинг-понг» механизма .

Использование для проведения реакций более широких диапазонов концентраций субстратов и трис-HGI буфера дало возможность обнаружить некоторые особенности надпочечникового ок-соглутаратдегидрогеназного комплекса. Ингибирование НДДН в отношении НДД+ осуществляется комплексом не по конкурентному, а по смешанному типу. К тому же, в отличие от ПДК из надпочечников, НДДН влияет, как оказалось, не только на третий, но и на первый компонент. По данным ряда авторов (Hamada, Koike, Nakaula et al., 1975, Furuta, Shindo, Hashimoto, 1977) ИН-гибирующее влияние НДДН на ОГДК направлено только на липоамид-дегидрогеназу и конкурентно по отношению к НДД+. Смешанный характер ингибирования в присутствии НДДН наблюдался для комплексов из сердца свиньи (Smith, Bryla, Williamson, 1974) и грудной мышцы голубя (Гомазкова, Красовская, 1979). ДДФ, как положительный эффектор для первого компонента ОГДК из надпочечников, оказывает защитное действие в отношении ингибирования комплекса НДДН. Однако, он не снимает полностью тормозящего действия НДДН, что указывает о влиянии ингибитора и активатора на разные регуляторные центры комплекса .

Прямым доказательством влияния НАДН на оксоглутаратдегид-рогеназу явилось ингибирование реакции, катализируемой изолированным первым компонентом, не обладающим диафоразной актив.

1,2−14С.

— оксоглутарата ностью, а также декарбоксилирование без и в присутствии НДПН.

В отсутствие ионов фосфата обнаружена кооперативность в связывании 2-ОГ оксоглутаратдегидрогеназным комплексом. Ионы неорганического фосфата, двухвалентных металлов способствуют понижению Kjj по 2-оксоглутарату без изменения максимальной скорости реакции. Фн как и АДФ приводит к устранению кинетических признаков кооперативности взаимодействия ОГДК с субстратом. Двухвалентные катионы оказывают влияние именно на первый компонент комплекса .

Изучение кинетических свойств собственно оксоглутаратде-гидрогеназы показало соответствие их механизму «пинг-понг». В модельной реакции с 2,6-ДХФИФ влияние неорганического фосфата сказывалось сильнее, чем в полной реакции комплекса. При низких концентрациях 2-ОГ в среде с калий-фосфатным буфером активность оксоглутаратдегидрогеназы в три раза выше, чем в трис-HGI. Причем, происходило изменение максимальной скорости, в то время как в полной реакции комплекса Фн оказывал влияние лишь на величину Км для субстрата и трис-HGI буфер не препятствовал достижению максимальной активности. При низких концентрациях 2-ОГ отмечена положительная кооперативность в связывании его оксоглутаратдегидрогеназой. Определены кинетические константы ОГД-реакции для 2-ОГ и 2,6-ДХФИФ .

Было углубленно изучено эффекторное влияние АДФ, обнаруженное ранее в нашей лаборатории в отношении ОГДК (Струмило и др., 1980), на собственно оксоглутаратдегидрогеназу. Эффект ДДФ был выше в отсутствие ионов фосфата, которые сами стимулируют оксоглутаратдегидрогеназу при ненасыщении ее 2-оксоглутаратом. Негиперболический характер зависимости скорости реакции от концентрации ДДФ, высокие значения коэффициента Хилла указывают о имеющей место положительной кооперативное&tradeвзаимодействия ДДФ с ОГД. Это подтверждают и данные, полученные нами, о зависимости скорости реакции, катализируемой ОГДК и количества %-ДДФ, связавшегося с ОГДК, от концентрации ДДФ (Струмило, Таранда, Виноградов, 1983). В условиях низких концентраций субстрата в обоих случаях отмечается негиперболическая зависимость, которая с увеличением концентрации 2-ОГ меняется на гиперболическую. Такое изменение коо-перативности центров, связывающих эффектор, характерно и для других аллостерических ферментов (Курганов, 1978). Отмеченные признаки кооперативного взаимодействия ОГДК и ОГД, выделенных из надпочечников, с ДДФ в условиях низкой концентрации 2-оксоглутарата имеют вероятно существенный регуляторный смысл. Он заключается в наличии определенного диапазона концентраций ДДФ, при которых наблюдается высокая чувствительность оксо-глутаратдегидрогеназы к их колебаниям.

Аллостерическая природа действия ДДФ и НДДН на оксоглутаратдегидрогеназу доказана десенсибилизацией ее к этим эффекторам. При помощи 2,3-бутандиона, вызывающего модификацию аргининовых остатков, была проведена десенсибилизация ОГД к эффекторному действию ДДФ" которая доказала наличие в молекуле оксоглутаратдегидрогеназы аллостерического центра для ДДФ и то, что в формировании этого центра, также как и активного, принимают участие аргининовые остатки. Эти данные согласуются с результатами, полученными в отношении ОГД из грудной мышцы голубя (Стафеева, Гомазкова, Северин, 1980) .

Десенсибилизацией оксоглутаратдегидрогеназы с помощью ацетил-ацетона, при защите активного центра субстратом, показано наличие аллостерического центра в первом компоненте и для отрицательного эффектора — НАДН.

В регуляции активности ОГД-комплекса немалая роль принадлежит и третьему компоненту — липоамидцегидрогеназе. Исследовалось кинетическое поведение связанной с комплексом и изолированной ЛДГ?, как в прямой реакции, так и в обратной, а также ингибирование ее НАДН. Зависимость концентрации дигидролипоамида и 7? от [НАД" ^ в присутствии НАДН приобретает s-образный характер. Вогнутость линий в координатах Лай-нуивера-Берка указывает на кооперативность взаимодействия активных центров липоамиддегидрогеназы. Имеющиеся в литературе данные для ЛДГ из других источников также свидетельствуют в пользу такого способа регуляции активности третьего компонента. При исследовании дифференциальных спектров ЛДГ stein и Czerlinski (1967) наблюдали s-образные кривые титрования его НАД4″ и НАДН. На основании полученных сложных кривых титрования ЛДГ НАД4″ Visser, Voetberg, Veeger (1970) предположили существование двух активных и двух регуляторных центров на молекулу ЛДГ, способных связывать пиридиновые нуклеоти-ды. Методом флуоресцентного титрования Su и Wilson (1971) показали существование двух, отличающихся по сродству связывания НАД4″, групп центров. Два активных центра связывания пиридиновых нуклеотидов, обладающих низким сродством к НАД4*, и два регуляторных — с более высоким, были обнаружены Muiswinkel-Voetberg, Veeger (1973). Авторы предполагают взаимодействие каталитических центров липоамиддегидрогеназы. A Visser и Veeger (1975) по затуханию флуоресценции показали неэквивалентность двух флавиновых центров в. состоящей из двух субъединиц, молекуле липоамиддегидрогеназы. Tsai (l973) обнаружил для ДЦГ из почек быка негиперболические кривые насыщения ее НАД" 1″ и липоамидом, на основании чего он предположил гомотропные кооперативные взаимодействия активных центров. Отсутствие линейности в двойных обратных координатах, указывающее на аллостерическую природу ЛДГ, показано и в некоторых других работах (Tanaka et al., 1972, Perham, Veeger, 1974).

Для липоамиддегидрогеназы надпочечникового ОГДК S-образность зависимости от [НАД" 1] и^Лип (SH)gJ проявляется значительно слабее. На ее существование указывают лишь коэффициенты Хилла, которые для низких концентраций каждого субстрата превышают единицу, что указывает на наличие положительных кооперативных взаимодействий активных центров ЛДГ. Особенно заметно отклонение от гиперболической зависимости Цг от концентрации липоамида. И при низком и при высоком уровне второго субстрата — НАДН наблюдается отсутствие линейности графиков в двойных обратных координатах. При определенных концентрациях липоамида наблюдается проявление положительной гомотроп-ной кооперативности взаимодействия центров, связывающих его. Эта положительная кооперативность исчезает и появляется, только уже при более низких концентрациях субстрата, при изучении той же зависимости V от^{липоамидаJ} на липоамиддегидроге-назе, выделенной из состава надпочечникового комплекса. Возможно, дополнительные воздействия на ЛДГ в процессе расщепления комплекса привели к частичной потере чувствительности активных центров к гомотропным кооперативным эффектам. Снижение ингибирования активности изолированной липоамиддегидрогеназы НДДН свидетельствует о некоторой потере способности к гетеро-тропным кооперативным взаимодействиям между активным и алло-стерическим центрами. НДДН, являясь ингибитором прямой липоа-мидцегидрогеназной реакции, оказывает действие на ЛДГ как через активный, так и через аллостерические центры.

Так как кора надпочечников, в которой локализован ОГДК, является липофильной тканью, мы проверили возможность влияния на активность комплекса свободных жирных кислот. В отличие от ПДК из надпочечников (Струмило, Сенкевич, Виноградов, 1982) не обнаружено ингибирующего действия этих кислот (мири-стиновой, пальмитиновой и алеиновой) на оксоглутаратдегидро-геназный комплекс.

Обнаружено некоторое ингибирующее действие на активность ОГДК 5−10 мМ концентраций в реакционной среде пирувата, сукци-ната, цитрата, малата. Наиболее сильное действие оказывал ок-салоацетат.

Отмечено также, что в условиях выделения комплекса из митохондрий коры надпочечников не происходит потеря ОГД-ком-понентом ТДФ. При добавлении экзогенного кофермента не наблюдалось, за исключением единичного случая, увеличения активности оксоглутаратдегидрогеназы, характерного для ОГД из грудной мышцы голубя (Гомазкова, Стафеева, Лауфер, Северин, 1981) .

Фосфорные эфиры — тетрагидротиаминдифосфат и окситиамин-дифосфат оказывают ингибирующее влияние на активность высоко-очищенных ОГДК. Однако механизм их действия на активность комплекса остается пока невыясненным. Окситиамин, образующий антикофермент, может быть мощным ингибитором ОГДК из надпочечников in vivo. Об этом свидетельствуют полученные в лаборатории биохимии эндокринных желез данные (Струмило, Сен-кевич, Галицкий, Виноградов, 1983), где окситиамин ингибировал активность ОГДК надпочечников крысы в 4 — 5 раз. Изменение активности ОГДК было выражено сильнее, чем наблюдаемый сдвиг активности других митохондриальных и цитозольных ферментов. Уменьшение активности дегидрогеназ 2-оксокислот сопровождалось понижением концентрации П-оксикортикостероидов в плазме крови. Таким образом, полученные результаты с применением окситиамина подтверждают, что ОГДК и ГЩК с их сложными механизмами регуляа. ции могут быть чувствительными объектами воздействия на метаболизм и, следовательно на функцию коры надпочечников. Такое же действие окситиамина наблюдалось нами и на ОГД-комплекс надпочечников кролика.

Полученные в результате выполнения работы данные об оксо-глутаратдегидрогеназном комплексе, аллостерической регуляции его, кооперативных взаимодействиях с субстратом и эффекторами используются при чтении лекций по биохимии для студентов 2 курса Гродненского государственного медицинского института (акт внедрения, Гродненский государственный медицинский институт от б апреля 1984 г.). Высокоочищенный оксоглутаратдегидро-геназный комплекс из коры надпочечников используется в Институте биохимии АН Литовской ССР, где на его основе создан аналитический ферментный электрод для определения концентрации 2-оксоглутарата в растворах или биологических жидкостях (акт о внедрении от 19 марта 1984 г.), а липоамиддегидрогеназа, изолированная и в составе комплекса, используется в этом же институте для проведения углубленных исследований по сравнительному анализу механизма переноса электронов флавиновыми оксидоредуктазами (акт о внедрении, Институт биохимии АН Литовской GCP от 19 марта 1984 г.). Применение препаратов оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из надпочечников в лаборатории коферментов Отдела регуляции обмена веществ АН БССР позволило определить концентрацию кофермента, А и после дифференциальной экстракции уровни общего КоА, фракции кисло-торастворимого КоА и длинноцепочечных ацил-КоА в печени животных при различных экспериментальных условиях (акт об использовании ОГДК от 22 марта 1984 г.). Гомогенные препараты фермента переданы также в лабораторию технической микробиологии Научно-производственного объединения «Витамины» (г.Москва), где они используются для высокоспецифичного ферментативного определения содержания коэнзима, А в биологических объектах (акт о внедрении, НПО «Витамины» от 26 марта 1984 г.) .

1. Впервые выделен и очищен оксоглутаратдегидрогеназный комплекс из коры надпочечников быка. Разработан оригинальный метод очистки, включающий получение митохондриального экстракта, полиэтиленгликолевое осаждение и фракционирование, ультрацентрифугирование, изоэлектрическое осаждение, гель-фильтрацию через сефарозу 4 В и концентрирование белка полиэтиленгли-колем. Метод позволяет получать гомогенные препараты оксо-глутаратдегидрогеназного комплекса с удельной активностью 6−9 ед/мг и выходом около 14%, которые сохраняются в условиях температуры жидкого азота несколько лет без потери каталитической активности.

2. Высокоочшценный оксоглутаратдегидрогеназный комплекс из надпочечников состоит из субъединиц с относительной молекулярной массой I10000, 56 000 и 51 000 дальтон, соответствующих оксоглутаратдегидрогеназе, липоамиддегидрогеназе и липоатсук-цинилтрансферазе. Коэффициент седиментации оксоглутаратдегид-рогеназного комплекса — 30 s .

3. Зависимости начальной скорости реакций, катализируемых оксоглутаратдегидрогеназный комплексом, от концентрации 2-оксоглутарата, КоА и НАД+ в присутствии неорганического фосфата являются гиперболическими. Сукцинил-КоА ингибирует ОГДК по конкурентному типу в отношении КоА, а НАДН — по смешанному типу в отношении 2-оксоглутарата и НАД*, что объясняется его влиянием не только на третий, но и на первый компонент комплекса. Кинетические данные соответствуют модели трехцентрового «пинг-понг» механизма .

4. Ионы неорганического фосфата и двухвалентных металлов способствуют понижению Ку по 2-оксоглутарату, не изменяя максимальной скорости реакции. В отсутствие Фн при низких концентрациях субстрата имеются признаки кооперативного взаимодействия последнего с оксоглутаратдегидрогеназным комплексом. ДЦФ повышает кажущееся сродство фермента к субстрату и устраняет кооперативность.

5. Обработкой 2,5 М мочевиной и хроматографией на геле фосфата кальция оксоглутаратдегидрогеназный комплекс расщеплен на липоамидцегидрогеназу и субкомплекс оксоглутаратде-гидрогеназа-липоатсукцинилтрансфераза. Последний разделен с помощью лимитированного протеолиза папаином и сульфатаммонийного фракционирования на индивидуальные ферменты. t.

6. Реакция первого компонента с 2,6-дихлорфенолиндофенолом подчиняется кинетическому механизму типа «пинг-понг» при наличии признаков гомотропных кооперативных взаимодействий фермента с субстратом и акцептором электронов .

7. Путем обработки ацетил-ацетоном и 2,3-бутандионом осуществлена десенсибилизация оксоглутаратдегидрогеназы к ДЦФ, чем доказывается аллостерическая природа действия эффектора.

8. Для изолированной и входящей в состав ОГДК липоамиддегидрогеназы отмечен негиперболический характер кинетики прямой реакции в присутствии НДДН, который конкурентно ин-гибирует ее как в отношении НДД+, так и в отношении дигидролипоамида, а также выявлено наличие положительной и отрицательной кооперативности связывания субстратов .